Lately adipose tissue mesenchymal stem cells (hAMSCs) have emerged as cellular vehicles for therapy of solid tumors, due to their ease of isolation and manipulation, and wound/tumor homing capacity. HAMSCs have been successfully used in suicide gene therapy, employing the prodrug activating system based on Herpes simplex virus type I thymidine kinase (HSV-TK)/ganciclovir (GCV). In the current study we demonstrate an effective model of glioblastoma therapy based on the use of genetically modified hAMSCs and in vivo monitoring of tumor and therapeutic cells. Due to the capacity of photons to pass through living tissue, non-invasive monitoring by bioluminescence imaging has become a cutting edge technology for the study of ongoing biological processes in small lab animals. This technique uses photoproteins as cell reporters that generate light photons as byproducts of chemical reaction. Luciferases catalyze the oxidation of a substrate (luciferin) in the presence of ATP and oxygen to generate oxiluciferin, ADP and light photons. In spite of the apparent opacity of tissues, light can be detected at several millimeters of depth in live animals. Combination of several types of luciferases allows simultaneous monitoring of different cell populations proliferation or differentiation. We stably transduced hAMSCs for expression of Renilla luciferase, HSV-TK and red fluorescent protein, generating RLuc-R-TK-AMSC and U87MG human malignant glioma cells for expression of Firefly luciferase and green fluorescent protein, generating Pluc-G-U87 cells. SCID mice were stereotactically implanted in the brain first with Pluc-G-U87 and RLuc-R-TK-AMSC afterwards. Mice were subjected to GCV treatment and the therapeutic process was evaluated in real time. Tumor response was monitored in vivo by BLI. Therapeutic cell differentiation was assessed by labeling the above Renilla luciferase expressing hAMSCs with a Firefly luciferase reporter regulated by the CD31, endothelial specific promoter and in vivo monitorization. Endothelial lineage differentiation of hAMSC was impaired, by Notch1 shRNA, and therapeutic effect was assessed by BLI monitorization of tumor response. In our model of therapy, we show that tumor size can be continuously monitored by BLI and is significantly reduced (99,9% relative to control untreated tumours) by repeated inoculations in the tumours with thymidine kinase expressing hAMSCs followed by the prodrug ganciclovir. Moreover treatment resulted in a significant prolongation of survival time. In addition, the combination of BLI and confocal microscopy analysis of therapeutic cells suggests that efficient tumor eradication results from hAMSCs homing to tumor vessels, where they differentiate to endothelial cell lineage, intensifying their cytotoxic effect by destroying tumor vasculature and negating nutrient supply. Besides, hAMSCs endothelial differentiation inhibition resulted in an inefficient therapeutic effect compared to normal hAMSC (64% vs 6% respectively). Close association between hAMSCs and gliomas stem cells integrated in the tumor vascular system seems to be essential for an effective tumor reduction. We suggest that efficient tumor eradication is due to hAMSCs endothelial differentiation and tube location that intensifies its cytotoxic function, destroying tumor vasculature and inhibiting nutrient supply to tumor cells. Thus we propose adipose tissue hAMSCs as useful vehicles for clinical applications to deliver localized therapy to glioma surgical borders after tumor resection.

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La hipertensión portal es la principal complicación de la cirrosis. El factor primario en el desarrollo de hipertensión portal es el incremento de la resistencia vascular intrahepática (RVI) del hígado cirrótico. El denominado componente dinámico de la RVI es derivado de una exagerada presencia de agentes vasoconstrictores intrahepáticos, junto a una hiperrespuesta a éstos, además de una disminución en la disponibilidad de vasodilatadores y una hiporespuesta a los mismos. La presente tesis doctoral se dirigió a explorar nuevos mecanismos de regulación del tono vascular intrahepático en la cirrosis así como profundizar en el conocimiento de cuales son los mediadores vasoactivos implicados.Los resultados obtenidos nos muestran que: 1- Las células endoteliales sinusoidales (CES) de hígados cirróticos son capaces de generar prostanoides vasoconstrictores (TXA2) tanto a partir de la administración de ácido araquidónico así como al estimularlas con el agonista alfa-adrenérgico metoxamina. Además, los hígados cirróticos presentan un marcado aumento de la presión portal al administrarles AA, la cual sería derivada de un incremento en la síntesis de TXA2 y PGH2. Por último, se demuestra que los hígados cirróticos presentan un incremento en la actividad de la enzima productora de AA, la fosfolipasa A2.2- El complejo enzimático NADPH oxidasa no sería responsable del elevado estrés oxidativo hepático, la disfunción endotelial ni del aumentado tono vascular intrahepático del hígado cirrótico.3- Los hígados cirróticos presentan elevados niveles de estrés oxidativo (derivado de una elevada síntesis por parte de ciclooxigenasa y xantina oxidasa, además de una reducida eliminación por superóxido dismutasa) que se acompañan de una baja disponibilidad del vasodilatador óxido nítrico y de elevados niveles de nitrotirosinación proteica (marcador de la reacción entre radical superóxido y óxido nítrico). Por último, en células endoteliales sinusoidales se demuestra por primera vez que un aumento intracelular del estrés oxidativo conlleva una marcada reducción de la disponibilidad de óxido nítrico y que el uso de terapias antioxidantes previene la reducción de la disponibilidad de este vasodilatador.En conclusión, los estudios incluidos en esta tesis doctoral muestran que las CES juegan un importante papel en la modulación del tono vascular intrahepático en la cirrosis. No solo por una reducida producción de óxido nítrico sino también por un incremento en la síntesis de prostanoides vasoconstrictores. Asimismo, que el uso de antioxidantes, al eliminar el exceso de radicales libres de oxígeno, sería una nueva estrategia terapéutica para incrementar la biodisponibilidad de óxido nítrico intrahepático y reducir el tono vascular hepático en la cirrosis.

El cáncer de mama es una de las enfermedades más frecuentes entre las mujeres de los países desarrollados. La metástasis de los tumores es la principal causa de la muerte de un paciente con cáncer. Una de las maneras de abordar el estudio molecular y celular del proceso de desarrollo de las metástasis es la identificación de genes asociados al fenotipo metastásico.El método RAP-PCR (RNA arbitrarily primed PCR) consiste en dos reacciones consecutivas: una transcripción inversa del mRNA utilizando un cebador aleatorio y una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en que se emplea el mismo cebador más otro cualquiera. Con este método se pueden comparar simultáneamente fragmentos de DNA obtenidos aleatoriamente a partir del RNA de muchas variantes celulares con diferente capacidad metastásica. Si estos fragmentos, usados como sondas en análisis Northern, hibridan con RNA y se observan en cantidades relativas muy diferentes entre las distintas variantes celulares, se asume que los genes cuya expresión representan se expresan de manera muy diferente y pueden ser, por tanto, candidatos a influir en la aparición del fenotipo metastásico.En el presente trabajo, se ha empleado este método para el estudio de dos modelos experimentales de carcinoma de mama: uno de ratón (MXT) y otro humano (MDA MB-435). En ambos modelos existen variantes celulares con características invasivas y metastásicas bien diferenciadas.Los resultados obtenidos muestran que el método RAP-PCR permite detectar RNAs anónimos correspondientes a genes que se expresan diferencialmente en variantes de distinta capacidad metastásica, pero de acervo genético común.A partir de algunos de los fragmentos observados con expresión diferencial en los modelos tumorales MXT y MDA MB-435 (más de 50), se han identificado diversos genes. Los de mayor expresión en las variantes metastásicas fueron los correspondientes a enolasa, ESDN (endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like protein), S-adenosilhomocisteína hidrolasa, CHL1 (close homolog to L1CAM), Slmap (sarcolemmal-associated protein), eEF-1α (factor de elongación 1α), Nono (non-POU domain-containing octamer-binding protein), moesina, eplin (epithelial protein lost in neoplasm), ADAMTS1, y a la proteína hipotética FLJ10830.Los de menor expresión en las variantes metastásicas fueron los correspondientes a la cadena β de HLA-DP, la enzima E2 (variante 1) (ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1), y el gen denominado 7MXT en el presente trabajo.La función de estos genes puede adscribirse a alguna de estas categorías: metabolismo celular, regulación de la expresión génica, angiogénesis / diferenciación / invasión, proliferación celular; además, hay genes aún no identificados o de función todavía no conocida.El gen denominado 7MXT se encuentra en el cromosoma 11 del ratón, pero todavía no ha sido identificado. Su expresión está claramente disminuida en las variantes más metastásicas, pero se expresa en grado diverso en todos los órganos embrionarios de ratón en que se ha probado; la expresión más abudante corresponde al bazo y al corazón. En los ratones adultos sólo se ha detectado su expresión en el bazo y, sobre todo, en el ovario. La disminución de la expresión de ADAMTS1 hace aumentar la capacidad migratoria de las células tumorales B2 a través del colágeno IV (si bien no modifica la capacidad de adhesión de estas células a los distintos componentes de la matriz extracelular); además, aumenta el tiempo de latencia de crecimiento de los tumores primarios, pero no modifica la capacidad metastásica.Existe una conexión entre la aparición del fenotipo metastásico y la ausencia de expresión del gen de la cadena β de HLA, una proteína del MHC-II que no se había asociado previamente con la metástasis. Además, la expresión de CIITA (transactivador del MHC-II), determina la expresión de MHC-II en las variantes metastásicas. / Breast cancer is one of the most frequent malignancies in women from developed countries. Tumor metastasis is the main cause of death in cancer patients. A useful approach to study the molecular and cellular process of metastasis development is to identify genes related to metastatic phenotype.RAP-PCR (RNA arbitrarily primed PCR) method consists of two consecutive reactions: a reverse transcription of mRNA usin an arbitrary primer and a polymerase chain reaction (PCR) using the same primer and any other one. With this method random DNA fragments obtained from RNA from many cell variants of different metastasic ability can be simultaneusly compared. When these fragments -used as probes in Northern blots- hybridize to real RNA and they are observed in different relative ammounts between the cell variants, the genes whose expression they represent are assumed to be differentially expressed and can be considered as candidates to be involved in metastasic phenotype development.In the present work, this method was employed to study two experimental models of breast carcinoma: a murine one (MXT) and a human one (MDA MB-435). Both models include cell variants with different invasive and metastatic abilities.The results show that RAP-PCR method let us detect anonyme RNAs corresponding to genes differentially expressed in cell variants of different metastatic ability, but sharing a common genetic background.Several genes were identified that showed differnetial expression in tumor models MXT and MDA MB-435.Those with a higher expression in metastatic cell variants were: enolase, ESDN (endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like protein), S-adenosilhomocystein hydrolase, CHL1 (close homolog to L1CAM), Slmap (sarcolemmal-associated protein), eEF-1α (elongation factor 1α), Nono (non-POU domain-containing octamer-binding protein), moesin, eplin (epithelial protein lost in neoplasm), ADAMTS1, and hypothetic protein FLJ10830.Those with a lower expression in metastatic cell variants were: HLA-DP β−chain, E2 enzyme (variant 1) (ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1), and the gene here called 7MXT.The function of these genes can be abscribed to one of the following cathegories: cellular metabolism, gene expression regulation, angiogenesis/differentiatio/invasion, cellular proliferation. Furthermore, several genes had not yet been identified or had an unknown function.The so-called 7MXT gene is located in chromose 11 in mice, but has not yet been identified. Its expression is clearly diminished in highly metastatic cell variants, but all of the tested embrionary organs express it in variable degree, and above all spleen and heart. Expression in adult mice has only been demonstrated in spleen and especially ovary.The decrease in ADAMTS-1 expression increases the migratory ability of highly metastatic tumor cells MXT-B2 through collagen IV (though no difference in adhesion ability to several extracellular matrix elements is observed); furthermore, ADAMTS-1 decrease increases latency in the development of primary tumors, without modifying the metastatic ability.There is a relation between the metastatic phenotype and the loss of expression of HLA-DP β-chain gene -an MHC-II protein not previously associated to metastasis. Moreover, the expression of CIITA (an MHC-II transactivator) determines MHC-II expression in metastatic cell variants.

COMPLET DE LA TESI DOCTORAL:L´objectiu principal d´aquesta tesi ha estat l'estudi de la inestabilitat genòmica en el Limfoma de cèl·lules del mantell (MCL). En el primer treball s'han caracteritzat cinc línies cel·lulars derivades de MCL establint-se els patrons de inestabilitat mitjançant l'estudi de la variabilitat del nombre modal i la variabilitat estructural no-clonal. El segon treball s´ha centrat en la caracterització mitjançant CGH i microarrays d'expressió d'una sèrie llarga de 77 MCL descrivint gens que presenten un canvi en l'expressió en funció de les alteracions genètiques i determinat quines alteracions presenten valor pronòstic de forma independent de la proliferació. En el tercer treball s'ha valorat la presència de leucemització en MCL, la qual presentava una incidència no ben establerta fins al moment, i les possibles diferències a nivell genètic dels casos amb afectació leucèmica i el valor pronòstic d'aquests paràmetres. Finalment, en l'últim treball presentat en aquesta tesi, s'han estudiat les alteracions secundàries, tant numèriques com estructurals, d'una sèrie de MCL valorant les possibles translocacions recurrents a banda de la t(11;14)(q13;q32), els punts de trencament recurrents, els cromosomes més implicats en les translocacions i els patrons d'inestabilitat dels tumors primaris de MCL en comparació amb 10 línies cel·lulars derivades de MCL. L'estudi de les línies cel·lulars derivades de MCL ha permès caracteritzar un dels models més utilitzats en aquesta malaltia tant a nivell de les alteracions secundàries numèriques i estructurals com conèixer el grau d'inestabilitat d'aquestes línies cel·lulars, definint diferents patrons d'inestabilitat, i l'estat de diversos gens implicats en la patogènesi dels MCL com són TP53 o p16.Per altra banda, l'estudi d'una sèrie llarga de MCL ha definit millor les alteracions secundàries definint unes regions mínimes de guany i pèrdua. La correlació d'aquestes alteracions amb l'expressió, ha permès observar que gran part dels gens localitzats en aquestes regions de guany i pèrdua recurrents en MCL presenten variacions de la seva expressió en funció de l'alteració en aquells casos que la tenen i que alguns d'aquests gens estan involucrats en proliferació cel·lular, en reparació del dany al DNA i manteniment de l'estabilitat cromosòmica o bé en homeostasi cel·lular o apoptosi. Per altra banda, l'observació que els guanys de 3q27-qter i les pèrdues de 9q21-q32 estan associades a supervivència independentment de la proliferació, aporta un valor pronòstic afegit a la valoració de la proliferació que és el factor amb més associació a pitjor pronòstic.També s'ha pogut observar mitjançant un estudi amb citometria de flux que l'afectació leucèmica és present en quasi tots els pacients de MCL (92%). Per altra banda s'ha observat que no existeixen diferències a nivell d'alteracions genètiques ni pitjor pronòstic dels pacients amb afectació leucèmica. Però s'ha observat en l'estudi d'altres paràmetres clínics que en els pacients que presenten nivells de limfòcits ≥ 5x 109 s'observen més freqüentment guanys de 3q i pèrdues de 10p i un pitjor pronòstic.Finalment, l'estudi de la primera sèrie llarga de MCL mitjançant la combinació de diverses eines citogenetico-moleculars com CGH, FISH i M-FISH ha permès aprofundir en les alteracions secundàries dels MCLs, confirmant que no existeixen translocacions recurrents a banda de la t(11;14)(q13;q32), malgrat existeixen translocacions críptiques que impliquen els loci IGH i CCND1, i definint diferents nous punts de trencament recurrents. També hem pogut observar que els cromosomes més implicats en les translocacions, tant en línies cel·lulars com en tumors primaris, són els cromosomes 1 i 8. En resum, la present tesi aporta una informació molt valuosa de quines són les alteracions secundàries, tant numèriques com estructurals, específiques dels MCL i de les línies derivades de MCL realitzant una correlació entre aquestes i alguns paràmetres molt ben definits en MCL com la proliferació i la leucemització. / The aim of this thesis has been the study of the instability in Mantle Cell Lymphoma (MCL). In the first study we have characterized five MCL cell lines and we have stablished the patterns of instability of this cell lines calculating the modal number variability and the structural non-clonal variability.In the second study we have focus on the characterization using CGH and expression microarrays of a large series of MCL (77 cases) describing the genes that present changes in their expression depending on the alteration of the region where these genes are located and determining which alterations have prognostic value independently of the proliferation.In the third study we have evaluated the presence of leukemic involvement in MCL which has not been well stablished until known, and the possible differences at the genetic level of the cases with leukemic involvement and the prognostic value of this clinical paramether.Finally, in the last study presented in this thesis, we have studied the secondary alterations, numerical and structural, of a large series of MCL evaluating the possible recurrent translocations in addition to the t(11;14)(q13;q32), the recurrent breakpoints, the most involved chromosomes in translocations and the patterns of instability of these primary tumors in comparison with 10 MCL cell lines derived from MCL.

Les gestacions múltiples representen més d’un 1% del total de gestacions. Aquesta xifra ha augmentat les darreres dècades per diversos factors, però en especial per l’expansió de l’aplicació de les tècniques de reproducció assistida i per l’augment de l’edat materna. Atesa la seva repercussió fisiopatològica, la principal classificació de les gestacions múltiples es fa en base a la seva corionicitat. Aquest fet determina els principals riscos de complicacions durant la gestació; en especial, les que afecten les gestacions monocoriòniques, que poden presentar múltiples tipus de complicacions hemodinàmiques. Entre elles destaca la transfusió fetofetal (TFF), present en un 10-15% del casos. El seu tractament etiològic −l’ablació fetoscòpica amb làser de les anastomosis vasculars placentàries− és curatiu, presenta bons resultats a curt termini i un impacte a llarg termini pendent de determinar amb fermesa. Així, sorgeixen dues preguntes: És la corionicitat un factor de risc per a un pitjor creixement i un pitjor neurodesenvolupament? O solament ho és si apareixen complicacions durant la gestació? La present tesi té com a objectiu principal determinar l’evolució del creixement i del neurodesenvolupament a llarg termini d’una àmplia cohort de nens bessons (un total de 405 nens) repartits en tres grups, d’acord amb la seva corionicitat: bicoriònics (BC) (37.53%), monocoriònics sense complicacions (MC) (42.72%) i monocoriònics que patiren transfusió fetofetal (MC-TFF) (19.75%). Es descriuen àmpliament els resultats perinatals, de l’evolució durant el primer any de vida i de l’entorn socioeconòmic i s’estableix la seva relació amb el creixement, l’exploració neurològica reglada i el neurodesenvolupament als 12-15 mesos d’edat corregida, estudiat amb l’aplicació de l’escala de Bayley-II. Els principals resultats són els següents: • Els MC-TFF representen el grup amb més patologia perinatal, amb un 77.5% dels mateixos nascuts prematurament. Pràcticament tots els tipus de morbiditat neonatal són significativament més freqüents en aquest grup de bessons. En especial, la morbiditat neurològica neonatal és present en un 21.25% dels MC-TFF, mentre que només afecta un 4.62% dels MC i un 1.32% dels BC (p<0.001). Tanmateix, un cop tractada la TFF el creixement fetal no varia respecte els altres nens de la mateixa edat gestacional. • Respecte les variables de l’entorn socioeconòmic, en la nostra població d’estudi, el nivell d’estudis dels pares dels nens MC-TFF és significativament superior al dels pares dels nens dels altres dos grups, sense poder establir una explicació clara aquest fet. • Als 12-15 mesos, els MC-TFF mostren diferències estadísticament significatives respecte els altres dos grups de nens en els següents paràmetres: pes i perímetre cranial menors, exploració neurològica més freqüentment patològica i puntuacions dels índexs de desenvolupament mental i psicomotor de l’escala de Bayley més baixes. No es troben diferències en tots aquests paràmetres entre els BC i els MC. Mitjançant les anàlisis univariants, multivariants i de regressió logística s’estableix el paper de cada variable sobre els resultats principals. I les principals conclusions són les següents: • Els dos factors que influeixen més decisivament en el creixement als 12-15 mesos són la TFF i la presència de patologia neonatal. • La presència d’una exploració neurològica alterada i d’un retard en el neurodesenvolupament s’associen de forma independent a la TFF i a la presència de lesions cerebrals evidenciades durant el període neonatal. • La mort d’un dels dos bessons, al nostre estudi, no s’associa a un pitjor neurodesenvolupament. • La corionicitat per si mateixa, en absència de TFF i en cas d’igualtat de la resta de variables, no condiciona cap canvi en els resultats del creixement ni del neurodesenvolupament als 12-15 mesos. / Multiple gestations account for over 1% of the total number of gestations. Several factors have raised this figure over the last decades, especially the widespread use of assisted reproduction techniques and the higher maternal age. The most significant classification of multiple gestations is made according to its chorionicity, because of its physiopathologic impact. Chorionicity determines the main risks during pregnancy. Among them, the most important ones affect monochorionic gestations, susceptible to suffer from different types of haemodynamic complications. Twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) is the most relevant, present in 10-15% of monochorionic gestations. There is an etiological and curative treatment –fetoscopic laser ablation of placental vascular anastomoses− with good short-term results and a long-term outcome that has to be well ascertained. So two questions arise: Is chorionicity a risk factor for a worse growth and a worse neurodevelopment? Or is it like that only when there are complications during pregnancy? Current doctoral thesis has as its main objective to determine long-term growth and neurodevelopment of a large group of twins (405 infants), divided in three groups according to their chorionicity: dichorionic twins (DC) (37.53%), monochorionic twins without complications during gestation (MC) (42.72%) and monochorionic twins who suffered TTTS (MC-TTTS) (19.75%). Perinatal outcomes, first year of life findings and socioeconomic data are thoroughly described, as well as their relationship with growth, standardized neurological examination and neurodevelopment at 12-15 months of corrected age, the latter studied after performing the Bayley Scales of Infant Development-II. Main results are the following: • MC-TTTS is the group with the higher prevalence of almost all types of perinatal morbidity. 77.5% of them were born prematurely. Neonatal neurological morbidity is seen in 21.25% of MC-TTTS, whereas only affects 4.62% of MC and 1.32% of DC (p<0.001). However, once solved, TTTS twins have got the same fetal growth pattern than other kinds of twins. • In our study population, academic level of parents of MC-TTTS twins is significantly higher than the other two groups’ parents’ academic level. We don’t have an explanation to this finding. • At 12-15 months of corrected age, MC-TTTS twins show statistically significant differences with DC and MC twins in the next parameters: lower weight and head circumference, more often pathological neurological examination and worse performances in mental and psychomotor developmental indexes at Bayley scales. No differences in all these parameters between DC and MC twins are found. After univariate, multivariate and logistic regression analyses, the role of every variable over the main results is established. Main conclusions are the following: • Twin-to-twin transfusion syndrome and neonatal morbidity are the two most important factors decisively influencing the 12-15 month growth. • Suboptimal neurological examination and neurodevelopmental delay are independently associated to TTTS and neonatal brain damage. • In our study, single twin death is not associated to a worse neurodevelopment. • Chorionicity itself, if not complicated with TTTS and in case of parity of all the other variables, doesn’t imply any change in long-term outcomes, such as 12-15 month growth and neurodevelopment.

En la actualidad el trasplante de médula ósea es el tratamiento de elección para numerosas neoplasias hematológicas y para algunas inmunodeficiencias severas. La presencia de precursores y de células maduras de distintos linajes en el injerto resulta beneficiosa para luchar contra las infecciones post-transplante e incluso en la erradicación del tumor. La sangre de cordón umbilical se ha convertido en una fuente importante de células madre hematopoyéticas para su uso en el tratamiento de enfermedades hematológicas en adultos, debido a su disponibilidad, a que permite una mayor disparidad en la compatibilidad de HLA, y presenta una menor incidencia de enfermedad de injerto contra el huésped. Sin embargo, la mayor limitación para su uso en el trasplante de progenitores hematopoyéticos, es que presenta un bajo número de progenitores hematopoyéticos. Dada la relación entre cantidad de células madre infundidas y el éxito del procedimiento, es necesario el desarrollo de métodos para inducir la proliferación de estos progenitores. La expansión de células madre hematopoyéticas requiere un paso previo de identificación y purificación. Se ha visto que la caracterización fenotípica que se ha venido utilizando (Lin-CD34+), define una población heterogénea de progenitores hematopoyéticos. En este trabajo, utilizando los marcadores identificados en ratón, se caracterizó la población CD34+CD38-CD150+CD135- de sangre de cordón umbilical. Diferentes ensayos funcionales, demostraron que esta población está formada por progenitores multipotenciales, con capacidad de automantenimiento y de reconstitución del sistema hematopoyético. Esta población compartía las características que definen a las células madre hematopoyéticas y además presentaba una baja tasa de proliferación tanto in vitro como in vivo. Lo que sugiere que está formada por células en un estado quiescente. Para conseguir la expansión de progenitores, inicialmente se utilizaron diferentes combinaciones de citocinas (IL-6, SCF, TPO y FLT-3). Aunque con estos tratamientos se inducía una intensa proliferación, ésta se veía acompañada de diferenciación. Con el objetivo de reducir los procesos de diferenciación durante la expansión, se estudió el efecto del estroma, la activación de la vía de Notch y la adición de un modificador epigénetico, el ácido valproico. Se observó que el cultivo de progenitores hematopoyéticos con células estromales que inducen la activación de la vía de Notch, aumentaba la proliferación reduciendo la diferenciación. El ácido valproico inducía efectos similares a los anteriores activando la expresión de Hes1, mediante un mecanismo dependiente o independiente de la vía de Notch. Ambos estudios muestran como las señales externas del microambiente en el que se encuentran los progenitores hematopoyéticos, provocan la salida del estado de quiescencia, activando e induciendo su proliferación. / Over the last decade the use of umbilical cord blood as a source of hematopoietic stem cells (HSC) has increased due to its quick availability and because it allows the usage of mismatched donors, thus reducing the risk of graft versus host disease. However, one major limitation of umbilical cord blood as an HSC therapy is the low cell dose available for transplantation. Hematopoietic stem cells are defined by their capacity to self-renew and reconstitute the entire blood system of a transplanted recipient. In mouse, the use of cell surface markers has allowed an accurate HSC isolation by fluorescence activated cell sorting (FACS). However, human HSC population is still unestablished. It has been described that the combination of the well known Lin- LSK mouse HSC and the SLAM family markers can refine cell hierarchies within mouse HSC population. We have used CD150 and CD135 markers together with the classic CD34+CD38- population, to elucidate if these markers would also define a high enriched population of HSC with a high repopulating potential in humans. We have isolated the CD34+CD38-CD150+CD135- cord blood population and tested its hematopoietic stem cell potential. In vitro and in vivo assays have demonstrated that this population contains short and long-term HSC that can be differentiated into all blood lineages. We have demonstrated that these cells self-renew and reconstitute the hematopoietic system of a transplanted mouse. Moreover, we have observed that most of these cells remain in a quiescent state and they can be activated by culturing them on stromal cells with cytokines. One approach to overcome the obstacle of low cell dose observed in umbilical cord blood transplantation has been the attempt to expand HSC ex vivo. We have cultured hematopoietic stem cells on stromal cells that induce Notch pathway activation. We have also studied the effects of the addition of valproic acid, an epigenetic modifier, on HSC expansion. Hematopoietic stem cell culture on stromal cells that induce Notch pathway activation promote HSC proliferation thus reducing differentiation. Valproic acid treatment has similar effects to stromal culture and Notch activation on HSC. Moreover, VPA induces Hes1 expression by a Notch dependent or independent mechanism. Both studies conclude that hematopoietic stem cell quiescence can be reverted by environmental external signals. Thus activating and inducing proliferation on hematopoietic progenitors.

El primer estudio de esta tésis se centró en el estudio del funcionamiento ejecutivo en una muestra de Jugadores Patológicos (JP) mujeres y otra de Bulimia Nerviosa (BN) comparadas con otra de Controles Sanas (CS). Los resultados obtenidos fueron principalmente mujeres con Juego Patológico presentan déficits en el funcionamiento ejecutivo comparadas con Controles Sanas. Estos déficits, aunque guardan similitud con los de pacientes con BN, son mayores y afectan a una pobre formación de conceptos, más errores perseverativos y tendencia a una menor reducida inhibición de respuesta. El segundo estudio se centró en explorar que variables neurocognitivas y de personalidad podían predecir la respuesta a un tratamiento psicológico cognitivo-conductual (recaída o abandono). Los resultados fueron que las recaídas durante un tratamiento psicológico para el JP no se predecían mediante las variables neurocognitivas y de personalidad utilizadas. Sin embargo, las medidas de personalidad, como la impulsividad temeraria especialmente, y en menor grado, la búsqueda de sensaciones y una disciplina o reglamentación estrictas, se asociaron al riesgo de abandono. De las medidas neurocognitivas, la hipersensibilidad al castigo y una pobre memoria espacial eran las que se asociaban al abandono del tratamiento. El tercer estudio de esta tesis consistió en caracterizar los déficits en toma de decisiones de los JPs y explorar que variables neurocognitivas y de personalidad pueden predecir la toma de decisiones en las dos versiones de la Iowa Gambling Task (IGT) distinguiendo entre decisiones tomadas bajo ambigüedad y bajo riesgo. En cuanto a la caracterización de los déficits en la toma de decisiones, los resultados fueron que los JP muestran principalmente una insensibilidad a las consecuencias futuras de sus decisiones, caracterizada no sólo por una mayor hipersensibilidad a la recompensa, sino también por una hipersensibilidad al castigo. Los predictores neurocognitivos y de personalidad en la toma de decisiones del JP son diferentes según el tipo de decisión a tomar (bajo ambigüedad o bajo riesgo) y el patrón de refuerzo asociado. No se han encontrado que estos predictores influyan en la toma de decisiones bajo ambigüedad, pero sí en las tomadas bajo riesgo. Las decisiones bajo riesgo en la IGTABCD, se ven influidas por variables neurocognitivas y de personalidad. En concreto el aprendizaje y conocimiento explícito medio o alto, un bajo control de la interferencia y un comportamiento antinormativo y desorganizado, predecían un buen resultado en la IGTABCD. Las decisiones bajo riesgo en la IGTEFGH, se ven influidas sólo por variables de personalidad caracterizadas por una Impulsividad y Excitabilidad Exploratoria elevadas y una baja Extravagancia y Desorden. Así, encontramos un patrón diferencial en la participación de variables neurocognitivas y de personalidad en la toma de decisiones bajo riesgo, dependiendo de la sensibilidades a la recompensa y al castigo evaluadas por las versiones de la IGT. Este trabajo de tesis pone de manifiesto la importancia de la utilización de variables de personalidad y neurocognitivas en el estudio de la neuropatología del JP. Aporta, en primer lugar, unos hallazgos preliminares que muestran la alteración del funcionamiento ejecutivo en mujeres con JP, grupo escasamente estudiado. En segundo lugar, demuestra que hay variables neucognitivas y de personalidad que predicen el abandono pero no la recaída en la conducta del juego durante un tratamiento psicológico cognitivo-conductual. Por último, hallamos que una proporción importante de jugadores patológico muestran insensibilidad a las consecuencias futuras de sus decisiones y que hay un patrón diferencial en cuanto a la participación de variables neurocognitivas y de personalidad en la predicción de la toma de decisiones bajo riesgo en las dos versiones de la IGT. / In the first study we explore executive functioning in three groups of women diagnosed with pathological gambling (PG), Bulimia Nervosa (BN) and Healthy Controls (HC). PG have more executive deficits than BN and HC. Specifically, PG show poor concept formation, more perseverative errors and reduced response inhibition. These study analyze diferent neurocognitive and personality measures that could predict the response to a cognitive-behavioral treatment(CBT) (relapse or dropout) in PG. The results are that neurocognitive and personality measures don’t predict relapse. However, personality measures, especially rash impulsivity, and to a lesser degree, sensation seeking or strict and discipline reglamentation were associated with risk of dropout. Hypersensitivity to punishment and poor spatial memory were associated with dropout, too. The third study aims to characterize the PG deficits in decision making and explore neurocognitive and personality predictors of decision-making using two versions of the Iowa Gambling Task (IGT) and distinguishing between decisions made under ambiguity and risk. These versions asses hypersensitivity to reward (IGTABCD) and hypersensitivity to punishment (IGTEFGH). PG mainly show insensitivity to future consequences of their decisions, characterized not only by greater hypersensitivity to reward, but also by a hypersensitivity to punishment . Therewere no neurocognitive and personality predictors for decision-making under ambiguity in any IGT task. Decisions under risk in IGTABCD were predicted by medium or high learning and explicit knowledge, low response inhibition and antinormative and disorganized behavior. Decisions under risk in IGTEFGH were predicted only by personality measures; hight Impulsivity and Exploratory Excitability and low Extravagance and Disorderliness.

OBJETIVOS El objetivo principal de la tesis es determinar la efectividad de la ventilación no invasiva (VNI) e identificar factores pronósticos de fracaso en una cohorte general pediátrica. Los objetivos secundarios de la tesis son: 1. Estudiar si las cohortes establecidas según la clasificación cronológica presentan diferencias fisiológicas significativas anteriores al inicio de la VNI 2. Determinar la efectividad y los factores pronósticos de fracaso de la VNI de las tres cohortes (inicial, rescate y electiva) por separado 3. Evaluar la seguridad de la técnica, analizando su morbilidad y mortalidad asociadas MATERIAL Y MÉTODOS Diseño del estudio: Estudio de cohortes prospectivo realizado en UCIP del Hospital Sant Joan de Déu mediante muestreo consecutivo desde Enero 2005 - Diciembre 2009. Criterios de inclusión: • Pacientes de ambos sexos entre los 0-18 años con criterios de insuficiencia respiratoria aguda grave (IRA). Criterios de exclusión: • Pacientes con contraindicación para el uso de la VNI o con indicación paliativa. Variables a estudiar: Los datos de los pacientes fueron recogidas. Tipo de interfase, ventilador, modos (CPAP, BLPAP)y parámetros usados; variables fisiológicas (previo, 2ª hora, 8, 12 y 24 horas); el cociente SpO2/FiO2 (SF), fue calculado retrospectivamente, eliminándose valores con SatHb superior a 97; Tiempo de uso de la VNI, duración de la estancia en UCIP y hospital. Las complicaciones y mortalidad atribuibles a la VNI. El fracaso de la VNI se define como la necesidad de intubación. RESULTADOS En el análisis descriptivo de los 491 episodios, las variables demográficas definen una población diana para el uso de la VNI: Edad media de 36 a 46 meses, con predominio sexo masculino, sin enfermedad de base, la causa más frecuente de IRA es la INFECCIÓN RESPIRATORIA. Las complicaciones han sido poco frecuentes (5,5%). No hubo mortalidad asociada al uso de la VNI. En la cohorte general según el grupo de edad, se diferencian significativamente, mayores y menores de seis meses. El análisis multivariable las variables independientes halladas son edad, modalidad (CPAP/BLPAP), el tipo de fallo respiratorio tipo II, el menor valor de SF y menor descenso de la FC a las dos horas. En el análisis de las cohortes generadas según la clasificación cronológica se observan diferencias significativas en las variables fisiológicas y las necesidades de oxígeno previas al inicio de la VNI. En el análisis multivariable de la cohorte inicial se observa : Modalidad CPAP, valores bajos de SF y altos de FC a las 2 horas, la edad mayor a 6 meses , así como los valores más bajos de IPAP a las 2 horas son factores independientes de fracaso CONCLUSIONES Conclusiones principales 1. La ventilación no invasiva es una técnica efectiva para prevenir la intubación en Pediatria 2. Los factores pronósticos de fracaso en la cohorte general son: • Recibir tratamiento con CPAP en lugar de BLPAP • Tener un fallo respiratorio tipo II, un valor de SF a las 2 horas y un descenso de la FC menor yun valor de FC a las 2 horas mayor Conclusiones secundarias 1. Las cohortes generadas por la clasificación cronológica presentan diferencias significativas en las variables fisiológicas previas 2. La efectividad en la cohorte general aumenta con la edad 3. La efectividad y factores pronósticos en las cohortes inicial, rescate y electiva fue superior en la cohorte-r (84%) respecto cohorte-i (71%) y cohorte-e (77%). En la VNI inicial, son factores pronósticos de fracaso: • El valor más bajo de cociente SF, y el valor más alto de FC a las 2 horas • Pertenecer al grupo CPAP 4. La técnica es segura, siendo su morbilidad baja y muy leve, y la mortalidad asociada nula. / Objectives The primary objective of our study was to confirm safety and effectiveness of non-invasive ventilation (NIV) in children with acute respiratory failure (ARF). Our secondary objective was identify predictive factors of failure for NIV in children after describing and analyzing separately the characteristics of first-line or initial NIV, rescue and elective post-extubation NIV. Methods Patients and setting A prospective cohort study was carried out from January 2005 to December 2009 in a tertiary hospital PICU admitting patients from birth to 18 years of age. Consecutive sampling was conducted on all admitted patients who presented ARF and received NIV. Exclusion criteria were presence of any contraindications to NIV and NIV used as a palliative measure. Ethics Committee of Hospital Sant Joan de Deu approval was obtained. Data collected The patient’s data and clinical variables of NIV support for each episode were documented; type interface, ventilator and ventilation mode used (CPAP, BLPAP); settings and physiological variables prior to starting NIV, at 2, 8, 12 and 24 hours of NIV treatment; therefore, the SpO2/FiO2 ratio (SF) was also calculated retrospectively using the some intervals; appearance of complications or contraindications; mortality; NIV duration; NIV outcome (success/failure) and PICU and hospital stay. Failure of NIV was defined as the need for intubation. Results Descriptive study During the study period our PICU admitted 2238 patients, needing respiratory support. Out of this group, 491 episodes of NIV were collected. This gives us a study sample of 282 initial NIV episodes, Patients who received NIV after extubation were divided in rescue NIV 75, and elective NIV 134. Effectiveness was 71, 84 and 77% respectively. Effectiveness decreases with age, older 2 years (85%), 6months-2 years (75%), younger than 6 months (65%). Skin sores were the most common complication observed. No mortality was associated to NIV use. Multivariate analysis Independent predictive factors for NIV failure are: receiving CPAP instead of bilevel, showing respiratory failure type II, and having lower SF ratio value, greater Heart rate value and lower decrease of Heart rate at 2 hours. Conclusions Non-invasive ventilation is a safe and effective respiratory support for children with ARF.

A la tesi consta com a "Departament d’Anatomia Patològica, Microbiologia i Farmacologia" / Les alteracions de MYC tenen influència sobre la supervivència dels pacients amb DLBCL. En aquest estudi vam analitzar les alteracions genètiques i l’expressió proteica de MYC, BCL2, BCL6 i MALT1 en 219 DLBCLs. El reordenament de MYC com a única anomalia (MYC “single-hit”) es va observar en un 3% dels casos, el reordenament de MYC alhora que el de BCL2 i/o BCL6 (MYC “double/triple-hit”) en un 4%, les amplificacions de MYC en un 2% i els guanys en un 19% dels casos. MYC “single-hit”, MYC “double/triple-hit” i les amplificacions de MYC es van associar amb una pitjor supervivència global i progressió lliure de malaltia. Es va observar una correlació entre les alteracions genètiques i l’expressió proteica de MYC. L’expressió elevada de MYC es va associar amb un supervivència global més curta independentment de l’Index Pronòstic Internacional (IPI) o de l’expressió de BCL2. En conclusió, l’expressió proteica de MYC identifica un subtipus de DLBCL amb un pronòstic molt desfavorable independentment de les alteracions genètiques o d’altres paràmetres pronòstics. El limfoma plasmablàstic (PBL) és un limfoma agressiu que està caracteritzat per un fenotip de cèl•lula B amb diferenciació terminal. En aquest estudi, hem investigat les alteracions cromosòmiques dels gens MYC, BCL2, BCL6, MALT1, PAX5 i IGH en 42 PBLs. El reordenament de MYC es va identificar en 20 de 41 (49%) PBLs i els gens de les IGs varen ser les seves parelles en els reordenaments de la majoria de tumors. El reordenament de MYC va ser més comú en els casos Epstein-Barr (EBV) positius (14 de 19, 74%) que els tumors EBV negatius (9 de 21, 43%) (p<0.05). En cap PBL es van detectar reordenaments de BCL2, BCL6, MALT1 o PAX5 però guanys d’aquests gens es van observar entre un 31% a un 41% dels casos examinats. En conclusió, els PBLs estan genèticament caracteritzats per freqüents translocacions IG/MYC i guanys en múltiples regions cromosòmiques. L’activació oncogènica de MYC en aquests limfomes podria ser un important element patogenètic associat amb la infecció per EBV. El limfoma de cèl•lula gran B ALK positiu (ALK+ LBCL) és una neoplasia limfoide agressiva caracteritzada per un fenotipus plasmablàstic i que presenta reordenament del gen ALK. L’expressió de MYC està downregulada per BLIMP1, un dels més importants moduladors de la diferenciació de la cèl•lula plasmàtica. BLIMP1 i MYC estan sobreregulats per STAT3, un transductor de senyal activat per ALK. Per a determinar el paper de BLIMP1, MYC i STAT3 en la patogènesi dels ALK+ LBCLs, varem estudiar el reordenament i expressió de MYC, STAT3 fosforilat, BLIMP1, PAX5 i XBP1 en 12 ALK+LBCLs. Tots els casos expressaven ALK amb un patró citoplasmàtic i granular. Nou casos van presentar una senyal de trencament corresponent a un reordenament d’ALK. Tres casos addicionals varen presentar una deleció de l’extrem 5’ o 3’ de la sonda d’ALK associada amb una translocació críptica. PAX5 fou virtualment negatiu en tots els casos analitzats, mentre que BLIMP1 es va expressar en tots els tumors i XBP1 en 11 de 12. STAT3 fosforilat es va observar en tots els casos amb un patró d’expressió nuclear intens i difús. No es va identificar reordenament de MYC en cap tumor, però si que es van detectar augment de número de còpies. Es va observar expressió proteica de MYC en tots els tumors independentment de les alteracions genètiques de MYC. Aquests resultats indiquen que els ALK+ LBCLs tenen un programa de diferenciació plasmablastic complet però, contràriament al limfoma plasmablàstic, careixen de reordenament de MYC. STAT3 està constantment activat i podria ser un mecanisme alternatiu per a promoure l’expressió de MYC en aquests tumors. / MYC alterations influence the survival of patients with diffuse large B-cell lymphoma. We analyzed the genetic alterations and protein expression of MYC, BCL2, BCL6, and MALT1 in 219 cases of diffuse large B-cell lymphoma. MYC single-hit, MYC double/triple-hit and MYC amplifications, but not MYC gains or other gene rearrangements, were associated with unfavorable progression-free survival and overall survival. MYC protein expression captured the unfavorable prognosis of MYC translocations/amplifications and identified an additional subset of patients without gene alterations but with similar poor prognosis. Plasmablastic lymphoma (PBL) is an aggressive lymphoma characterized by a terminally differentiated B-cell phenotype. In this study, we have investigated the chromosomal alterations of MYC, BCL2, BCL6, MALT1, PAX5, and IGH locus in 42 PBL. PBL are genetically characterized by frequent IG/MYC translocations and gains in multiple chromosomal loci. The oncogenic activation of MYC in these lymphomas may be an important pathogenetic element associated with EBV infection. ALK-positive large B-cell lymphoma is an aggressive lymphoid neoplasm characterized by immunoblast-like cells expressing a plasmablastic phenotype and carrying ALK rearrangements. To determine the role of BLIMP1, MYC and STAT3 in the pathogenesis of ALK-positive large B-cell lymphomas, we investigated MYC rearrangement and the expression of MYC, phosphorylated STAT3, BLIMP1, PAX5 and XBP1 in 12 ALK-positive large B-cell lymphomas. All cases expressed ALK with a granular cytoplasmic pattern. PAX5 was virtually negative in all cases tested, whereas BLIMP1 was expressed in all tumors and XBP1 in 11 of 12. Phosphorylated STAT3 was observed in all cases. MYC rearrangements were not identified in any tumor, but MYC gains were detected in six cases. MYC protein was expressed in all tumors independently of MYC gene alterations. These results indicate that ALK-positive large B-cell lymphomas express a complete plasmablastic differentiation program but, contrary to plasmablastic lymphomas, do not have MYC rearrangements. STAT3 is constantly activated and may be an alternative mechanism to promote MYC expression in these tumors.