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Interação e clivagem de DNA por complexos de Co2+ com ligantes tripodais n-doadoresKreft, Gabriel Luiz January 2014 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Praduação em Química, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-05-19T04:05:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2014 / Muitos estudos têm sido realizados com o ácido desoxirribonucleico interagindo com pequenas moléculas, entre estas os compostos de coordenação que podem atuar como miméticos de enzimas presentes nos organismos vivos. Com essa finalidade, foram avaliados a clivagem e a interação do DNA com uma série de cinco compostos de Co2+ com ligantes N-doadores tetradentados: Co(TPA)Cl]ClO4, [Co(6-MeTPA)Cl]ClO4, [Co(6-Me2TPA)Cl]ClO4, [Co(BPQA)Cl]ClO4, e [Co(BQPA)Cl]ClO4. O DNA plasmidial pBSK II foi utilizado como modelo na técnica de eletroforese em gel de agarose. Foram realizados ensaios variando a concentração dos complexos para avaliar o efeito na atividade de clivagem, ensaios de cinética para comparar atividade com outros complexos da literatura, ensaios com inibidores de espécies reativas de oxigênio e ensaios com atmosfera de argônio com o intuito de verificar se o mecanismo de clivagem é hidrolítico ou oxidativo, ensaio com o ligante de sulco menor: distamicina e o ligante de sulco maior: verde de metila com o proposito de verificar a dependência da ligação com os sulcos e ensaios na presença de perclorato de lítio para verificar o efeito das interações eletrostáticas. Os cinco complexos são ativos frente a clivagem do DNA plasmidial, em concentrações na ordem de micromolar. Os complexos devem atuar por um mecanismo hidrolítico e são muito sensíveis ao efeito da força iônica. Nos ensaios cinéticos foram obtidos valores de kcat entre 0,98 h-1 a 6,02h-1, para pH 7,0 e valores de kcat entre 1,99 h-1 e 16,8 h-1 para pH 9,0, correspondendo a valores que aumentam a velocidade de reação na ordem de 108 a 109 comparados à hidrólise não catalisada do DNA. Também foram realizados ensaios com eletroforese com gel de poliacrilamida de alta resolução, como modelo utilizado foi uma sequência de 49 nucleotídeos. Foi verificado que os compostos [Co(6-MeTPA)Cl] e [Co(BPQA)Cl] clivam o DNA em todos os nucleotídeos formando produtos com terminal 3´-PO32-, sem gerar produtos típicos de mecanismos oxidativos.<br> / Abstract: Many studies have been conducted with the deoxyribonucleic acid interacting with small molecules, within them coordination compounds which may act as enzyme mimics in living organisms.For this purpose cleavage and interaction with DNA were evaluated for a series of five Co(II) compounds with tetradentate N-donor ligands: [Co(TPA)Cl]+, [Co(6-MeTPA)Cl]+, [Co(6-Me2TPA)Cl]+ [Co(BPQA)Cl]+ and [Co(BQPA)Cl]+. The plasmid DNA pBSK II was used as substrate in gel electrophoresis assays were performed varying the concentration of the complex, kinetic assays to assess DNA cleavage, trials with inhibitors of reactive oxygen species, trials with argon, assays with DNA groove binders and assays in the presence of lithium perchlorate to verify the effect of electrostatic interactions. The five complexes are active against the cleavage of plasmid DNA at concentrations on the order of micromolar.Complexes may act by a hydrolytic mechanism, are very sensitive to ionic strength effect. In kinetic experiments were obtained values of kcatbetween0,98 h-1to 6,02 h-1for pH 7.0 and values of kcat between 1,99 h-1to 16,8 h-1for pH9.0, corresponding to values that increase the reaction rate about108 to 109compared to spontaneous hydrolysis of DNA. Assays using high resolution polyacrylamide gel electrophoresis were made, the model used was a sequence of 49 nucleotides, it has been found that the compounds [Co (6-MeTPA) Cl] and [Co (BPQA) Cl] cleave DNA at all nucleotides forming products with 3'-PO32- termini without generating products of oxidative mechanism.
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Interação e clivagem de DNA por complexos binucleares de cobre (II) com ligantes contendo o grupo triazina e cadeias laterais funcionalizadasSaibert, Cristine January 2015 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-15T04:08:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2015 / O estudo de moléculas sintéticas ou biológicas que possam interagir e clivar o DNA de forma específica se faz essencial na busca por novas aplicações biotecnológicas, na descoberta de terapias antitumorais menos invasivas ou no auxílio a um melhor entendimento dos mecanismos de ação do DNA. O presente trabalho teve como objetivo investigar a interação e clivagem de DNA por três complexos binucleares de cobre, cuja síntese foi inspirada no sítio ativo da enzima catecol oxidase: [Cu2(2-X-4,6-bis(di-2-picolilamino)-1,3,5-triazina], onde X= cloro (1), butanodiamina (2) ou N-metilpirenilbutanodiamina (3), de modo a relacionar as alterações estruturais de 2 e 3 a possíveis ganhos na atividade em relação ao complexo 1. Complexos contendo centros binucleares de cobre são amplamente descritos na literatura como nucleases artificiais eficientes, dessa forma, a atividade catalítica dos complexos foi avaliada. Os complexos apresentaram bons resultados de clivagem de DNA plasmidial, sob condições brandas e tempos de reação moderados. As constantes catalíticas (kcat) apresentadas foram de 0,0611; 0,1526 e 0,1702 h-1 para 1, 2 e 3, respectivamente, indicando que a adição de butanodiamina e pireno está relacionado a um aumento na atividade dos complexos. Os valores de kM obtidos corroboram os valores de kcat observados e sugerem um aumento na afinidade DNA/complexo de 1 para 3, já que os valores decrescem conforme a relação 1 > 2 > 3. O mecanismo de clivagem parece ser de caráter misto, apesar de apresentar uma forte componente oxidativa, e ensaios com bloqueadores de sulco e de dicroísmo circular indicam que os três complexos têm preferência pelo sulco menor do DNA. Ensaios de clivagem direta de alta resolução, com sondas marcadas com fluoresceína (FAM), forneceram informações sobre o mecanismo de ação dos complexos no DNA e indicam que o complexo 2 é capaz de clivar de forma específica regiões do tipo hairpin.<br> / Abstract : The study of synthetic or biological molecules able to interact and cleave DNA in a specific way is essential in the search for new biotechnological applications, discovery of less invasive anti-tumor therapies or to help in the elucidation of the mechanisms of action toward DNA. The present work aimed to investigate the DNA interaction and cleavage by three copper(II) binuclear complexes, whose synthesis was inspired in the active site of the enzyme catechol oxidase: [Cu2(2-X-4,6-bis(di-2-picolylamino)-1,3,5-triazi ne], where X= chloro (1), diaminobutane (2) or N-methylpyrenyldiamino butane (3), trying to relate structural changes of 2 and 3 with possible activity gains in comparison to complex 1. Complexes containing a dinuclear center of copper are largely described as efficient synthetic nucleases in literature, thereby, the catalytic activity of the complexes was evaluated. The complexes showed good results for plasmid DNA cleavage under mild conditions and moderate time of reaction. The rate of cleavage reaction (kcat) was 0,0611; 0,1526 e 0,1702 h-1 for 1, 2 e 3, respectively, indicating that the addition of diaminobutane and pyrene shows activities gains for the complexes. kM values obtained corroborates kcat values observed and suggests an enhancement of complex/DNA affinities from 1 to 3, since the values decreases accordingly. The reaction mechanism seems to be have oxidative and hydrolytic features and assays with groove binder and circular dichroism indicate that all the complexes have preference for the minor groove of DNA. Assays of high resolution direct-cleavage with probes 5?-labeled with fluorescein (FAM) provides information about the mechanism of action by the complexes upon DNA and indicated that complex 2 is capable to cleave DNA in the vicinity of a hairpin structure.
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Nucleases sintéticasPich, Claus Tröger 24 October 2012 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T15:39:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1
276408.pdf: 6840510 bytes, checksum: ff3f4e86fa98eeff38d4272163bbdd2a (MD5) / Quatro séries de compostos metálicos foram analisadas com o objetivo de avaliar sua atividade de clivagem de DNA, de clivagem de proteína e biológica. Foram determinadas suas concentrações efetivas, pHs ótimos, formas de atuação, cinética de reação, especificidade de sítio de ação, capacidade de interação por estudos espectrofotométricos e atividade toxica e genotóxica em modelos diversos. Os compostos binucleares de cobre [Cu2( -OH)L2], miméticos de catecol-oxidases, demonstraram atividades de clivagem de DNA e de clivagem de proteína variadas dependentes da estrutura de seus ligantes. Estudos espectrofotométricos revelaram sua interação com DNA e proteína BSA além de citotoxiciade e genotoxicidade em todos os sistemas testados. Os compostos mono e binucleares de Ferro - Fe(HPClNOL) apresentaram atividade de clivagem de DNA e de clivagem de proteína bastante intensa estando entre os mais ativos compostos já descritos. Estudos espectrofotométricos revelaram sua interação com DNA e proteína BSA, mas também sua instabilidade em solução. Estudos de genotoxicidade e toxicidade demonstraram ambas as atividades para estes compostos. Os compostos binucleares de FeZnR (7, 8, 9 e 10) tiveram seus prováveis modos de ação e cinética de reação determinados bem como suas atividade sobre células bacterianas podendo em termos de eficiência serem classificados na seguinte ordem: 10 > 9 > 8 > 7. O composto 11, o qual não foi testado em presença de luz, demonstrou atividade de clivagem de DNA de grande eficiência de forma hidrolítica, mas ausência de atividade de clivagem de proteína e atividade antibacteriana não significante. Os compostos 12, 13 e 14, tiveram sua atividade testada em presença e ausência de luz e diferenças significativas foram encontradas. A presença de luz levou a uma maior atividade de clivagem de DNA e ao desenvolvimento de atividade de clivagem de proteína de todos os compostos. Estes, por não sofrerem inibição de atividadde por DMSO, agem provavelmente de maneira oxidativa livre da formação de radicais OH.
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A atividade de fotoclivagem do DNA de quatro novos complexos de cobre(II) sob luz UV e vermelhaSouza, Bernardo de 25 October 2012 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T12:43:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1
276700.pdf: 1996904 bytes, checksum: 633109f10aa6cc3b6b662dba76a6a2bd (MD5) / Neste trabalho foram sintetizados quatro novos complexos mononucleares de cobre(II). Os complexos foram caracterizados por vários métodos e a estrutura de um dos compleoxs foi resolvida por cristalografia de raios-X. A interação dos complexos com o DNA foi avaliada por titulação com o DNA Calf Thymus através de uma técnica espectroscópica e as constantes de interação Kb foram obtidas. A técnica revelou que nenhum complexo intercala no DNA, mas todos interagem suficientemente bem. A atividade de nuclease e fotonuclease dos complexos também foi avaliada através da clivagem de DNA plasmidial. Os complexos apresentaram uma boa atividade tanto quanto irradiados com luz UV como quando sob luz vermelha. Alguns estudos mecanísticos foram realizados para elucidar os mecanismos de clivagem. Partindo das estruturas de raios-X e das estruturas propostas para os complexos, calculou-se a estrutura eletrônica nos estado fundamental e "tripleto" para cada um. Com a correlação de propriedades teóricas com experimentais, propôs-se novas relações entre a atividade de fotonuclease dos complexos e as propriedades específicas destes estados eletrônicos.
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Interação e clivagem de DNA por novos complexos de cobre(II) derivados de tetraciclinas e 1,10-fenantrolinaBortolotto, Tiago 26 October 2012 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T01:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A interação e clivagem de DNA por pequenas moléculas atraí grande atenção por parte da biotecnologia e biologia molecular, pois oferece novas ferramentas para a manipulação de ácidos nucléicos. Com esse propósito, o presente trabalho teve como objetivo investigar a interação e a clivagem de DNA (ao abrigo de luz e sob luz UV-A) por dois novos complexos de cobre(II) derivados do antibiótico tetraciclina e doxiciclina e do ligante heterocíclico 1,10-fenantrolina. Ambos os complexos Cu(dox)(phen) e Cu(tc)(phen) mostraram-se capazes de clivar DNA plasmidial em condições brandas de pH e temperatura e em concentrações na escala de micromolar, tanto ao abrigo da luz como sob luz UV-A. Nestas condições observou-se que os complexos foram capazes de provocar o surgimento de quebras-simples e também quebras-duplas na estrutura do DNA, sendo que estatisticamente, as quebras-duplas devem ser oriundas de quebras-simples não aleatórias. O mecanismo de clivagem mostrou-se dependente da geração de Espécies Reativas de Oxigênio. Os ensaios com T4 DNA ligase mostram que o DNA linearizado pelos complexos não pode ser ligado pela enzima, sugerindo também que o processo de clivagem deva ocorrer por um mecanismo oxidativo. Do ponto de vista cinético, os complexos ao abrigo de luz clivam o DNA rapidamente, diminuindo o tempo de meia-vida do DNA para menos de 20 minutos, o que sob luz UV-A, é menor que 30 segundos. Isso representa um aumento de quase 40 vezes na atividade de clivagem quando na presença de luz UV-A. Ambos os complexos mostraram depender da interação com o sulco maior do DNA para que o processo de clivagem ocorra. A titulação espectrofotométrica reforçou esta hipótese, indicando também que a constante de ligação dos complexos com o DNA é relativamente alta, embora muito menor se comparada à do brometo de etídio. Os ensaios de desnaturação térmica de DNA revelaram que os complexos ligam-se ao ácido nucléico mudando seu perfil de desnaturação em escala semelhante a de agentes não-intercalantes de DNA. Por fim, a espectroscopia de dicroísmo circular mostrou que ambos os complexos modificam a estrutura secundária do DNA, principalmente no que diz respeito ao empilhamento de bases do DNA.
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Interação e clivagem de DNA por complexos metálicos de Cu(II) e Tb(III)Cavalett, Angélica January 2011 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O ácido desoxirribonucléico (DNA) é alvo constante de estudo nas áreas de bioquímica, biotecnologia e biologia molecular por sua importância biológica, por isso a busca por novas ferramentas para sua manipulação torna-se necessária. Com este objetivo foram estudadas a interação e clivagem de DNA por complexos metálicos de Cu(II), Cu(acac)dppz](ClO4), [Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O, [Cu(diaza)dpq](ClO4).H2O e Tb(III), [Tb(tdzp)(acac)3]. Para avaliar a capacidade de clivagem dos complexos foram realizados testes com diferentes concentrações destas moléculas e na presença e ausência de luz UV-A. O mecanismo de clivagem foi avaliado pelo aumento de força iônica, adição de sequestradores de radicais livres e ligantes do sulco maior e menor do DNA às reações. Testes na presença e ausência de oxigênio também foram realizados. Os ensaios cinéticos ocorreram no abrigo e na presença de luz UV-A. Os complexos de Cu(II) foram avaliados quanto à sua interação ao CT-DNA, para tanto foram realizadas titulações espectrofotométricas do complexo na presença e ausência de CT-DNA, desnaturação térmica de CT-DNA na ausência e presença dos complexos e avaliação de alterações na estrutura do DNA na presença dos complexos por espectroscopia de dicroísmo circular. Os quatro complexos foram capazes de clivar o DNA plasmidial em concentrações micromolares em cinco minutos de reação quando fotoativados por luz UV-A. O aumento de força iônica reduziu a atividade dos complexos e o mecanismo de clivagem ocorre pela formação de espécies reativas de oxigênio e carbono-centrados. Os ensaios cinéticos revelaram tempos de meia-vida do DNA abaixo dos cinco minutos quando as reações foram fotoativadas. Os complexos de Cu(II) com ligantes dppz forneceram Kb de ~105 M-1 e o Kb para o complexo de Cu(II) com ligante dpq foi de ~104 M-1. Os três complexos de Cu(II) promoveram aumento da Tm do DNA e alterações na estrutura do CT-DNA foram observadas pelos espectros de dicroísmo circular
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Efeito da alteração na segunda esfera de coordenação de complexos binucleares de Fe'''Zn'' e Fe"'Cu" como modulador da atividade de clivagem e interação com DNAGabriel, Philipe January 2016 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:18:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1
345481.pdf: 2659215 bytes, checksum: 3532ce8d584472564762a6d842dbec9a (MD5)
Previous issue date: 2016 / O desenvolvimento de novas moléculas que auxiliam a manipulação de ácidos nucleicos é um tema que vem sendo alvo de grandes estudos nas áreas de bioquímica, biologia molecular, biotecnologia e química bioinorgânica, onde se buscam complexos que apresentam interação e/ou clivagem de ácidos nucleicos. Nestas áreas busca-se cada vez mais um modo de aprimoramento e incremento da seletividade destes complexos por regiões específicas do DNA. Dentro deste contexto, neste trabalho foram avaliados os potenciais de interação e clivagem de DNA através de 5 complexos binucleares biomiméticos derivados de fosfatases ácida púrpura, tomando como base o complexo FeZn-L0 e adicionando cadeias carbônicas de diferentes tamanhos com diaminas, como um modo de mimetizar a segunda esfera de coordenação da enzima. Todos os cinco complexos foram capazes de clivar o DNA plasmdial de um modo concentração-dependente. A variação do pH alterou significativamente a atividade destes complexos, o que indicou um mecanismo de clivagem semelhante àquele sugerido para a hidrólise do substrato modelo 2,4-BDNPP. Todos os complexos tiveram sua atividade inibida quando adicionado à reação concentrações crescentes dos sais NaCl e LiClO4, indicando que a neutralização das cargas do DNA pelos íons Na+ afeta diretamente o processo de catálise. Nenhum dos sequestradores de espécies reativas de oxigênio utilizados neste trabalho foram capazes de alterar a clivagem do DNA pelos complexos, sugerindo um mecanismo de atividade sem a participação de oxigênio, fato confirmado posteriormente pelo ensaio de clivagem na ausência de oxigênio em atmosfera de argônio. Foi possível perceber ainda que os complexos que apresentam as maiores cadeias carbônicas possuem uma preferência de interação com DNA através do sulco maior, sendo que o complexo que possui a menor cadeia carbônica não apresentou especificidade por ambos os sulcos, porém necessitou acessar o DNA por um destes. O complexo que não possui cadeia carbônica, por sua vez, apresentou uma preferência de interação ao DNA através do sulco menor. As constantes cinéticas encontradas neste trabalho mostraram que a inserção destas cadeias carbônicas ao complexo aumentou em até 5.5 vezes a eficiência catalítica dos mesmos. O ensaio de dicroísmo circular demonstrou que todos os complexos estudados foram capazes de alterar a estrutura secundária do DNA, diminuindo sua helicidade e o empilhamento de bases, fenômeno encontrado na literatura por moléculas que são capazes de acessar o DNA através dos sulcos maior ou menor. Por fim, ensaios de interação dos complexos com oligonucleotídeos demonstraram através da técnica de footprinting que os complexos são capazes de interagir com esta molécula e dificultar a clivagem do DNA pelo Fe-EDTA, principalmente em locais onde predominam bases pirimídicas, sugerindo uma especificidade destes complexos por estas regiões. De modo geral, a inserção de cadeias carbônicas como um modo de mimetizar uma segunda esfera de coordenação nestes complexos é uma estratégia viável para potencializar a atividade destas moléculas artificiais quanto a interação e clivagem de DNA.<br> / Abstract : The development of new molecules that aid in the handling of nucleic acids has been the subject of many studies in the fields of biochemistry, molecular biology, biotechnology and bioinorganic chemistry, searching for complexes that are capable of interacting and/or cleaving these molecules. These studiesfocus on the increase and enhancement selectivity of complexesto specific regions of DNA. In this context, this study evaluated the potential of interaction and cleavage of DNA by 5 biomimetic binuclear complexes derived from acid purple phosphatases, where,based on FeZn-L0 complex,carbon chains ofdifferent sizes containing diamines were added, in order to mimic the second coordination sphere of the model enzyme. All five compounds were able to cleave plasmid DNA in a concentration-dependent manner. Variations of pH changed significantly the activity of these complexes, which indicated a similar cleavage mechanism to the one suggested for the hydrolysis of the model substrate 2,4-BDNPP. All complexes had their activity inhibited by the additionof increasing concentrations of NaCl and LiClO4 saltsto the reaction, indicating that neutralization of DNA charges by Na + ions directly affects the catalysis process. None of the scavengers of reactive oxygen species used in this study were able to change the cleavage of DNA, suggesting activity reaction mechanism without the participation of oxygen, a fact later confirmed by the cleavage assay in the absence of oxygen.It was perceived that the complexes having longer carbon chains had a preferably interaction to DNA through the major groove.The complex with smaller carbon chain displayedno specificity for both grooves, but still required access to the grooves to bind with DNA. The kinetic constants found in this study indicated that the inclusion of these carbon chains tothe complex increased by up to 5.5 times the catalytic efficiency of the complexes.The circular dichroism assay demonstrated that all studied complexes were able to alter the secondary structure of DNA, by reducing its helicity and base stacking, a phenomenon found in the literature on molecules that are able to access the DNA through major or minor grooves. Lastly, interaction assays between complex and oligonucleotides,evaluated by ahydroxyl radical footprinting technique, showed that the complexes are capable of interacting and hinder cleavage of DNA by Fe-EDTA generated hydroxyl radicals, particularly in regions rich in pyrimidine bases, suggesting a specificity of these complexes tothese regions. In general, the inclusion of carbon chains as a way to mimic the second coordination sphere in these complexes is a viable strategy to potentiate the activity of these artificial molecules tointeract and cleave DNA.
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Interação e clivagem de DNA por novos complexos mononucleares de Cu(II) e binucleares de Fe(III)Zn(II)Bortolotto, Tiago January 2015 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-08T04:07:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1
334170.pdf: 3585630 bytes, checksum: b2b922d427eb4f74499842076e23a655 (MD5)
Previous issue date: 2015 / O desenvolvimento de novas moléculas e/ou novas metodologias para clivagem de DNA é um tema de crescente investimento nos últimos anos, seja na descoberta de novas ferramentas para biologia molecular ou de protótipos para fármacos antitumorais. Neste trabalho procurou-se determinar a interação e clivagem de DNA por novos complexos ternários de cobre(II) e que possuem atividade antitumoral frente a uma linhagem de células leucêmicas, com o intuito de determinar se sua atividade citotóxica está relacionada à capacidade de fragmentar DNA. Além disso, estudos da atividade de fotoclivagem de DNA (sob luz UV) foram realizados visando o seu potencial uso em terapia fotodinâmica. Paralelamente, uma potencial estratégia para o aumento da atividade de clivagem de DNA por complexos de Fe(III)Zn(II) foi caracterizada como forma prática para potencializar a atividade de agentes sintéticos que reconhecidamente clivam DNA. Os quatro novos complexos de cobre são: [Cu(hyd)(bpy)]2+ (Cu(hyd)(bpy), [Cu(hyd)(phen)]2+ (Cu(hyd)(phen), [Cu(S-hyd)(bpy)]2+ (Cu(S-hyd)(bpy) e [Cu(S-hyd)(phen)]2+ (Cu(S-hyd)(phen)), em que: hyd e S-hyd são a hidrazida do ácido 2-furóico e do ácido 2-tiofenocarboxílico e bpy e phen são os ligantes heterocíclicos 2,2?-bipiridina e 1,10-fenantrolina, respectivamente. Todos os quatro complexos foram capazes de clivar o DNA plasmidial de modo concentração-dependente e com diferentes eficiências. Alterações no pH não influenciaram na atividade dos complexos e sua atividade é proveniente da natureza química do complexo: ligante-metal-ligante. Interações eletrostáticas e ligação por sulco mostraram-se ser necessárias para o processo de clivagem de DNA que sugere-se ser predominantemente oxidativo. Os ensaios cinéticos confirmaram a ordem de reatividade dos complexos Cu(hyd)(bpy) << Cu(hyd)(phen) ~ Cu(S-hyd)(bpy) < Cu(S-hyd)(phen) que segue a ordem de afinidade pelo DNA e indicam que os últimos três complexos são tão ou mais reativos do que os melhores exemplos encontrados na literatura. A velocidade da reação e a capacidade de provocar a morte celular em células tumorais apresentou uma excelente correlação, sugerindo que a atividade antitumoral destas moléculas pode ser proveniente da atividade de clivagem de DNA. Em condições de fotoclivagem, porém, a ordem de reatividade foi: Cu(S-hyd)(bpy) < Cu(S-hyd)(phen) < Cu(hyd)(bpy) < Cu(hyd)(phen). Quando observada a razão entre a velocidade de fotoclivagem com a clivagem de DNA, vemos que incremento variou de aproximadamente 6 para 146 vezes. Sob condições de fotoclivagem, não houve mudanças no mecanismo de clivagem de DNA, sugerindo que a exposição à luz UV deve amplificar atividade oxidativa dos complexos frente ao DNA. Ensaios de clivagem com oligonucleotídeos mostraram que todos os complexos foram capazes de fragmentá-lo de modo não específico, ou seja, com eventos de corte ao longo de toda a molécula de DNA. Os complexos com ligante phen mostraram os melhores resultados: ficou evidenciada a formação de fragmentos contendo terminais 3?-fosfoglicolato, cuja formação deve-se a processos oxidativos, reforçando a hipótese que estes complexos clivam o DNA pela geração de ROS. Os ensaios de interação por dicroísmo circular sugerem que o comportamento de ligação dos complexos ao DNA deva ser do tipo não-intercalativo. De modo geral, os quatro complexos de Cu(II) aqui testados mostram-se promissores modelos para desenvolvimento de novos complexos com atividade antitumoral ligada à clivagem de DNA. Além disso, mais uma vez o uso de exposição a luz UV mostrou-se apto para aumentar a atividade dos complexos, o que traz à discussão um possível uso como protótipo a droga para Terapia Fotodinâmica. Os complexos de Fe(III)Zn(II) estudados; [FeIII-(µ-OH)ZnIILP1] (FeZnLP1) e [FeIII-(µ-OH)ZnIILP2] (FeZnLP1) são derivados pireno-substituídos do complexo [FeIII-(µ-OH)ZnIILH] (FeZnOH). Ambos os complexos foram capazes de clivar o DNA plasmidial gerando não só quebras-simples, bem como quebras-duplas, efeito não observado para o complexo FeZnOH. A variação do pH afeta fortemente a atividade de ambos os complexos e concorda com a hidrólise do éster de fosfato 2,4-BDNPP, sugerindo que o mesmo mecanismo de hidrólise do éster modelo pode ser aplicado ao DNA. Todos os complexos tiveram sua atividade fortemente inibida pela adição crescente de NaCl ou NaClO4 sugerindo a participação de interações eletrostáticas entre os complexos e o DNA. Nenhum sequestrador de ROS foi capaz de inibir a atividade dos complexos, sugerindo um mecanismo predominantemente hidrolítico o que já havia sido visto com o complexo FeZnOH. Ambos os complexos apresentaram preferência pela interação com o sulco menor, o que também foi observado nos ensaios com dicroísmo circular. Os ensaios cinéticos revelaram que a introdução de um único grupo pireno levou ao aumento de mais de 11,3 vezes na atividade deste complexo em comparação ao complexo modelo. Já a adição de dois grupos pireno aumentou ainda mais esta atividade atingindo um incremento de 18,6 vezes. Quando se compara os complexos FeZnLP1 e FeZnLP2 entre si, vemos um aumento de 1,65 vezes na atividade de FeZnLP2 vs FeZnLP1, ou seja, corroborando os resultados anteriores que apontavam FeZnLP2 como mais reativo que FeZnLP1. Nenhum dos complexos mostrou-se apto a clivar o oligonucleotídeo de 49-mer, mas ensaios de Footprinting por DNAse I revelaram que os complexos tendem a ligar mais fortemente em regiões contendo sequências AT, sendo sugerido que quanto maior o volume que o complexo ocupa no espaço, maior é a extensão da interação. De modo geral, o incremento substancial da atividade dos complexos pireno modificados ratifica a hipótese de que a introdução de grupos que se ligam ao DNA é uma viável estratégia para potencializar a ação de agentes artificiais de clivagem de DNA.<br> / Abstract : The development of new molecules and/or new strategies for DNA cleavage is an increasing investment issue in recent years for the discovery of new molecular biology tools or prototypes for antitumor drugs. In this study aimed to determine the DNA interaction and cleavage by new ternary complexes of copper(II) which have anti-tumor activity against a strain of leukemia cells in order to determine whether their cytotoxic activity is related to the ability to fragment DNA. In addition, DNA photocleavage studies (under UV light) were conducted to analyze their potential use in photodynamic therapy. Meanwhile, a potential strategy to increase the DNA cleavage activity of Fe(III)Zn(II) complexes was characterized as a practical way to enhance the activity of synthetic agents that are known to cleave DNA. The four new copper complexes are [Cu(hyd)(bpy)]2+ (Cu(hyd)(bpy), [Cu(hyd)(phen)]2+ (Cu(hyd)(phen), [Cu(S-hyd)(bpy)]2+ (Cu(S-hyd)(bpy) e [Cu(S-hyd)(phen)]2+ (Cu(S-hyd)(phen)) where: S-hyd and hyd are hydrazides from 2-furoic acid and 2-thiophenecarboxylic acid and bpy and phen are the heterocyclic ligands 2,2'-bipyridine and 1,10-phenanthroline, respectively. All four complexes were able to cleave the plasmid DNA in a concentration-dependent manner with different efficiencies. Changes in pH did not influence the activity of the complex and its activity should be derived from the chemical nature of the complex formation: ligand-metal-ligand. Electrostatic interactions and groove binding shown to be required for the DNA cleavage which, is suggested, be predominantly oxidative. The kinetic experiments confirmed the reactivity order of the complex Cu(hyd)(bpy) << Cu(hyd)(phen) ~ Cu(S-hyd)(bpy) < Cu(S-hyd)(phen) which follow the order of DNA affinity, indicating that the last three complexes are among the most reactive examples found in the literature. The speed of reaction and the ability to trigger cell death in tumor cells showed an excellent correlation suggesting that the antitumour activity of these molecules can be derived from the DNA cleavage activity. In photocleavage conditions, however, the reactivity order was: Cu(S-hyd)(bpy) < Cu(S-hyd)(phen) < Cu(hyd)(bpy) < Cu (hyd)(phen). The ratio of the observed rates of DNA photocleavage by DNA cleavage ranged from about 6 to 146-fold. Under conditions of photocleavage, no changes in DNA cleavage mechanism were found; suggesting that exposure to UV light should amplify the oxidative activity of the complexes towards DNA. Oligonucleotide cleavage assays revealed that all the complexes were able to fragment the DNA in a non-specific way, with scission events throughout the DNA molecule. Complexes containing phen ligand showed the best results was evidenced the formation of fragments containing terminal 3'-phosphoglycolate, whose formation is related to oxidative processes, reinforcing the hypothesis that these complexes cleaves the DNA for the generation of ROS. Circular Dichroism assays suggest that the DNA binding behavior of theses complexes must proceed as a non-intercalative way. In general, the tested four Cu(II) complexes showed as promise for development of new models complexes with antitumor activity linked to DNA cleavage. In addition, the use of UV light exposure was shown to be able to increase the activity of the complex, which moots a possible use as a prototype drug for Photodynamic Therapy. The studied Fe(III)Zn(II) complexes [FeIII-(µ-OH)ZnIILP1] (FeZnLP1) and [FeIII-(µ-OH)ZnIILP2] (FeZnLP1) are pyrene derivatives from [FeIII-(µ-OH)ZnIILH] complex (FeZnOH). Both complexes were able to cleave the plasmid DNA generating not only single- but also double-strand breaks, which were not observed for the FeZnOH complex. The pH variation strongly affects the activity of both complex and agrees with the hydrolysis of 2,4-BDNPP phosphate ester, suggesting that the same mechanism hydrolysis of the ester model can be applied to DNA. Both complexes had their activity strongly inhibited by the increasing addition of NaCl or NaClO4 suggesting the participation of electrostatic interactions between the complex and the DNA. None of ROS inhibitors were able to inhibit the activity of the complex, suggesting a predominantly hydrolytic mechanism which had already been seen with the FeZnOH complex. Both complexes have preference for interaction with the DNA minor groove, which was also observed in Circular Dichroism assays. Kinetic studies showed that introduction of a single pyrene group led to an increase of 11.3-fold compared to FeZnOH. Besides, the addition of two pyrene groups further increased this activity 18.6-fold. When comparing the FeZnLP1 to FeZnLP2 an increase of 1.65-fold was observed, confirming the previous results which showed that FeZnLP2 is more reactive than FeZnLP1. None of the complexes were able to cleave a short oligonucleotide, but DNAse footprinting assays revealed that the complexes tend to bind preferentially (and more affinity) to AT-rich regions and suggested that as much larger was the complex (in terms of volume), the greater is the extent of the interaction. In general, the substantial increase in activity of the modified pyrene complexes exemplifies the hypothesis that the introduction of groups that bind to DNA is a viable strategy to enhance the action of artificial DNA cleaving agents.
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Atividade de complexos metálicos sobre biomoléculasFischer, Franciele Luane 16 July 2013 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-graduação em Química, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2013-07-16T03:59:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1
278499.pdf: 3989998 bytes, checksum: 3195e5605172a4c94adc9a9065aa308b (MD5) / Nucleases e proteases são enzimas da classe das hidrolases. As primeiras são capazes de clivar ligações fosfodiéster na molécula de DNA. As proteases, por sua vez, atuam na hidrólise de ligações peptídicas nas proteínas. Em função disso, essas enzimas têm inúmeras aplicações, principalmente, em processos bioquímicos e biotecnológicos. Nesse sentido, nas últimas décadas têm sido desenvolvidos diversos modelos de nucleases artificiais e, mais recentemente, de proteases artificiais. Estes são basicamente complexos mono, di ou multi metálicos que incluem metais como Fe, Zn, Cu, Co, lantanídeos, entre outros. Muitos destes complexos ajudaram a entender não somente os mecanismos envolvidos em reações catalisadas por enzimas, mas também, demonstraram possuir propriedades como agentes antitumorais, antimicrobianos, além de auxiliarem no seqüenciamento e elucidação de estruturas de proteínas.
Neste trabalho, foi avaliada a atividade de novos complexos metálicos na clivagem de DNA plasmidial e de uma proteína, a albumina sérica bovina (BSA). Para tanto, os complexos metálicos testados foram os seguintes: os complexos dinucleares de cobre II - [Cu2(HL1)(OAc)](ClO4)2.(CH3)2CHOH (1), sintetizado a partir do ligante não simétrico, binucleante H2L1 (N,N',N'-[tris-(2-piridilmetil)]-N-[(2-hidróxi-3,5-di-terc-butilbenzil)]-1,3-propano diamina -2-ol) e [Cu2(HL2)(OAc)](ClO4).H2O.(CH3)2CHOH (2), sintetizado a partir do ligante não simétrico, binucleante H3L2 (N,N-[bis-(2-piridilmetil)]-N',N'-[(2-hidróxibenzil)(2-hidróxi-3,5-di-tercbutilbenzil)] 1,3 propano diamina-2-ol) - e o complexo trinuclear de gadolínio III - Gd3(L3)2(NO3)2(H2O)4]NO3.8H2O (3), sintetizado a partir do ligante H3L3 (2- [N-bis-(2-piridilmetil)aminometil]-4-metil-6-[N'-bis(2-hidroxi-2-oxoetil)aminometil]fenol).
Para avaliar a clivagem foram realizados testes em diferentes pHs, tempos de incubação e concentração dos complexos. O mecanismo de ação foi determinado através de experimentos em atmosfera de argônio, testes na presença de inibidores de espécies reativas de oxigênio, de ligantes dos sulcos menor e maior do DNA e do agente quelante de Cu I (batocuproína). A interação foi observada através de titulações espectrofotométricas, espectros de dicroísmo circular e do efeito da força iônica na clivagem.
Os resultados obtidos mostram que todos os complexos são capazes de clivar o DNA plasmidial em baixas concentrações (µM) e pHs próximos ao fisiológico, com uma aceleração na casa de 106-107 vezes em relação à hidrólise espontânea do DNA. O mesmo foi observado para os complexos dinucleares de cobre na degradação de BSA. Ainda, a utilização de diferentes substratos (DNA ou BSA) provocou mudanças significativas no mecanismo de clivagem dos complexos 1 e 2. Assim, quando o substrato é o DNA plasmidial, 1 atua através de um mecanismo oxidativo e 2 age por meio de um mecanismo misto (hidrolítico e oxidativo); nessas circunstâncias, 2 possui maior atividade e afinidade pelo DNA. Por outro lado, com a utilização da proteína como substrato, ambos os complexos procedem através de um mecanismo hidrolítico; nessas condições, 1 é o complexo mais efetivo e de maior interação com a proteína. Com relação ao complexo 3, o mecanismo de clivagem de DNA plasmidial é hidrolítico, como observado para grande parte dos complexos de lantanídeos descritos na literatura. Em suma, todos os complexos podem ser considerados bastante efetivos na mimetização da função de uma nuclease ou de uma protease (apenas para 1 e 2), quando comparados a outros complexos reportados na literatura.
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Clivadas com somente : delimitando as propriedades semântico-pragmáticas das clivadasMoretto, Gian Franco January 2016 (has links)
Esta dissertação de mestrado tem como objetivo estudar a relação entre as propriedades semântico-pragmáticas das clivadas e as do advérbio somente. Mais especificamente, procura, por meio do estudo de ocorrências de clivadas com e sem somente, delimitar tais propriedades, verificando se os chamados “efeitos de exaustividade” (Kiss, 1998) são propriedades inerentes a esse tipo de construção. De acordo com Teixeira e Menuzzi (2015), a impossibilidade do uso de clivadas com somente em certos contextos indica que ela não é exaustiva – propriedades independentes de somente, contudo, também podem ser responsáveis por essa inadequação. Em nosso estudo, exploramos as razões que levam a essa inadequação, a partir de duas hipóteses: (i) da pressuposição de unicidade e (ii) das implicações de somente: a prejacente e a de exclusão. De acordo com Szabolcsi (1994); Wedgwood et. al (2006), a primeira hipótese afirma que clivadas pressupõem que apenas um único indivíduo satisfaz a predicação expressa em sua oração, o que nos leva a concluir que não pode ser adequada com somente, já que seria redundante assertar exclusão. A segunda hipótese, contudo (cf. Horn 1969, 1981), afirma que clivadas pressupõem apenas existência – não sendo incompatível com a noção de exclusão, permitiria que fossem usadas com somente. A partir de análises de clivadas com e sem somente em diversos contextos, nossos julgamentos de aceitabilidade indicam que, embora clivadas possam pressupor unicidade, esse não é, de fato, um requisito necessário para o seu uso. E, no caso de somente, também verificamos que não basta que clivadas pressuponham apenas existência, as implicações de somente também precisar ser satisfeitas contextualmente. Em resumo, acreditamos que a pressuposição da clivada não precisa ser de unicidade, não implica necessariamente exclusão e é, portanto, mais fraca do que a literatura em geral supõe. Com objetivo de verificar nossos julgamentos de aceitabilidade, aplicamos testes Likert em um grupo diverso de falantes de língua portuguesa, para que julgassem textos contendo clivadas com e sem somente. Casos em que a clivada com somente pressupõe apenas existência parecem se correlacionar com os nossos julgamentos, mas casos de unicidade e de satisfação dos requisitos de somente mostram-se problemáticos – em especial quando somente envolve alguma noção de “contra-expectativa”. Esses casos, estudados em pormenor, indicam a necessidade de controlarmos mais fortemente variáveis que envolvam a leitura dos textos aplicados e de investigar outros tipos de inferências possivelmente levantados por somente. / This thesis studies the relationship between the semantic-pragmatic properties of cleft sentences and the adverb only. More specifically, it aims at investigating whether the so-called “exhaustive effects” (Kiss, 1998) are inherent to clefts, through the study of clefts with and without only. According to Teixeira & Menuzzi (2015), the impossibility of clefts with only in certain contexts indicates that they are not exhaustive; independent properties of only may also be responsible for such inadequacy, though – requiring the application of other expressions to verify it. In our study, we analyzed the (in)adequacy of clefts with only based on two hypotheses: (i) the presupposition of uniqueness and (ii) the two implications of only, the prejacent implication and the exclusive implication. According to Szabolcsi (1994); Wedgwood et. all (2006), the first hypothesis assumes that clefts presuppose uniqueness, i. e., they presuppose that only one individual satisfies the predication expressed by the cleft clause. In such cases, only, it seems, is not appropriate in clefts, since it would be redundant to assert exclusion. Horn (1969, 1981), however, states that clefts presuppose existence, therefore allowing only to assert exclusion. Based on analysis of our own acceptability judgements of clefts with and without only, we find that, although clefts can presuppose uniqueness, this is not a necessary condition, and, when it comes to only, it is not enough that clefts simply presuppose existence – the implications of only need also be satisfied, as Teixeira & Menuzzi (2015) have pointed out. In summary, we believe that the presupposition of clefts need not be of uniqueness, and need not imply exclusion: they are weaker than the literature generally suggests. In order to confirm our own judgments, Likert tests were applied on a range of Portuguese speakers to judge texts containing clefts with and without only. The results show that cases in which the cleft with only presupposes only existence seem to confirm our hypotheses, but cases of uniqueness and requirements of the implications of only seem to be problematic – especially when only involves some notion of “counter-expectation”. These cases, studied in detail, indicate the need to better control variables such as reading proficiency and to investigate other possible inferences of only.
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