Cheung, Chi Yun. / "September 2011." / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 57-59). / Abstracts in English and Chinese. / Acknowledgment --- p.i / Table of Contents --- p.ii / Abstract --- p.iii / Abstract (Chinese Version) --- p.iv / Abbreviation --- p.v / Chapter 1. --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- General Background --- p.1 / Chapter 1.2 --- Mechanism of action --- p.3 / Chapter 1.2.1 --- Biosynthetic pathway of cholesterol --- p.3 / Chapter 1.2.2 --- Inhibition of HMG-CoA reductase by statins --- p.4 / Chapter 1.2.3 --- Plasma cholesterol reduction effect --- p.5 / Chapter 1.3 --- Previous syntheses of statin analogs --- p.5 / Chapter 1.3.1 --- Synthesis from (S)-malic acid --- p.6 / Chapter 1.3.2 --- Synthesis via enantioselective deprotonation --- p.7 / Chapter 1.3.3 --- Synthesis via asymmetric Diels-Alder reaction --- p.9 / Chapter 2. --- Results and Discussion --- p.11 / Chapter 2.1 --- Approaches towards construction of statin analogs --- p.11 / Chapter 2.2 --- Attempt to synthesize alkene 49 from D-arabinose --- p.12 / Chapter 2.3 --- Construction of alkene 49 from D-mannitol --- p.14 / Chapter 2.4 --- Olefin metathesis and conversion to statin analogs --- p.28 / Chapter 3. --- Conclusion --- p.32 / Chapter 4. --- Experimental Section --- p.33 / Chapter 5. --- References --- p.57 / Chapter 6. --- Appendix ii --- p.60

Cryptosporidium parvum is widely known for outbreaks within the immunocompetent population, as well its sometimes excruciating effects as an opportunistic agent in AIDS patients. Our understanding of the biology and host-parasite interactions of this parasitic protist is increasing at a rapid rate due to recent molecular and genetic advances. The topic of our research is in the area of C. parvum fatty acid metabolism, which is highly streamlined in this parasite. In addition to a type I fatty acid synthase (CpFAS1), C. parvum also possesses an enormous type I polyketide synthase (CpPKS1). Because of the size of this megasynthase, functional characterization of the complete enzyme is not possible. We have isolated and characterized the loading unit of CpPKS1 which contains an acyl-[acyl carrier protein (ACP)] ligase (AL) and an ACP. This unit is responsible for the overall substrate selection and initiation of polyketide production. Our data show that CpPKS1 prefers long-chain fatty acids with the highest specificity for arachidic acid (C20). Thus, the final polyketide product could contain as many as 34 carbons. Additionally, C. parvum possesses only a single fatty acid elongase. This family of enzymes serves a mechanism similar to FAS, and many have been found to be involved in de novo fatty acid synthesis in other organisms. After expressing this membrane protein in human cells, we have determined that it too prefers long-chain fatty acyl-CoAs which undergo only one round of elongation. This is in contrast to members of this enzyme family in other organisms that can initiate de novo synthesis from two- or four-carbon fatty acids via several rounds of elongation. Our lab has previously characterized the unique acyl-CoA binding protein (CpACBP1) from C. parvum. Molecular and biochemical data suggested that this enzyme may serve as a viable drug target. We have screened a library of known (and somewhat common) compounds against CpACBP1, and have isolated several potential compounds to be further examined for their ability to inhibit the growth of C. parvum.

There is a growing interest in documenting the effect of diet on the ability to convert saturated fatty acids (SFA) to monounsaturated fatty acids (MUFA) by modulating expression of the SCD gene. We propose that if cattle were raised to a constant body weight, their MUFA:SFA ratio will be the same regardless of being calf-fed (CF) or yearling-fed (YF). Twenty-four Angus cattle were acquired for this study. Cattle were slaughtered at weaning at 8 mo of age (SFCF, n=4), eight steers were assigned to the CF group and slaughtered at 12 mo of age (MFCF, n=4) and 16 mo of age (LFCF, n=4). Twelve cattle were assigned to the YF group and slaughtered at 12 mo of age (SFYF, n=4) 16 mo of age (MFYF, n=4) and market weight of 525 kg (LFYF, n=4). Cattle were then statistically analyzed based on time on high energy diet. Fatty acids from digesta, plasma, liver, L. dorsi, and s.c. and i.m. adipose tissue were all analyzed by FAME. In s.c. 18:1 and 16:1 were greatest in LFCF (41.27% and 5.58%, respectively, P = 0.05), and 18:0 and 16:0 did not differ between groups (P > 0.10). MUFA:SFA ratios of s.c. tended to be higher in LFCF animals (1.26) vs. LFYF (1.06, P = 0.10). However, there was no difference seen when comparing CF to YF animals (P = 0.26). MUFA:SFA ratio was higher in i.m. (P = 0.03) and also increased with age (P < .01). A trained sensory panel saw no significant differences between palatability of flavor characteristics of cooked steaks from LFCF, MFYF, or LFYF (P > 0.05). We showed increased SCD gene expression in the LFYF (248.41 to 1528.69 SCD/GAPDH, P = 0.01). Expression was higher in YF (P = 0.04), but their initial deposits of SFA, combined with the lack of SCD expression while on pastures, prevented the MUFA:SFA ratio from increasing at a rate fast enough to change the final ratios in the animal.

CATALÀ:L'enzim carnitina palmitoïltransferasa1 (CPT1), localitzat a la membrana mitocondrial externa, constitueix el principal punt de control de l'entrada d'àcids grassos de cadena llarga (LCFA) al mitocondri i és clau en el manteniment d'àcids grassos circulants. Existeixen tres isotips descrits (CPT1A, CPT1B i CPT1C) que codifiquen per enzims amb diferents característiques cinètiques i patrons d'expressió.1.- Mecanismes de control transcripcional del gen CPT1B humà.El promotor humà de la CPT1B inclou un element de resposta a PPAR i un lloc d'unió a MEF-2. Hem investigat el paper d'aquests elements de resposta i la possible interacció entre PPAR&#945; i MEF2C en la regulació transcripcional d'aquest promotor. Dels resultats obtinguts podem concloure que la resposta del promotor a PPAR&#945; depèn: del context cel·lular, de l'element de resposta a MEF-2 i de la disposició espacial d'aquest respecte al PPRE. La combinació d'aquests elements cis en el promotor de la CPT1B indueix l'expressió màxima del gen en resposta a diferents senyals. La concurrència de senyals metabòlics i miogènics en aquest promotor genera una conformació transcripcional permissiva d'aquest promotor que porta a una activació sinèrgica del promotor en aquells teixits on es troben els corresponents factors de transcripció (MEF2C, PPAR&#945;/RXR&#945;) i el substrat metabòlic de l'enzim, els àcids grassos que activen PPAR&#945;. En la mateixa una regió promotor una zona rica en GC capaç d'unir Sp1 ha resultat fonamental per l'expressió basal del gen i per la transactivació per PPAR&#945; però no per la de PPAR&#948;. 2.- Relació estructura/funció de l'enzim CPT1 de porc.A nivell cinètic, les CPT1A mostren una alta afinitat per la carnitina i una baixa sensibilitat al malonil-CoA mentre que les CPT1B presenten característiques contràries. Una excepció a aquesta relació és la CPT1A de porc (PLCPT1) que es comporta com una quimera natural entre els isotips A i B, presentant afinitats pels substrats similars a les CPT1A i una IC50 pel malonil-CoA típica de les CPT1B. Utilitzant quimeres entre la CPT1A de rata i la CPT1A de porc hem demostrat que l'extrem C-terminal de les CPT1A es comporta com un únic domini que dicta la sensibilitat total a malonil-CoA de l'enzim. El grau de sensibilitat a l'inhibidor ve determinat per l'estructura adoptada per aquest domini. Utilitzant mutants delecionats hem mostrat que la sensibilitat a malonil-CoA també depèn de la interacció d'aquest únic domini carboxil amb els primers 18 aminoàcids de la proteïna. D'aquests resultats podem concloure que les CPt1A de rata i porc presenten diferent sensibilitats a malonil-CoA perquè els primers 18 aminoàcids dels enzims interaccionen diferent amb el domini C-terminal.Hem aïllat l'isotip muscular de la CPT1 de porc (PMCPT1), una proteïna de 772 aminoàcids molt similar a les CPT1B. Expressada en Pichia pastoris la CPt1B de porc ha resultat ser un enzim amb característiques cinètiques pròximes a les CPT1A. 3.- Efecte de C75 sobre el sistema CPT. Els enzims CPT1 i CPT2 són components del sistema llançadora CPT. Aquest sistema es troba finament regulat pels nivells de malonil-CoA, un inhibidor reversible de la CPT1. Per la seva capacitat d'inhibir la sintasa d'àcids grassos (FAS), el C75 és capaç d'incrementar els nivells intracel·lular de malonil-CoA intracel·lular. Paradoxalment també activa l'oxidació d'àcids grassos de cadena llarga. Per tal d'identificar la diana exacta del C75 en el sistema CPT vam analitzar l'activitat enzimàtica de CPT1A, CPT1B i CPT2 davant el tractament amb C75. Els resultats d'aquests experiments indiquen que el C75 actua sobre el sistema CPT activant CPT1A, CPT1B i CPT2 de manera independent de malonil-CoA. / The outer mitochondrial membrane enzyme carnitine palmitoyltransferase1 (CPTI) catalyzes the initial and regulatory step in the &#946;-oxidation of long-chain fatty acids. There are three characterized isotypes: CPT1A, CPT1B and CPT1C. The human CPT1B promoter includes a functional PPAR responsive element and a myocite-specific site that binds MEF2C. We investigated the roles of these sites and the potential interaction between PPAR&#945; and MEF2C regulating this promoter. The combination of cis elements in the promoter of the CPT1B maximally induces the expression of this gene in response to a combination of signals. The concurrence of myogenic and metabolic signals generates a transcriptionally permissive conformation of the promoter that gives rise to a synergistic transcription of the gene in tissues containing the corresponding transcription factors and fatty acids that activate PPAR&#945;.Kinetic hallmarks of the CPT1A are high affinity for carnitine and low sensitivity to malonyl-CoA inhibition, while the opposite characteristics are intrinsic to the CPT1B isotype. Pig and rat CPT1A share common Km values for their substrates but differ in their sensitivity to malonyl-CoA inhibition. Using chimeras between rat CPT1A and pig CPT1A, we show that the C-terminal region behaves as a single domain, which dictates the overall malonyl-CoA sensitivity of this enzyme. Using deletion mutation analysis, we show that malonyl-CoA sensitivity also depends on the interaction of this single domain with the first 18 N-terminal amino acid residues. Pig and rat CPT1A have different malonyl-CoA sensitivity, because the first 18 N-terminal amino acids interact differently with the C-terminal domain. Pig CPT1B is a protein of 772 amino acids that shares extensive sequence identity with CPT1B. Expressed in Pichia pastoris, pig CPT1B shows kinetic characteristics similar to those of the CPT1A isotype. CPT1 and CPT2 enzymes are components of the CPT shuttle system. This system is tightly regulated by malonyl-CoA. Because of its ability to inhibit fatty acid synthase, C75 is able to increase malonyl-CoA intracellular levels. Paradoxically it also activates &#946;-oxidation. To identify the exact target of C75 within the CPT system, we expressed CPT1 and CPT2 in Pichia pastoris. We show that C75 acts on recombinant CPT1A, CPT1B and CPT2.

La Stéaroyl-CoA Désaturase I (SCD-I) est une enzyme hépatique impliquée dans la synthèse des acides gras monoinsaturés. Une forte activité de l'enzyme SCD-I ainsi qu'une altération du ratio acides gras saturés : insaturés est retrouvée dans diverses pathologies telles que l'obésité, le diabète de type II et le cancer. Principalement transcriptionnelle, la régulation de SCD-I est sous le contrôle de divers facteurs nutritionnels (ex: glucose) et hormonaux (ex: insuline). L'étude tente ici de localiser l'élément de réponse à l'insuline au niveau du promoteur du gène de la SCD-l et d'identifier les facteurs de transcriptions spécifiques qui s'y fixent. Pour cela, des hépatocytes embryonnaires de poulets (CEH) sont transfectés avec différentes constructions contenant des délétions du promoteur du gène aviaire SCD-l (délétions SCD1-1 à SCD1-6) clonées en amont du gène rapporteur de la luciférase (pGL2 basic vector). La mesure de l'activité luciférase après stimulation par l'insuline a permis de distinguer deux éléments de réponse au niveau du promoteur du gène SCDl. L'analyse des séquences consensus de ces éléments a permis de déterminer différents facteurs de transcription (ex: SRE, NF-Y, USF et Sp1) pouvant médier la régulation transcriptionnelle du gène par l'insuline. Des amorces spécifiques ciblant les régions consensus de l'élément le plus en 3' ainsi que la technique de retard sur gel en présence d'extraits nucléaires stimulés ou non par l'insuline, ont permis de vérifier que les séquences contenant les sites de fixation de SREBP-l et NF-Y fixent ces facteurs de transcription seulement en présence d'insuline. L'utilisation d'anticorps spécifiques dirigés contre ces protéines et la perte de l'activité luciférase après transfection de construction dépourvue de ces mêmes régions (délétion SCDI-7) après stimulation par l'insuline ont permis de confirmer l'implication des facteurs de transcription SREBP-l et NF-Y dans cette régulation. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Lipogenèse de novo, stéaroyl-CoA désaturase 1, Foie, Insuline, Facteurs de transcription, SREBP-1, NF-Y.

Une des enzymes clés de la lipogenèse hépatique, la stéaroyl-CoA désaturase 1 (SCD1), qui est impliquée dans la biosynthèse des acides gras monoinsaturés, semble jouer un rôle important dans le développement de l'obésité et de ses désordres métaboliques associés. En fait, une modification du ratio d'acides gras saturés versus acides gras mono-insaturés a été impliquée dans le développement de l'obésité, du diabète de type II et des maladies cardiovasculaires. L'expression de Scd1 est sous la dépendance de diverses hormones qui sont fortement modulées par la diète. L'insuline, dont la concentration augmente après un repas, permet d'activer la transcription du gène Scd1, tandis qu'une diète riche en acides gras polyinsaturés (PUFAs) permet d'inhiber son effet. La régulation de Scd1 est accomplie, entre autres, par la présence d'un élément de réponse à l'insuline sur le promoteur qui fixe les facteurs de transcription (TF) SREBP-1 et NF-Y et par l'activation de voies de signalisation spécifiques impliquant la voie PI3-K/mTOR. Ce projet vise à établir les mécanismes d'action des PUFAs et leurs liens potentiels avec PI3-K/mTOR au niveau hépatique. Grâce à des analyses de retard sur gel, nous avons démontré que l'insuline régulait la fixation de ces TFs sur le promoteur Scd1 et que cette fixation était modulée par les inhibiteurs de cette voie et par l'acide arachidonique. De plus, nous avons évalué par PCR en temps réel le rôle de l'insuline, et donc PI3-K/mTOR, ainsi que celui de l'acide arachidonique sur le niveau d'expression de Scdl et de ses TFs. Nos résultats démontrent au niveau hépatique que la voie PI3-K/mTOR cible des TFs spécifiques sur le promoteur Scd1 activant ainsi l'expression de ce gène en réponse à l'insuline et que les PUFAs permettent de contrer ses effets. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Lipogenèse de nova, SCD1, Insuline, mTOR, PUFA, SREBP-1, NF-Y.

La Stearoyl-CoA Désaturase-l (SCD1) est l'enzyme catalysant la synthèse des acides gras monoinsaturés, synthétisant le palmitoléyl-CoA (C16:1) et l'oléoyl-CoA (C18:1) à partir respectivement du palmitoyl-CoA (C16:0) et du stéaroyl-CoA (C18:0). Ces acides gras entrent ensuite dans la composition des triglycérides et des phospholipides membranaires. L'altération de la composition des phospholipides a été impliquée dans de nombreuses maladies incluant l'obésité et le syndrome métabolique associé. SCD1 est fortement exprimée au niveau du foie et du tissu adipeux. Elle est étroitement régulée par de nombreux facteurs nutritionnels et hormonaux principalement au niveau transcriptionnel mais aussi via une dégradation protéique rapide. Ceci permet à la cellule d'adapter l'activité enzymatique de SCD1 à la demande physiologique. Au niveau hépatique, l'insuline et la leptine sont impliquées respectivement dans la stimulation et l'inhibition de l'expression de SCD1. Leur fixation sur leur récepteur respectif précède l'activation de nombreuses voies de signalisation, qu'elles partagent pour la plupart, comme la voie 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PI3K) et la voie des Mitogen Activated Protein Kinase Extracellular Regulated Kinase 1/2 (MAPK ERK1/2). Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de caractériser les mécanismes impliqués dans l'action de l'insuline et de la leptine sur l'expression de SCD1. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence l'implication de la voie PI3K Mammalian Target Of Rapamycin (mTor) et des facteurs de transcription Sterol Response Element Binding Protein-1 (SREBP-1) et Nuclear Factor Y (NF-Y) dans la stimulation de l'expression de SCD1 par l'insuline. Dans un deuxième temps, nous avons démontré l'implication de la voie des MAPK ERK1/2 dans l'inhibition de l'expression de SCD1 par la leptine. Nos résultats suggèrent aussi un rôle important du facteur de transcription Stimulating Protein 1 (Sp1) dans ce phénomène. Au niveau transcriptionnel, l'action de l'insuline et de la leptine semble indépendante l'une de l'autre. Cependant, il apparaît globalement que l'effet inhibiteur de la leptine supplante l'effet activateur de l'insuline au niveau de l'expression de SCD1. Le tissu adipeux est le lieu de stockage principal des triglycérides. L'analyse de la composition de ces triglycérides révèle que le C18:1 constitue l'acide gras le plus abondant. Des travaux réalisés sur des modèles animaux suggèrent fortement qu'une activité élevée de SCDl au niveau du tissu adipeux est fortement corrélée avec l'adiposité et l'obésité. Dans une troisième partie, nous avons donc testé l'hypothèse que la désaturation induite par SCD1 est positivement reliée à l'expansion du tissu adipeux. Nous avons montré que, indépendamment de leur apport en acides gras, le taux de C18:0 était diminuée dans le tissu adipeux omental de femmes atteintes d'obésité viscérale. De plus, chez ces patientes, ne présentant pas de syndrome métabolique, l'indice de désaturation (C18:1/C18:0) était augmenté. Nous avons aussi montré une association entre le niveau d'adiposité de ces patientes et la diminution du niveau de C18:0. L'adiposité de ces femmes a aussi été associée à l'augmentation de l'indice de. désaturation (C18:1/C18:0) et à l'augmentation du niveau d'expression de SCD1. En conclusion, nos travaux attestent la complexité de la régulation de l'expression de SCD1. Nos études confirment aussi le rôle clé de SCD1 au niveau du métabolisme lipidique, du développement de l'obésité et du syndrome métabolique associé. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Désaturase, SCD1, Insuline, Leptine, Protéines kinases, PI3K, mTor, MAPK, ERK1/2, SREBP-1, NF-Y, Sp1, foie, tissu adipeux.

There is a growing interest in documenting the effect of diet on the ability to convert saturated fatty acids (SFA) to monounsaturated fatty acids (MUFA) by modulating expression of the SCD gene. We propose that if cattle were raised to a constant body weight, their MUFA:SFA ratio will be the same regardless of being calf-fed (CF) or yearling-fed (YF). Twenty-four Angus cattle were acquired for this study. Cattle were slaughtered at weaning at 8 mo of age (SFCF, n=4), eight steers were assigned to the CF group and slaughtered at 12 mo of age (MFCF, n=4) and 16 mo of age (LFCF, n=4). Twelve cattle were assigned to the YF group and slaughtered at 12 mo of age (SFYF, n=4) 16 mo of age (MFYF, n=4) and market weight of 525 kg (LFYF, n=4). Cattle were then statistically analyzed based on time on high energy diet. Fatty acids from digesta, plasma, liver, L. dorsi, and s.c. and i.m. adipose tissue were all analyzed by FAME. In s.c. 18:1 and 16:1 were greatest in LFCF (41.27% and 5.58%, respectively, P = 0.05), and 18:0 and 16:0 did not differ between groups (P > 0.10). MUFA:SFA ratios of s.c. tended to be higher in LFCF animals (1.26) vs. LFYF (1.06, P = 0.10). However, there was no difference seen when comparing CF to YF animals (P = 0.26). MUFA:SFA ratio was higher in i.m. (P = 0.03) and also increased with age (P < .01). A trained sensory panel saw no significant differences between palatability of flavor characteristics of cooked steaks from LFCF, MFYF, or LFYF (P > 0.05). We showed increased SCD gene expression in the LFYF (248.41 to 1528.69 SCD/GAPDH, P = 0.01). Expression was higher in YF (P = 0.04), but their initial deposits of SFA, combined with the lack of SCD expression while on pastures, prevented the MUFA:SFA ratio from increasing at a rate fast enough to change the final ratios in the animal.

Cryptosporidium parvum is widely known for outbreaks within the immunocompetent population, as well its sometimes excruciating effects as an opportunistic agent in AIDS patients. Our understanding of the biology and host-parasite interactions of this parasitic protist is increasing at a rapid rate due to recent molecular and genetic advances. The topic of our research is in the area of C. parvum fatty acid metabolism, which is highly streamlined in this parasite. In addition to a type I fatty acid synthase (CpFAS1), C. parvum also possesses an enormous type I polyketide synthase (CpPKS1). Because of the size of this megasynthase, functional characterization of the complete enzyme is not possible. We have isolated and characterized the loading unit of CpPKS1 which contains an acyl-[acyl carrier protein (ACP)] ligase (AL) and an ACP. This unit is responsible for the overall substrate selection and initiation of polyketide production. Our data show that CpPKS1 prefers long-chain fatty acids with the highest specificity for arachidic acid (C20). Thus, the final polyketide product could contain as many as 34 carbons. Additionally, C. parvum possesses only a single fatty acid elongase. This family of enzymes serves a mechanism similar to FAS, and many have been found to be involved in de novo fatty acid synthesis in other organisms. After expressing this membrane protein in human cells, we have determined that it too prefers long-chain fatty acyl-CoAs which undergo only one round of elongation. This is in contrast to members of this enzyme family in other organisms that can initiate de novo synthesis from two- or four-carbon fatty acids via several rounds of elongation. Our lab has previously characterized the unique acyl-CoA binding protein (CpACBP1) from C. parvum. Molecular and biochemical data suggested that this enzyme may serve as a viable drug target. We have screened a library of known (and somewhat common) compounds against CpACBP1, and have isolated several potential compounds to be further examined for their ability to inhibit the growth of C. parvum.

Evidence suggests that there is an immunological response of the recipient to xenograft bioprosthetic heart valves. Information on the impact of HMG-CoA reductase inhibitors (statins) and their anti-inflammatory properties on bioprosthetic valve failure remains limited. We sought to examine the efficacy of statin therapy in a rodent model of bioprosthetic valve implantation. To mimic the human scenario, fresh or glutaraldehyde-fixed aortic valve root conduits from Lewis rats or Hartley guinea pigs were microsurgically implanted intravascularly into the infra-renal aorta of Lewis rats. The syngeneic control group consisted of a fresh rat valve conduit implanted into a rat. The xenogeneic control group consisted of a glutaraldehyde-fixed guinea pig valve conduit implanted into a rat. Treatment groups consisted of xenogeneic groups treated with either daily steroids or statins. Overall, steroid treatment attenuated the inflammatory response observed within the xenogeneic glutaraldehyde-fixed valve conduits. Treatment with statins did not decrease this inflammatory response.