Orientadores: Valdemiro Carlos Sgarbieri, Durvanei Augusto Maria / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-09T10:14:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_GeorgiaAlvaresde_D.pdf: 11428319 bytes, checksum: 35439f6a0fe2edb2363b7aa078ebd0fa (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O principal objetivo deste projeto foi avaliar as propriedades fisiológicas potenciais de hidrolisados de colágeno (HC) e de um isolado protéico de soro de leite bovino (WPI) em relação aos efeitos anti-ulcerativo e anti-tumoral em roedores. O projeto apresenta uma parte tecnológica que envolve a produção do WPI e hidrolisados de colágeno (Gelita) com diferentes distribuições de massa molecular. Para obter as frações protéicas utilizadas neste estudo, responsáveis por estes atributos, uma caracterização foi conduzida por fracionamento através de microfiltração utilizando tecnologia de membranas e sistema FPLC por cromatografia de permeação em gel e de fase reversa. Estas tecnologias foram utilizadas para obtenção dos hidrolisados de colágeno com diferentes massas moleculares e do isolado protéico de soro de leite (WPI), para possibilitar a caracterização química e avaliações bioquímica/ fisiológica em suas atividades anti-úlcera e anti-tumoral. Os produtos elaborados a partir desta tecnologia de fracionamento foram caracterizados de acordo com o grau de hidrólise, composição de aminoácidos, massa molecular e número de peptídios, utilizando metodologias estabelecidas. Hidrolisados de colágeno bovino e suíno apresentaram características diferentes quanto ao grau de amidação e teor de amônio total, assim como na eletrofocalização. Os perfis cromatográficos de permeação em gel foram semelhantes, mas a atividade biológica em meio com células de melanoma B16F10 também diferiu. A combinação destas duas proteínas para avaliação dos efeitos anti-ulcerativo e anti-tumoral, também foi utilizada. Atenção especial foi dedicada a uma melhor compreensão da rota metabólica e mecanismos de ação destas duas proteínas e seus peptídios nos ensaios biológicos (modelo com ratos e camundongos, respectivamente). Para investigar o efeito anti-ulcerativo, ratos Wistar com 250-300g de peso corpóreo foram utilizados. Experimentos com dose única e repetitivas foram feitos para avaliar os efeitos destas proteínas na redução ou inibição da úlcera gástrica. A participação das substâncias sulfidrila ativas provenientes da glutationa (GSH), aminoácidos e ligações inter e intra- cadeias polipeptídicas, no mecanismo de proteção, foi estudada através da alquilação total do grupo reativo SH pela Netilmaleimida (NEM). Algumas respostas fisiológicas foram avaliadas como a produção de muco gástrico e gastrina durante o modelo experimental de úlcera induzida por etanol. A atividade inibitória em modelo de úlcera gástrica induzida por etanol foi também distinta nos hidrolisados bovino (BCH) e suínos (PCH), apresentando o hidrolisado suíno em torno de 60% de inibição das lesões ulcerativas quando administrado em dose única 750mg/Kg de peso corpóreo. No experimento de dose dupla a porcentagem de inibição das lesões ulcerativas gástricas dos hidrolisados bovinos foi maior que 70% quando administrado 1500 mg/Kg pc. Quando foram realizadas combinações de hidrolisados de colágeno bovino ou suíno com WPI, obteve-se uma combinação otimizada para BCH:WPI (50:50) na concentração de 375mg/Kg, com mais de 70% de inibição das lesões ulcerativas gástricas. Os hidrolisados de colágeno levaram ao aumento da produção de muco na mucosa gástrica e o WPI à inibição com a participação das substâncias sulfidrila não protéica na atividade inibitória das lesões gástricas. Na avaliação in vitro com as células B16F10 e os hidrolisados de colágeno bovino e suíno e suas frações obtidas por micro e ultrafiltração, assim como aquelas provenientes da cromatografia por HPLC de fase reversa, mostraram que estas últimas apresentaram a menor concentração inibitória para 50% das células (IC50), também apresentando aumento na fase de apoptose com significativo aumento na porcentagem de expressão da caspase-3 nos meios contendo as frações F1, F2 e F3. O estudo de propriedade anti-tumoral foi conduzido utilizando camundongos C57BL/6J. Animais saudáveis foram injetados (transplantados) com células tumorais de melanoma murino B16F10 na área dorsal para avaliar a implantação tumoral, progressão, caquexia observando a perda de peso e outros sintomas, metástase, capacidade proliferativa do tumor assim como sua classificação de acordo com o volume, tamanho e número. Os mecanismos nos quais a dieta protéica pode estar envolvida, avaliando a fase do ciclo celular, apoptose e efeitos anti-proliferativos no tecido tumoral foram também objetivos deste estudo. Protocolos utilizando quimioterápico foram seguidos com aquelas dietas protéicas que apresentaram melhor resposta contra a tumorigênese considerando outros mecanismos que poderiam estar envolvidos. No modelo de tumorigênese in vivo com células de melanoma B16F10 observouse uma menor porcentagem de mortalidade, maior porcentagem de sobre-vida e aspectos macroscópicos vantajosos para o grupo de animais C57BL/6J que ingeriram American Institute of Nutrition (AIN-93) tendo como fonte protéica BCH: WPI (50:50) e tratamento quimioterápico. O ciclo celular também sofreu alteração com as diferentes dietas. A fase G0/G1 tanto no grupo com tratamento quimioterápico como no grupo sem quimioterápico foi significativamente aumentada para os grupos dietéticos com BCH e BCH-P1 + WPI. A porcentagem de apoptose aumentou para BCH+WPI com tratamento quimioterápico. A capacidade proliferativa das células B16F10 diminuiu para os grupos de camundongos C57BL/6J que se alimentaram de hidrolisados de colágeno sem tratamento quimioterápico e quando houve quimioterapia associada somente aqueles grupos que receberam a combinação das duas proteínas BCH ou BCHP1 com WPI tiveram uma diminuição significativa da capacidade proliferativa das células B16F10 / Abstract: The main objective of this project was to evaluate the potential physiological properties of collagen hydrolysate (CH from Gelita) and a whey protein isolate (WPI) in relation to anti-ulcerative and anti-tumoral effects in rodents. The project presents a technological part, which involves the WPI production with different molecular masses. To obtain the proteic fractions used in this study responsible for these attributes, a characterization was conducted using fractionation through microfiltration using membranes technology and FPLC system through gel permeation and reverse phase chromatography. These technologies were used to obtain the collagen hydrolysate with different molecular masses and the whey protein isolate (WPI) to allow the chemical characterization and biochemical and physiological evaluations of their anti-ulcerative and anti-tumoral activities. The elaborated products obtained from these fractionation technologies and also the products from GELITA (derivatives of collagen) were characterized according to degree of hydrolysis, amino acids composition, molecular mass and peptide number, using established methodologies. Bovine and porcine collagen hydrolysates presented different characteristics concerning degree of amidation and total ammonium content, as well as in isoelectric focusing. The chromatographic profiles in gel were similar, but the biological activity in cellular medium of melanoma B16F10 also differed. Combination of these two types of proteins to evaluate anti-ulcerative and antitumoral effects were also done. Special attention was dedicated to better understanding of metabolic routes and mechanisms of action of these two proteins and their peptides in biological assays (models with rats and mice, respectively). To investigate the anti-ulcerative effect Wistar rats (250-300g bw) were used. Experiments with single and double doses were conducted to evaluate the effect of these proteins in reduction or inhibition of gastric ulcer. The participation of active sulfhydryl compounds, from gluthatione, aminoacids and inter-, intra- polypeptides chains, in protection mechanism, was studied through alkylation of SH reactive groups using N-ethylmaleimide (NEM). Some physiological responses were evaluated, as mucus and gastrin production, during experimental model of ulcer induced by ethanol. The inhibitory activity in gastric ulcer model induced by ethanol was also distinct for these two hydrolysates, bovine (BCH) and porcine (PCH). The porcine hydrolysate presented around 60% of ulcerative lesion inhibition when 750mg/Kg body weight was administrated at single dose. For double dose experiment the percentage of inhibition for bovine hydrolysate was higher than 70% when 1,500mg/Kg bw was administrated. When was tested combinations of either bovine or porcine collagen hydrolysate with WPI a optimized combination was obtained BCH:WPI (50:50) at 375mg/Kg bw of concentration presenting more than 70% gastric ulcerative lesion inhibition. The collagen hydrolysate led to increased mucus production in gastric mucosa while WPI caused in addition an inhibition by non-proteic sulfhydryl compounds participation in the inhibitory activity of gastric lesions. In vitro evaluation using B16F10 cells, the bovine and porcine collagens hydrolysates and their fractions obtained through micro and ultrafiltration, as well as those obtained by reverse phase chromatography (F1, F2, F3), showed the lowest inhibitory concentration for 50% of cells (IC50), presenting increased apoptosis percentage and a significant increase of caspase-3 expression. The study of anti-tumoral property was conducted using mice C57BL/6J. Healthy animals were injected (transplanted) with tumoral cells of murine melanoma B16F10 in dorsal area to evaluate the tumoral implantation, progression, caquexia observing the body weight loss and other symptoms, metastasis, proliferative capacity of the tumor, as its classification according to volume, size and number. The mechanisms involving the protein in the diet for evaluating cell cycle phases, apoptosis and anti-proliferative effects in tumoral tissue development were also objectives of this study. Protocols using chemotherapic were followed with protein which presented better response against tumorigenesis considering other mechanisms that could be involved. In tumorigenesis, in vivo model using B16F10 melanoma cells, a lower percentage of mortality, longer survival percentage and better macroscopic aspects were observed for C57BL/6J animal groups, fed American Institute of Nutrition (AIN-93) with BCH:WPI (50:50) as protein source plus chemotherapic treatment. The cellular cycle also suffered alteration with different diets. The G0/G1 phase for both groups treated and non-treated with chemotherapic increased significantly for the dietetic groups BCH or BCH-P1 + WPI. The apoptosis percentage increased for BCH+WPI+ChTP (with chemotherapic treatment). The proliferative capacity of B16F10 cells was reduced in the groups fed collagen hydrolysate without chemotherapic treatment and when the chemotherapic was associated only the groups that received both proteins BCH or BCH-P1 with WPI showed a significant reduction of proliferative capacity of these cells / Doutorado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Doutor em Alimentos e Nutrição

Orientador: Celso Aparecido Bertran / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T19:51:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Allegretti_LauterJoseMarques_M.pdf: 3340752 bytes, checksum: d69d7cbf5f72a9807eba7be1c23088b6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A matriz óssea é um nanocompósito formado basicamente de fosfato de cálcio (70% m) e colágeno (30% m), responsável pela resistência mecânica dos ossos, e, portanto, pela função mais importante do esqueleto. A perda de qualidade de vida que pode ser causada por enfermidades e traumas dos ossos aumenta a importância em estudar e compreender este material fantástico. O crescimento da expectativa de vida da população torna mais comum os problemas com os ossos. Desta forma, entendermos as características e propriedades dos ossos, ou seja, conhecê-las melhor, pode contribuir para a solução destes problemas. Neste trabalho nos propusemos a estudar a influência de matrizes de colágeno tipo I no processo de mineralização de fosfato de cálcio no interior delas. Pela permeação de vapor de amônia em soluções de colágeno em pH 2 contendo íons Ca e H2PO4, foram obtidos géis de colágeno que foram estruturados, simultaneamente com a formação de fosfato de cálcio em seu interior. Além do colágeno estruturado, sob condições especiais, foram obtidas fibras (fibrilogênese) de colágeno, mineralizadas pela precipitação de fosfato de cálcio. Para avaliar a influência de uma matriz de colágeno anisotrópica sobre a organização das partículas de fosfato de cálcio, fibras in natura de colágeno foram parcialmente intumescidas em solução de íons Ca e H2PO4 em pH 4,8 e mineralizadas pela permeação de amônia gasosa. Os resultados deste trabalho mostraram que: matrizes de colágeno que sofrem estruturação simultaneamente com a formação de partículas de fosfato de cálcio alteram a morfologia destas partículas nucleadas e crescidas no seu interior. Quando a estruturação resulta em fibrilogênese, além da morfologia, observa-se um efeito de orientação sobre as partículas formadas. O colágeno interage tanto com os íons cálcio dispersos no gel, antes da estruturação, como com as partículas de fosfato de cálcio, estabilizando o gel. A morfologia, cristalinidade e tamanho de cristalitos das partículas formadas nos géis estruturados são semelhantes às observadas para as partículas de fosfato de cálcio que constituem a matriz inorgânica dos ossos. O método proposto para precipitação de fosfato de cálcio em meio à matriz de colágeno é inovador e tem potencial para produção de biomaterial sintético de boa qualidade em condições de assepsia, que apresenta similaridades com diversas propriedades observadas para a matriz óssea. / Abstract: Bone matrix is a nanocomposite basically formed by calcium phosphate (70% wt) and collagen (30% wt), which is responsible for bone mechanical resistance, and therefore, for the most important function of the skeleton. The life quality loss that can be caused by diseases and injuries of bones increases the importance of studing and understanding this amazing material. With the growth of the population life expectancy the problems with bones become more common. Thus, to understand these diseases and to learn more about bone¿s characteristics may contribute to solving these problems. In this work we have studied the influences of collagen matrices of type I in the mineralization of calcium phosphate within the collagen. Through permeation of gaseous ammonia in the collagen solutions containing Ca and H2PO4 ions in pH 2, structured collagen gels were obtained, while the precipitation of calcium phosphate occured inside the gels. Besides the collagen structured, under special conditions, collagen fibers (fibrilogenese) were obtained while (simultaneously) calcium phosphate precipitation mineralized these fibers. To assess the influence of an anisotropic collagen matrix on the organization of particles of calcium phosphate, collagen fibers in natura were partially solubilized after soaked in a solution with Ca and H2PO4 ions, in pH 4.8 and mineralization was carried out by adsorption of gaseous ammonia. The results of this study showed that the collagen matrix that undergoes structure organization while (simultaneously) calcium phosphate particles are formed changes the morphology of the particles nucleated and grown inside the matrix. When the structure results in fibrilogenese, besides the morphology, there is an orientation effect on the formed particles. The collagen interacts with both calcium ions dispersed in the gel, before the structuring, and the particles of calcium phosphate, stabilizing the gel. The morphology, crystallinity and particle size of crystallites formed in structured gels are similar to the calcium phosphate particles observed, which are present in the inorganic matrix of bone. The proposed method for precipitation of calcium phosphate in the middle / within of the collagen matrix is innovative and has the potential to produce good quality synthetic biomaterial in conditions of asepsis, which has similarities with several properties observed for the bone matrix. / Mestrado / Físico-Química / Mestre em Química

Orientador: Paulo Eduardo Neves Ferreira Velho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T23:55:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Herreros_FernandaOliveiraCamargo_D.pdf: 4370286 bytes, checksum: 0e6f9cf2e309de5fa2e57c9c899541ac (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A intradermoterapia é um processo terapêutico com poucas publicações científicas em revistas indexadas. Em 2005, um estudo duplo-cego randomizado demonstrou os benefícios proporcionados para a pele, cabelos e unhas de mulheres com fotoenvelhecimento pelo consumo de um suplemento oral de silanol. Frente a esses dados, realizou-se um estudo com o objetivo de comparar as alterações histológicas entre a pele humana que recebeu injeção intradérmica de silanol e as encontradas na pele em que foi injetado soro fisiológico. Dez mulheres caucasianas, sadias, com grau moderado de fotoenvelhecimento, voluntariamente receberam dez sessões semanais de injeções com salicilato de silanol 0,1% no antebraço esquerdo, e injeções de soro fisiológico no antebraço direito. No momento da biópsia, duas semanas depois, três pacientes recusaram-se a realizar o procedimento. Os achados histológicos nas áreas injetadas com silanol e com soro fisiológico, encontrados em biópsias, foram avaliados e comparados por um pesquisador de forma cega e as fibras colágenas e elásticas de cada lado foram quantificadas. A análise da textura da derme foi feita a partir das imagens microscópicas digitalizadas, por meio da dimensão fractal de Sarkar e do cálculo das amplitudes (valores de inércia), após a transformada rápida de Fourier. A área injetada com silanol revelou um aumento estatisticamente significativo da densidade de fibras colágenas e elásticas. A análise de textura revelou uma distribuição mais compacta e mais homogênea das fibras de colágeno. O resultado desse estudo sugere que a aplicação de um silício orgânico pode estimular a síntese das fibras elásticas e colágenas, levando a um remodelamento da estrutura da derme, o que pode explicar a melhora da aparência da pele, observada em estudos clínicos. Com base nestes resultados, relatou-se o caso de uma paciente com cicatrizes atróficas resultantes de micobacteriose atípica tratada com doxiciclina por seis meses. A paciente havia se submetido à hidrolipoclasia por ultra-som e a infecção desenvolveu-se nos locais do procedimento. Esta complicação ainda não havia sido descrita na literatura médica associada a tal procedimento. As cicatrizes foram submetidas a cinco sessões de intradermoterapia com salicilato de silanol, apresentando melhora parcial da aparência / Abstract: Mesotherapy is a technique that lacks scientifical clinical trials. In 2005, a controlled double-blind study in patients with photo-aged facial skin demonstrated the beneficial role of oral intake of silanol for skin, hair and nails. Facing it, a study was developed to compare histological alterations in human skin that received intradermal injections of silanol. Ten healthy female caucasian volunteers with a moderate degree of photoaged skin received ten sessions of weekly injections of 0.1% salicylate silanol in the left ventral lateral forearm and physiological solution injections on the right forearm. At biopsy time, three patients denied to receive this procedure. The histological features of punch biopsies of the treated area and the nontreated contralateral arm were compared and the collagen and elastic fibers were quantified by a blind physician. Texture analysis was performed on digitalized microscopic images by analyzing the Sarkar fractal dimension and amplitudes (inertia values) after Fast Fourier transformation. The treated area revealed a statistically significant increase of the density of both collagen and elastic fibers. Texture analysis showed more compact and homogenously distributed collagen fibers after silicon injection. This result suggests that the application of silicon may stimulate the production of collagen and elastic fibers leading to remodeling of the dermal fiber architecture, which may explain the improvement of the skin surface observed in clinical studies. Also, a case report illustrates a mycobacteria infection following an ultrasound hydrolipoclasia procedure, complication not previously reported in medical literature. After the antibiotic treatment, the patient developed atrophic scars, that received five sessions of mesotherapy with silanol, with some improvement in scar appearance / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

A capacidade extraordinária de crescimento do tecido hepático pode ser estimulada por dois processos, a hepatectomia parcial ou pelo fornecimento de substâncias hepatotróficas. Neste trabalho, foi adotada a segunda opção para tratar fígados de rata com fibrose, verificando-se o efeito dos fatores hepatotróficos sobre o quadro histopatológico, a proporção volumétrica do colágeno e a condição funcional do fígado de ratas Wistar com fibrose induzida por dimetilnitrosamina. Após 5 semanas de tratamento. Os animais foram submetidos à biópsia hepática e divididos em 2 grupos: o Grupo C recebeu 40 ml/kg de solução fisiológica por via intraperitoneal a cada 12h, durante 10 dias consecutivos e o Grupo F recebeu fatores hepatotróficos na mesma dosagem e freqüência que as do Grupo C. O sangue foi colhido momentos antes do sacrifício e em seguida amostras dos fígados foram levadas à rotina de fixação e inclusão para microscopia de luz. O exame histopatológico mostrou a presença de lesões características de fibrose hepática, tais como: nódulos regenerativos, proliferação de ductos biliares, infiltrado inflamatório com presença de células ovais e megalocitose de hepatócitos, sendo que os animais do Grupo F apresentaram redução do quadro acima descrito. O peso dos animais do grupo F aumentou 13%, o peso do fígado aumentou 12,2% e o peso do fígado em relação ao peso da carcaça aumentou 16%. A densidade volumétrica do colágeno no lóbulo hepático reduziu-se em 43% no grupo F, enquanto que no Grupo C houve aumento de 6%. O colágeno perivascular na veia centrolobular aumentou 42,7% no grupo C e reduziu-se 43,4% no grupo F. No espaço porta o colágeno perivascular aumentou 6,7% no grupo C e reduziu 67,3% no grupo F. A concentração sérica de albumina no Grupo C foi de 3,8g/l e no Grupo F de 4,7g/l. A proteína total foi 6,1g/l no Grupo C e no Grupo F de 7g/l. A aspartato aminotransferase AST foi 148,3 U/l no Grupo C e 94,9 U/lno Grupo F, a alanina aminotransferase ALT foi 86,9 U/l no Grupo C e 44,1 U/l no Grupo F. Concluiu-se assim, que os fatores hepatotróficos injetados intraperitonealmente, reduziram o quadro histopatológico e a densidade volumétrica do colágeno, promovendo melhor resposta da função hepática no Grupo F quando comparado com o Grupo C. / The extraordinary capacity of growth of hepatic tissue can be stimulated by two processes, by the partial hepatectomy or by hepatotrophic substance supply. In this work, it was adopted the second option to treat rats with induced-fibrosis, verifying the effect of the hepatotrophic factors on the histopathological evaluation, the ratio volumetric of the collagen and the functional condition of the liver of Wistar rats with induced-fibrosis by dimetilnitrosamine. After 5 weeks of treatment, the animals had been submitted to hepatic biopsies and divided in 2 groups: Group C received 40 ml/kg of physiological solution by intraperitoneal application each 12h, during 10 consecutive days and Group F received hepatotrophic factors in same dosage and frequency of Group C. Blood collection was proceeded moments before the sacrifice and samples of the liver had been submitted to the light microscopy routine of fixation and inclusion. The histopathologic evaluation showed the presence of characteristic injuries of hepatic fibrosis, such as: regenerative nodules, biliar ducts proliferation, inflammatory infiltrated with presence of oval cells and hepatocyte megalocytes, and the animals of Group F presented reduction of the above description. The weight of the animals of group F increased 13%, the weight of the liver increased 12.2% and the weight of the liver in relation to the weight of the carcass increased 16%. The volumetric collagen density in hepatic lobe decreased 43% in group F, while in Group C it icreased 6%. The central lobular vein perivascular collagen increased in 42.7% in group C and decreased 43.4% in group F. In the portal space, the perivascular collagen increased 6.7% in group C and reduced 67.3% in group F. The serum concentration of albumen in Group C was 3,8g/l and in Group F 4,7g/l. The total protein was 6,1g/l in Group C and in Group F 7g/l. The aspartate aminotransferase AST was 148,3 U/l in 94,9 Group C and U/l in Group F, alanine aminotransferase ALT was 86,9 U/l in 44.1 Group C and U/l in Group F. We concluded the intraperitoneal hepatotrophic factors injection had reduced the histopathological signs and the collagen volumetric density, promoted better recovery of the hepatic function in Group F when compared to Group C.

O estudo das propriedades das membranas celulares, assim como sua interação com íons e moléculas é de fundamental importância para o entendimento de processos biológicos complexos, como a formação do tecido ósseo. O osso natural é constituído por compostos orgânicos, especialmente proteínas como o colágeno, e por minerais, como a hidroxiapatita. O processo pelo qual ocorre a formação do componente inorgânico é chamado de biomineralização, um processo complexo mediado pela liberação de vesículas da matriz (VM), secretadas em locais específicos a partir de osteoblastos. Essas VM são ricas nas principais biomoléculas envolvidas nesse processo, como as proteínas anexina, em especial a anexina V (AnxA5), que exercem papel importante como, formação de canais de cálcio e ligação com o colágeno, criando assim um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita a partir de fibrilas de colágeno. No presente estudo foi possível incorporar colágeno e AnxA5 em sistemas modelo para estudos de biomineralização, utilizando-se monocamadas de Langmuir e os filmes Langmuir-Blodgett (LB). As monocamadas foram formadas com os principais grupos carregados de lipídios encontrados nas VM: fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilserina (PS). As monocamadas formadas por lipídios, colágeno e AnxA5 foram depositadas sobre discos de titânio utilizando-se a técnica dos filmes LB. Os filmes formados foram expostos a uma solução que simula o pH e força iônica do fluido corpóreo, de maneira a mimetizar a precipitação de hidroxiapatita. As amostras foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia vibracional na região do infravermelho (FTIR) e difração de raios X (EDX). Além disso, estudou-se as propriedades de molhabilidade e energia livre de superfície das amostras de titânio modificadas. Colágeno e AnxA5 interagiram com os lipídios, como mostrado nas isotermas. Interação preferencial foi observada no sistema binário contendo DPPC e DPPS e na presença de íons cálcio, como ocorre nos sistemas naturais. A presença das proteínas e dos fosfolipídios nos filmes LB sobre as superfícies de titânio foram essenciais para formação de nanopartículas de hidroxiapatita biomimética. / The study of the properties of cell membranes, as well as their interaction with ions and molecules, is of fundamental importance for the understanding of complex biological processes, such as the formation of bone tissue. The natural bone consists of organic compounds, especially proteins like collagen, and minerals, such as hydroxyapatite. The process which the formation of the inorganic component takes place is called biomineralization, a complex process mediated by the release of matrix vesicles (MV), secreted at specific sites from osteoblasts. These MVs are rich in the main biomolecules involved in this process, such as annexin proteins, especially annexin V (AnxA5), which play an important role as calcium channels formation and binding with collagen, thus creating a suitable microenvironment for formation initial and propagation of the hydroxyapatite crystals from collagen fibrils. In the present study, it was possible to incorporate collagen and AnxA5 into model systems for biomineralization studies using Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett (LB) films. The monolayers were formed with the main lipid groups found in MVs: phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS). The monolayers formed by lipids, collagen and AnxA5 were deposited on titanium plates using the LB film technique. The films were exposed to a solution that simulates the pH and ionic strength of the body fluid in order to mimic the precipitation of hydroxyapatite. The samples were characterized by scanning electron microscopy (SEM), infrared vibration spectroscopy (FTIR) and X-ray diffraction (XRD). In addition, the wettability and surface free energy properties of the modified titanium samples were studied. Collagen and AnxA5 interacted with lipids, as shown in the isotherms. Preferential interaction was observed in the binary system containing DPPC and DPPS and in the presence of calcium ions, as occurs in natural systems. The presence of the proteins and the phospholipids in the LB films on the titanium surfaces were essential for the formation of biomimetic hydroxyapatite nanoparticles.

O intuito do desenvolvimento de biomateriais potencialmente aplicáveis como implantes de substituição óssea é sintetizar superfícies que induzam respostas biológicas positivas quando em contato com o tecido hospedeiro. Para isso, faz-se necessário não somente estudos de composição química, mas também é importante buscar compreender propriedades físicas e estruturais dos sistemas que estes materiais irão substituir. O osso natural é constituído por compostos orgânicos, especialmente proteínas como o colágeno, reforçado com minerais, tais como hidroxiapatita. O processo pelo qual ocorre a formação do componente inorgânico é chamado biomineralização. Uma maneira de introduzir macromoléculas em sistemas modelo para estudos de biomineralização é a formação de monocamadas Langmuir, que são camadas monomoleculares altamente organizadas de moléculas anfifílicas na interface líquido-ar. Essas monocamadas podem ser transferidas para suportes sólidos formando filmes de Langmuir-Blodgett. Neste estudo, foi investigado a incorporação de colágeno tipo-I em monocamadas insolúveis contendo os fosfolipídeos 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC) ou ácido octadecilfosfônico (OPA), bem como a transferência dessas monocamadas para suportes de titânio por meio da técnica de Langmuir-Blodgett. Estes filmes foram utilizados como matrizes para o crescimento de hidroxiapatita biomimética após a exposição dos discos de titânio modificados a uma solução que simula a concentração de íons e pH do plasma sanguíneo humano. As amostras foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia de força atômica (AFM), espectroscopia vibracional na região do infravermelho (FTIR) e difração de raios-X (DRX). A razão molar Ca/P foi determinada por espectroscopia de dispersão de energia de raios-X (EDX). Propriedades dos biomateriais como molhabilidade, rugosidade e energia livre de superfície também foram estudadas. A biocompatibilidade das amostras foi investigada in vitro utilizando-se ensaios de viabilidade de osteoblastos. O colágeno interage com os fosfolipídios na interface água/ar, como evidenciado pelas isotermas de pressão de superfície, obtidas na presença da proteína. Além disso, a estabilidade das monocamadas de Langmuir foi aumentada devido à presença de colágeno na subfase. A incorporação de colágeno e fosfolipídios em filmes Langmuir-Blodgett sobre as superfícies de titânio são fatores determinantes para a formação de filmes inorgânicos altamente organizado, contínuos e uniformes, compostos por nanopartículas de hidroxiapatita biomimética, semelhante à encontrada no osso natural. As modificações nas superfícies aumentaram a proliferação de osteoblasto no titânio indicando que este material não é tóxico a este tipo de célula. / The development potential of biomaterials for bone replacement is guided by the necessity to provide a surface that induces positive biological responses when the material is in contact with the host tissue. For this, it is necessary the study of the chemistry and surface composition and also to understand the physical properties and the structural organization of the natural system which is in contact with the biomaterial. Natural bone is composed by organic compounds, especially protein like collagen, reinforced with minerals, such as hydroxyapatite. The process by which the formation of the inorganic component takes place is named biomineralization. One way to introduce macromolecules in model systems for biomineralization studies is the formation of Langmuir monolayers, which are highly organized monomolecular layers of amphiphilic molecules adsorved at the liquid-air interface. These monolayers can be transferred to solid substrate to form the Langmuir-Blodgett films. In this study, it was investigated the incorporation of type-I collagen in insoluble Langmuir monolayers containing either 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) or octadecylphosphonic acid (OPA) and their transference to titanium supports using the Langmuir-Blodgett technique. These films were used as matrices to the growth of biomimetic hydroxyapatite by the exposure of the modified titanium discs to a solution that mimics the ions concentration and pH of the human blood plasma. The samples were characterized by scanning electron microscopy (SEM), atomic force microscopy (AFM), vibrational spectroscopy in the infrared region (FTIR), and X-ray diffraction (XRD). The Ca/P molar ratio was determined by energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS). The properties of the biomaterials as wettability, roughness, and surface free energy were also studied. The biocompatibility of the samples was studied in vitro using osteoblasts viability assays. The collagen interacts with the phospholipids at air/water interface as evidenced by the pressure surface-surface area isotherms obtained in the presence of the protein. Moreover, the stability of the Langmuir monolayers was increased when collagen is present at the subphase. The incorporation of collagen and phospholipids on the titanium surfaces is important to the formation of organized, continuous and uniform inorganic films composed by biomimetic hydroxyapatite nanoparticles, similar to that found in the natural bone. These films are not toxic to osteoblasts as evidenced by the stimulation of their proliferation on the titanium-modified samples.

Este trabalho descreve a preparação, caracterização e mecanismos de interação de compósitos de colágeno aniônico:ramsana, com o propósito de desenvolver géis injetáveis para correções plásticas com concentrações similares aquelas encontradas comercialmente, e sem o uso do glutaraldeído. Os materiais foram caracterizados por eletroforese, espectroscopia no infravermelho, estabilidade térmica, propriedades reológicas e ensaios de fluidez. Os materiais obtidos independentemente do processamento, são formados por colágeno não desnaturado, com preservação da estrutura secundária da proteína. Os estudos reológicos mostraram um comportamento viscoelástico para todas as preparações independentemente do pH, e com módulo de armazenamento sempre maior que o módulo de perda (G\'>G\" e d<45o), bem como uma maior resistência à deformação de géis de colágeno aniônico:ramsana equilibrados a pH 7,4 com relação aos géis equilibrados a pH 3,5. Medidas de viscosidade mostraram que além de um comportamento não newtoniano, a adição do polissacarídeo mesmo em baixas concentrações promove efeitos significativos sobre a viscosidade dos géis, indicando que a interação colágeno ramsana além de não comprometer a estrutura secundária do colágeno, sugere que esta interação ocorre provavelmente por ordenação da água ao redor do complexo formado. Já viscosidade dinâmica encontradas para as diferentes preparações, indicam que os compósitos obtidos são candidatos potenciais para serem utilizados em laringologia. Ensaios de fluidez mostraram que a força necessária para o escoamento de géis contendo ramsana foi sempre significativamente menor e com um perfil mais homogêneo do que aquela determinada para o colágeno aniônico, sugerindo que a associação colágeno aniônico:ramsana pode substituir com vantagens o glutaraldeído na estabilização das preparações comerciais do gel. / This work describes the preparation, characterization and mechanisms of interaction anionic collagen:rhamsam composites, with the purpose of developing injectable gels for plastic corrections with similar concentrations to the commercially founded without the use of glutaraldehyde. The materials were characterized by electrophoresis, infrared spectroscopy, thermal stability, rheological properties and fluidity tests. The materials obtained independently from processing are formed by no desnaturated collagen with the preservation of secondary structure protein. The rheological studies showed a viscoelastic behavior for all the preparations independently of pH, and with storage modulus always greater than the loss modulus (G’>G’’ and d<45o), as well a higher resistence to the deformation of anionic collagen:rahamsan gels equilibrated at pH 7.4 in relation to the gels equilibrated at pH 3.5. Measure of viscosity showed that besides a non Newtonian behavior of the polysaccharide addition even at low concentrations causes significant effects on the viscosity of the gels, indicating that collagen:rhamsan interaction probably occurs due to the water disposition around the complex already formed and it does not damage the secondary structure of the collagen. On the other hand, dynamic viscosity found for different preparations indicate that the composites obtained are potential candidates to be utilized in laringology. Flow experiments indicated that the force needed for the extrusion for anionic collagen:rhamsan composites, in comparison to anionic collagen, was significantly smaller and associated with a smooth flow, suggesting that the collagen anionic:rhamsan association can substitute glutaraldehyde with advantage in the stabilization for the gels commercial preparations.

A utilização e o desenvolvimento de biomateriais para a regeneração tecidual são de grande importância, principalmente para a área médica e odontológica. Matrizes de colágeno derivadas de tecidos de origem animal são utilizadas devido o colágeno apresentar características como biodegradabilidade e biocompatibilidade. Essas matrizes podem ser obtidas a partir de várias fontes, sendo uma delas o pericárdio porcino, que apresenta vantagens como grande disponibilidade, baixo custo, fácil obtenção e possibilidade de sofrer modificações químicas. Além disso, tecidos de origem suína são muito similares aos tecidos humanos, podendo ser utilizados para a produção de biomateriais para a regeneração de tecido mole. Este trabalho teve como objetivo a preparação de membranas acelulares derivadas de pericárdio porcino por hidrólise alcalina em diferentes tempos, para posterior utilização em engenharia de tecido. As membranas de colágeno foram obtidas por hidrólise alcalina de pericárdio porcino durante 4, 8, 12 e 24 h e caracterizadas por análise histológica, microscopia eletrônica de varredura (MEV), avaliação da citoxicidade in vitro, estabilidade biológica in vitro (colagenase), titulação potenciométrica, porcentagem de absorção de água, calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TG), análise térmica dinâmico-mecânica (DMTA) e ensaios de tração. A análise histológica mostrou que após 4h de hidrólise as células foram removidas das membranas. A avaliação da citotoxicidade in vitro mostrou que as membranas preparadas neste trabalho não são citotóxicas. Os ensaios de estabilidade biológica in vitro por colagenase mostraram que as membranas hidrolisadas degradaram mais rapidamente que a não hidrolisada e, quando comparadas com matrizes derivadas de pericárdio bovino, as derivadas de pericárdio porcino foram mais resistentes à degradação por colagenase. A titulação potenciométrica possibilitou determinar o número de grupos carboxílicos das membranas e o incremento desses grupos por molécula de colágeno. Os resultados mostraram que houve um aumento no número de grupos carboxílicos tituláveis nas membranas hidrolisadas e, consequentemente, houve um aumento do número de cargas negativas incorporadas na molécula de colágeno. As membranas hidrolisadas apresentaram uma maior absorção de água, uma diminuição das temperaturas de desnaturaçãoe e menor estabilidade térmica em função do aumento do tempo de hidrólise. Os ensaios de tração mostraram que após a hidrólise alcalina as membranas apresentaram maiores valores de resistência à tração e que a deformação é dependente do tempo de hidrólise alcalina. Esses resultados mostraram que a preparação de membranas de colágeno derivadas de pericárdio porcino com diferentes tempos de hidrólise alcalina é um procedimento viável para ser utilizado na produção de biomateriais para engenharia de tecido. / The use and development of biomaterials for tissue regeneration are of great importance, especially for medical and dental care. Collagen matrices derived from animal tissues are widely used because collagen has characteristics such as biodegradability and biocompatibility. These matrices can be obtained from various sources, such as porcine pericardium, which is a tissue that can be used due its low cost, wide availability and because it can be chemically modified. Besides, porcine tissues are very similar to human tissue and can be used to produce biomaterials for soft tissue regeneration. The aim of this study was the preparation and characterization acellular membranes by alkaline hydrolysis of porcine pericardium. Membranes were characterized by histological analysis, scanning electron microscopy (SEM), in vitro cytotoxicity evaluation, in vitro biological stability (collagenase), potentiometric titration, water absorption percentage, differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG), dynamic mechanical thermal analysis (DMTA) and tensile tests. Histological analysis showed that after 4h of hydrolysis, cells were totally removed from matrices. In vitro cytotoxicity showed that all matrices prepared in this work are not cytotoxic. In vitro biological stability tests (collagenase) showed that the hydrolyzed membranes degraded more quickly than the non hydrolized matrix and more resistant to collagenase degradation when compared to matrices derived from bovine pericardium. The potentiometric titration allowed the determination carboxylic groups and the increase of these groups per collagen molecule. Hydrolyzed matrices had an increase in water absorption, a decrease in denaturation temperature and a small decrease in thermal stability with the increase of hydrolysis time. Tensile tests showed that after alkaline hydrolysis matrices showed higher tensile strength and the deformation was independent of the time of alkaline hydrolysis. These results showed that the preparation of collagen biological matrices derived from porcine pericardium with different times of alkaline hydrolysis is a viable procedure to be subsequently used in the production of biomaterials for tissue engineering.

As lesões cutâneas e queimaduras são considerados os principais causadores de danos e perdas dos tecidos moles. Em casos severos de trauma, os processos naturais de regeneração são insuficientes no reparo dos danos, resultando em lesões cutâneas crônicas. A desvitalização de matrizes homólogas ou heterólogas é uma alternativa para a produção de matrizes dérmicas. A pele porcina é bastante similar à pele humana, podendo ser utilizada como matriz de colágeno na regeneração de tecido mole. Além disso, ela tem como constituinte principal o colágeno tipo I, e, assim, pode ser utilizada em queimaduras de segundo grau. Este trabalho teve como objetivo a preparação e caracterização de matrizes extracelulares de colágeno tipo I por meio de hidrólise alcalina e reticulação com glutaraldeído (GA). As matrizes de colágeno foram obtidas a partir da hidrólise alcalina de pele porcina, com posterior reticulação com GA, em diferentes concentrações (0-0,1%) e tempos de reação (15 e 45 min). As matrizes foram caracterizadas através de determinação do conteúdo de elastina, estabilidade biológica (tripsina), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), termogravimetria (TG/DTG), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e citotoxicidade in vitro. Através da determinação do conteúdo de elastina, foi possível determinar a massa média de colágeno presente nas matrizes, a qual foi de 95,2?0,2% (m/m), e a massa média de elastina, que foi de 4,8?0,2% (m/m), e também verificar que independente do tratamento, a elastina estava presente nas matrizes. O ensaio de estabilidade biológica mostrou que o tratamento com GA diminui a biodegradação do material; sendo obtidos porcentagens de degradação que variaram de 83,6%?1,1 (0% GA) a 46,1%?0,7 (0,085%-45min), indicando, assim, que com o aumento da concentração de GA e do tempo de reação, há uma diminuição da porcentagem de degradação. Pela análise termogravimétrica, foi observado que o colágeno presente nas matrizes tornou-se mais estável termicamente em conseqüência do aumento do grau de reticulação e, portanto, mais resistentes à degradação térmica. Os resultados de DSC confirmam os de termogravimetria devido ao aumento nos valores das temperaturas de desnaturação das matrizes em função do aumento do tempo de reação e da concentração de GA. Pela análise das fotomicrografias, pôde ser observado que após a reticulação com GA, as fibras de colágeno tornam-se mais organizadas e definidas; e essa definição torna-se maior com o aumento da concentração de GA. Os resultados de citotoxicidade in vitro mostraram que as matrizes analisadas são citotóxicas possivelmente devido a gordura remanescente, sendo necessário a realização de um pré-tratamento. Assim, a preparação de matrizes derivadas de pele porcina com diferentes tempos de degradação, as quais podem ser utilizadas na reconstrução de tecidos moles, é viável. / Cutaneous lesions and burns are considered the main causes of damage of soft tissues. In severe cases of trauma, the natural processes of regeneration are insufficient in the repair of the damage, resulting in chronic cutaneous lesions. Desvitalization of homologous or heterologous matrices is an alternative for the production of dermal matrices. The porcine skin is quite similar to the human skin and can be used as collagen matrix in soft tissue regeneration. Besides, it contains type I collagen as the main constituent and thus, it can be used in second degree burns. The objective of this work was the preparation and characterization of type I collagen extracellular matrices with alkaline hydrolysis and glutaraldehyde (GA) crosslinking. The collagen matrices were obtained from the alkaline hydrolysis of porcine skin, with subsequent GA crosslinking, in different concentrations (0 - 0,1%) and reaction time (15 and 45 min). Matrices were characterized by determination of the elastin content, biological stability (trypsin), differential scanning calorimetry (DSC), termogravimetry (TG/DTG), scanning electron microscopy (SEM) and a preliminar assay of in vitro cytotoxicity. Elastin and collagen content were 4,8±0,2% (m/m) and 95,2±0,2% (m/m), respectively. Biological stability results showed that GA crosslinking reduces matrix biodegradation; as degradation varied from 83,6%±1,1 (0% GA) to 46,1%±0,7 (0,085% - 45min), demonstrating, thus, that with the increase of GA concentration and reaction time, there was a decrease of degradation. For termogravimetric analysis it was observed that the collagen present in the matrices become termically more resistant as a consequence of the increasing crosslink degree and, therefore, more resistant to thermal degradation. DSC results, similar to termogravimetric ones, showed an increase in denaturation temperatures as a function of increasing reaction time and GA concentration. SEM analysis showed that after the GA crosslinking, collagen fibers become more organized and defined; and that definition improved with increasing GA concentration. Preliminar assay of in vitro cytotoxicity showed that treated matrices are cytotoxic possibly due to remaining fat, being necessary the accomplishment of a pre-treatment. Therefore, porcine skin matrices preparation with different degradation times, which can be used in the soft tissue reconstruction, are viable.

Foram avaliados o direcionamento e as características das fibras colágenas ao redor de dois diferentes tipos de implantes, cone Morse e hexágono externo. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética no ensino e pesquisa em animais da Faculdade de Odontologia de Bauru, recebendo o protocolo de número 03/2008. Foram instalados 42 implantes em sete cães, sendo 14 do tipo hexágono externo (Osseotite - 3i, USA ) e 28 do tipo Cone Morse ( Titamax EX CM Neodent, Brazil ), todos receberam componentes protéticos, seguindo o protocolo de carga imediata, após 4 meses, todos os animais foram sacrificados e as amostras coletadas e processadas pelo sistema Exakt. Para a avaliação do direcionamento das fibras colágenas foram avaliadas 18 amostras, que foram observadas em um microscópio óptico, sobre a influência de luz polarizada. No grupo hexágono externo foram encontradas fibras colágenas oriundas do epitélio alveolar correndo paralelamente a superfície do implante e seu componente protético, em algumas amostras se uniam a outros grupos de fibras e se direcionavam a região das roscas do implante. Foram encontradas fibras que poderiam ser classificadas como perpendiculares em apenas 3 amostras, localizadas abaixo da plataforma protética, não foram observados sinais de inserção das fibras nas regiões do cilindro de proteção ou componente rotético, apenas abaixo da plataforma do implante. Ao redor das amostras do grupo cone morse, foram encontrados grupos de fibras que corriam paralelamente a superfície do componente protético, em direção a plataforma do implante. Em 6 amostras deste grupo, foram observadas fibras que foram classificadas como obliquas ou perpendiculares, distribuídas lateralmente a região mais profunda do componente protético, apresentando sinais de inserção, não foram observadas fibras se inserindo diretamente ao implante. Quando observamos os valores correspondentes aos dois grupos avaliados, podemos observar a maior predominância de fibras classificadas como paralelas-obliquas no grupo I, com 16 amostras, duas outras amostras deste grupo poderiam ser classificadas como obliquas. No grupo III, a maior predominância das amostras se encontram classificadas como obliquas, com 11 amostras, outras 5 amostras deste grupo podem ser classificadas como obliquasperpendiculares, o grupo Cone Morse apresentou um valor de 70,20 graus para a face vestibular e 54,73 graus para a face lingual, o grupo Hexágono externo, apresentaram valores médios de 19,88 graus para a face vestibular e 21,92 graus para a face lingual. Baseado na metodologia empregada e nos resultados encontrados, podemos concluir que o tipo de interface protética parece influenciar o comportamento do tecido conjuntivo e que a maior estabilidade fornecida pelos implantes que utilizam interface cônica, parece permitir a inserção de fibras de colágeno diretamente ao componente protético, proporcionando uma melhor estabilidade tecidual e proteção aos implantes. / This study aims to evaluate the presence and orientation of the collagen fibers around two different implant types. 42 implants were installed in seven dogs, 14 external hexagon (Osseotite - 3i, USA) and 28 cone morse (CM Titamax EX - Neodent, Brazil), all received prosthetic components, following the immediate loading protocol. After 4 months of healing, the animals were sacrificed and samples were collected and processed for histological evaluation by means of Exakt processing system. To assess the direction of collagen fibers, 10 samples from each group were evaluated in an optical microscope, under the incidence of polarized light. In the external hexagon group were found collagen fibers derived from alveolar epithelium running parallel to the implant and his prosthetic component, in some samples these fibers joined with other groups and drove to the implant threads. Were found Fibers that could be classified as perpendicular in only three samples, located below the implant platform, no insertion signals were observed on cylinder of protection or prosthetic component, just below the implant platform. Around the morse taper group samples were found groups of fibers that ran parallel to the surface of the prosthetic component toward the implant platform. In six samples of this group, were observed fibers that were classified as oblique or perpendicular, laterally distributed to the deepest region of the prosthetic component, showing signs of insertion, were no observed fibers inserting directly to the implant surface. When we look at the values corresponding to both groups, we can observe the predominance of fibers classified as parallel-oblique on group I, with 16 samples, two other samples of this group could be classified as oblique. On group III, the highest prevalence of the samples are classified as oblique, with 11 samples, five other samples of this group can be classified as oblique-perpendicular, the morse taper group showed a mean value of 70.20 degrees to the buccal and 54,73 degrees to the lingual, external hexagon group presented mean values of 19.88 degrees to Buccal and 21.92 degrees to lingual. Based on the methodology used and results, we conclude that the type of prosthetic interface appears to influence the behavior of the tissue and that the stability provided by the implants using conical interface, seems to allow the insertion of collagen fibers directly to the prosthetic component, providing better tissue stability and protection to the implants.