La matrice extracellulaire joue un rôle très important dans la régulation de l’angiogenèse en procurant un support dans la formation des vaisseaux, en délivrant des facteurs endogènes pro- ou anti-angiogéniques. Nous avons montré que l’hypoxie induit une surexpression du gène COL5A1 dans les cellules endothéliales. Le laboratoire a identifié un fragment issu du collagène V, noté HEPV, qui contient un site de liaison à l’héparine, et qui montre des propriétés anti-angiogéniques remarquables. En effet, ce fragment est capable d’inhiber la prolifération et la migration des cellules endothéliales vasculaires et leur maturation en tubes endothéliaux. Les résultats obtenus montrent qu’HEPV est capable d’empêcher la phosphorylation de ERK1/2 et de Akt induite par le FGF-2 et donc la réponse aux stimuli mitogènes induits par FGF-2. De plus, une étude transcriptomique réalisée sur des cellules endothéliales traitées ou non par HEPV a révélé que HEPV est capable d’induire l’expression de COL4A1 et COL18A, gènes codant pour des collagènes qui peuvent aussi être clivés et libérer des facteurs anti-angiogéniques. Finalement, nous avons utilisé un modèle d’angiogenèse murin afin de valider in vivo l’activité anti-angiogénique d’HEPV. Ces expériences montrent que le peptide injecté en intraveineuse s’accumule au site d’angiogenèse en se fixant sur les vaisseaux en formation, et est capable d’inhiber l’angiogenèse induite par le FGF-2, alors qu’un peptide contrôle muté sur le site de liaison à l’héparine n’a aucun effet. Ce peptide est capable également d’inhiber efficacement l’angiogenèse tumorale, une inhibition qui se traduit par un ralentissement de la croissance de la tumeur / The basement membrane plays an important role in angiogenesis by providing support necessary for blood vessel formation and supplying endogenous pro- and anti-angiogenic factors that condition the endothelial cells behavior. CoLV is present at the vicinity of endothelial cell basement membrane? We previously showed that a fragment derived from COLV a1, named HEPV, contains a functional heparin binding site, inhibits specifically endothelial cell proliferation and migration and disrupts endothelial tube formation. Prolonged treatment with HEPV results in the activation of collagen IV a1 and collagene XVIII a1 expression, the parental molecules of the anti-angiogenic fragments arresten and endostatin respectively. Heparin binding sites have been involved in the regulation of FGF2-induced angiogenesis. Soluble HEPV significantly inhibits phosphorylation of ERK1/2 and AKT in FGF2-stimuled endothelial cells. Moreover, in vivo experimentation using the mouse angiogenesis subcutaneous sponge assay shows that HEPV accumulates at angiogenic sites and inhibits FGF-2-induced angiogenesis. HEPV also significantly lowers intra-tumoral angiogenesis and tumor xenograft growth in nude mice. We also showed that hypoxia, the major angiogenesis-inducing factor, induces Collagen V production by endothelial cells and the release of a fragment encompassing HEPV into the culture medium. Finally, the released of HEPV-containing fragments in vivo was attested by the immunodetection of the fragment with specific antibodies in human breast cancer in which collagen V is overexpressed. Collectively, our results qualify HEPV as a new endogenous regulator angiogenesis with possible application in cancer therapy

Le cancer colorectal (CCR) demeure l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Récemment, une nouvelle immunothérapie basée sur le ciblage du récepteur à activité tyrosine kinase (RTK) EGFR via l'anticorps cetuximab a montré une amélioration significative de la survie des patients atteints de CCR métastatique (CCRm). Cependant, une grande partie de ces patients présente une résistance qui est associée à la présence de mutations gains de fonction dans la voie de signalisation Ras. Dans ce contexte, l'identification de cibles thérapeutiques Ras-indépendantes pourrait avoir un intérêt particulier. Une analyse pharmacologique effectuée au laboratoire démontre que le nilotinib, un inhibiteur de la TK oncogénique BCR-ABL utilisée en clinique pour le traitement des leucémies myéloïdes chroniques, affecte également les propriétés invasives et métastatiques de cellules de CCR. Nous avons identifié la cible majoritaire de cet inhibiteur dans cette réponse tumorale : il s'agit de DDR1, un récepteur au collagène ayant une activité TK intrinsèque. Mon travail de thèse a mis en évidence que DDR1 est fréquemment et fortement activé dans les métastases de patients atteints de CCR. J'ai ensuite analysé la signalisation DDR1-dépendante dans ces cellules tumorales par phosphoprotéomique quantitative. Cette analyse montre la nature Ras-indépendante de cette signalisation et révèle la protéine de signalisation BCR comme un nouveau substrat essentiel de DDR1 pour induire l'invasion cellulaire. Enfin, je montre que l'inhibition de DDR1 par le nilotinib améliore la réponse au cetuximab y compris pour les cellules tumorales ayant une mutation oncogénique de K-Ras ou B-Raf. En conclusion, ces résultats suggèrent que le ciblage de DDR1 par le nilotinib pourrait avoir un intérêt thérapeutique dans le traitement des CCRm. / Colorectal cancer (CRC) is one of the leading causes of cancer-related death in the Western world. Cancer that metastasizes to distant sites is usually not curable, although chemotherapy can extend survival. Recently, a novel immunotherapy approach based on targeting the EGFR tyrosine kinase (TK) via the antibody cetuximab was shown to significantly improve the survival of patients with metastatic CRC (mCRC). However, only patients with wild-type KRAS may hope to gain from EGFR inhibition. The majority of patients expresses oncogenic K-Ras alleles and thus have hyperactive Ras cascade operating independently from EGFR. Therefore, there is an urgent need for discovery of a new Ras-independent target that regulates tumor cell invasion and metastasis in mCRC. A pharmacological approach in the lab revealed that the small inhibitor of the leukemic TK BCR-Abl also inhibits invasive and metastatic abilities of CRC cells. This effect was also observed in cells expressing deregulated KRAS signalling. We next identified the receptor for collagen and atypical TK DDR1 as that the main target of nilotinib in these cells. Accordingly, DDR1 was found frequently and strongly activated in metastatic nodules of CRC patients. I also characterized DDR1 signalling by quantitative phosphoproteomic. This analysis revealed the Ras-independent nature of DDR1 signalling but also the Rho GTPase regulator BCR as an essential DDR1 substrate that leads to cell invasion. Finally, I demonstrate that nilotinib potentiates cetuximab response in CRC cells expressing oncogenic K-Ras signaling. Overall, these results suggest that the targeting of DDR1 by nilotinib may be of therapeutic value in mCRC.

La fonctionnalisation des biomatériaux est une stratégie probante et prometteuse développée pour favoriser l’intégration de biomatériaux dans un organisme vivant. Le dépôt de films multicouches de polyélectrolytes est une méthode de fonctionnalisation de surfaces particulièrement adaptée au recouvrement d’implants. Ces surfaces modifiées pourront ainsi interagir avec leur environnement biologique. Au cours de ce travail de thèse, nous avons développé un nouveau revêtement, à base de composés naturels, capable de recouvrir plusieurs types de surfaces. De plus, ces revêtements originaux peuvent être utilisés pour orienter certains phénomènes cellulaires. Dans la première partie de ce travail de thèse, nous avons mis au point un nouveau système de films multicouches à base de collagène et d’alginate. La réticulation chimique avec la génipine, un agent naturel d’origine végétale (Gardenia Jasminoide), stabilise ces constructions pour une utilisation en conditions physiologiques. Les études d’adhérence et de prolifération de cellules endothéliales humaines ont montré que ces revêtements à base de constituants naturels sont des supports adéquats en vue d’applications biomédicales. Nous avons ensuite déposé des films collagène/alginate sur des implants en titane précédemment recouvert d’un gel microporeux en poly(acide lactique). Nous avons pu montrer que les films collagène/alginate favorisent la prolifération de cellules épithéliales, ce qui permettrait une meilleure intégration des implants. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons développé une technique permettant d’obtenir des revêtements et des membranes à base de films multicouches collagène/alginate ayant des structures fibrillaires orientées. L’alignement fibrillaire s’obtient par simple étirement des substrats élastiques en poly(diméthyl siloxane) (PDMS) sur lesquels sont déposés les revêtements collagène/alginate. La déformation longitudinale du substrat induit un alignement préférentiel des fibrilles de collagène du revêtement. L’étude de l’influence du taux d’étirement sur l’alignement des fibres a montré qu’il était possible de moduler cet alignement. Enfin, nous avons observé que le comportement de différents types cellulaires (fibroblastes et astrocytes) est modifié par l’alignement fibrillaire. On note que les cellules s’alignent dans la même direction que les fibrilles de collagène. A l’évidence, l’organisation fibrillaire du revêtement conditionne la géométrie de l’étalement cellulaire. Les cellules s’allongent lorsque les fibrilles sont alignées. De plus, il apparaît que la direction des divisions cellulaires est guidée par la direction de l’alignement des fibrilles de collagène dans le revêtement étiré. Cela signifie que les cellules sont guidées par les fibrilles de collagène alignées. / Biomaterial functionalization is a promising strategy developed to favor material implantation in a living organism. The deposition of polyelectrolyte multilayer films is a useful functionalization technique to coat implants. These modified surfaces may then interact with their biological environment. In this work, we developed new collagen-based coatings and membranes, able to cover several kinds of substrates. Moreover, these original coatings can either promote cell proliferation or guide cell alignment.In the first part of our work, we developed a new polyelectrolyte multilayer assembly made of collagen and alginate. Chemical cross-linking with a natural agent, genipin (extracted from Gardenia Jasminoide), renders the films stable in physiological conditions. Human endothelial cells adhere and proliferate well on these collagen-based coatings. Then, we functionalized macroporous poly(lactic acid) gels-coated titanium implants with collagen/alginate multilayer films to favor epithelial cell proliferation. We showed that cells adhere and proliferate better on collagen/alginate-coated implants. This shows the potential suitability of collagen/alginate coatings for a better integration of biomaterials.In the second part of our work we developed a new technique in order to align the fibrillar structure of collagen/alginate multilayer films and membranes. The principle is simple and versatile. It consists in stretching collagen/alginate multilayer film coated on PDMS substrates. This longitudinal deformation leads to the alignment of the collagen fibrils in the coating. Cell adhesion and proliferation (fibroblasts, astrocytes) is modified due to fibrils alignment. We showed that cells align along the direction of the collagen fibrils. Obviously, the fibrillar organization of the coatings influences cell adhesion geometry. Cells stretch out along aligned fibrils. Furthermore, it appears that cell divisions direction is guided by the direction of the collagen fibrils alignment in the stretched coatings.

Les travaux réalisés ont pour but de répondre à deux questions : comment le collagène s'organise-t-il dans l'os mature ? Comment la phase minérale de l'os se forme-t-elle et quel est l'effet de son environnement sur sa formation ? Nous avons étudié d'un point de vue structural des coupes d'os en nous concentrant sur l'interface tissu ostéoïde/os mature, impliquant le front de minéralisation. Nous avons conclu qu'un domaine acide fait de collagène non fibrillaire existe à cette interface. Nous proposons ainsi un nouveau mécanisme pour la formation osseuse lors du remodelage osseux impliquant une mésophase acide de collagène au sein de laquelle l'apatite se forme. Nous avons donc étudié l'effet de cet environnement acide sur la formation d'apatite in vitro par Raman in situ et RMN du solide. Nous avons observé que la séquence de précipitation de l'apatite seule en solution passe par la formation d'une phase amorphe (ACP) qui se transforme en OCP puis en apatite. En présence de pAsp, la nucléation est ralentie et de l'OCP est stabilisé. Une grande concentration en citrate inhibe la formation de toute autre phase que l'ACP tandis qu'une plus faible concentration entraine la formation d'apatite directement depuis l'ACP. Cette séquence ACP/apatite est également observée lorsque la minéralisation est réalisée en présence de collagène quelle que soit sa concentration. Le collagène entraine la formation d'une apatite beaucoup plus désorganisée de cristallinité proche de celle de l'apatite osseuse. Enfin, une concentration en collagène supérieure à 80 mg/mL mène à la stabilisation d'une phase ionique stable à pH basique expliquant le co-alignement apatite/collagène. / This work aims to understand: How is reached the plywood architecture in bone? How is bone apatite formed and what is the effect of the environment on apatite formation? Thus, histological bone thin sections were investigated focusing on the interface between the osteoid and mature bone tissues. Our results show that this interface is acidic and collagenic but not in the form of fibrils. Thus, we propose a new mechanism for bone formation in bone remodelling where osteoclasts dissolution and new fibrils formation from osteoblasts lead to the formation of an acidic collagen mesophase in which apatite is then formed. In such mechanism, apatite forms from an acidic solution in interaction with an organic matrix (collagen molecules, citrate and non-collagenous proteins). Acidic biomimetic models have been set and the apatite formation has been followed in vitro using in situ Raman and ssNMR spectroscopies. Without organic molecules, biomimetic apatite is formed through the precipitation of an amorphous phase (ACP) that transforms into OCP which then turns into apatite. With pAsp, the same scenario is observed but the nucleation is delayed and residual OCP is stabilized. With a high concentration of citrate, only ACP is observed whereas with a lower concentration formation of OCP is inhibited. The same sequence is also observed with collagen but the final product is a more disorganized apatite. Apatite formation in dense and organized collagen solutions leads to the formation of a liquid ionic solution stable at basic pH during the first 72 hours explaining the resulting apatite/collagen co-alignement.

Les propriétés rhéologiques de suspensions cellulaires (CHO) et tissus sont étudiées. La concentration varie sur une large gamme. En particuIier, nous avons caractérisé l'écoulement et les propriétés viscoélastiques. Le seuil d'écoulement et le module de plateau élastique varient avec la concentration et sont décrits par un modèle de structures fractales en écoulement. Ces effets sont reliés à des paramètres microscopiques.<br />Un tissu modèle est ensuite réalisé, en incluant ces cellules dans une matrice de collagène. Pour mesurer les changements structurels, la microscopie confocale est utilisée. Un phénomène nouveau est observé, la diminution de la rigidité du gel, en présence de cellules. En effet, les cellules s'allongent dans le gel et peuvent le remodeler, en fonction de la concentration : l'adhésion des cellules est facilitée lorsque la concentration en collagène est importante, mais l'espace est restreint. Ces deux effets s'opposent mais expliquent les comportements observés.

La microscopie multiphoton est une technique d'imagerie optique dont une des caractéristiques les plus remarquables est de fournir une information micrométrique en profondeur dans les tissus intacts. Un autre intérêt est la possibilité de visualiser la structure d'une cellule ou d'un tissu en utilisant des sources de contraste endogènes qui permettent une imagerie très peu invasive. De plus, divers modes de contrastes tels que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF), la génération de seconde harmonique (SHG) ou la génération de troisième harmonique (THG) sont facilement combinables, et les applications de la microscopie multiphoton sont ainsi nombreuses et variées, dans des domaines comme les neurosciences, la cancérologie, l'embryologie,... Cependant, des progrès sont encore nécessaires dans la compréhension des contrastes optiques non-linéaires endogènes observés dans les tissus. Dans ce contexte, la génération de seconde harmonique par le collagène fibrillaire soulevait différentes questions au début de ce travail, notamment sur la spécificité de la SHG en fonction du type de collagène et sur le rôle de sa structure chirale en triple hélice dans la forte amplitude des signaux observés. L'étude du collagène est particulièrement intéressante car il représente 30 % du contenu total du corps humain en protéines. Constituant principal de la matrice extracellulaire d'une grande variété de tissus et d'organes, le collagène est impliqué dans tout remodelage de la matrice extracellulaire et dans de nombreuses pathologies, mais on manque actuellement d'outils performants pour visualiser son architecture tridimensionnelle à l'échelle micrométrique. Dans ce contexte, la microscopie SHG est un outil prometteur pour visualiser la distribution du collagène dans les tissus. Ce travail de thèse a débuté avec des expériences de génération de seconde harmonique en surface résolue en polarisation sur des films minces de molécules de collagène de type I et IV, qui nous ont permis de démontrer que la microscopie SHG est une sonde de l'organisation macromoléculaire du collagène et non pas du type de collagène. Nous avons appliqué ensuite ces résultats à l'étude de la fibrose collagénique pulmonaire et rénale dans des modèles murins, une accumulation pathologique de collagène fibrillaire qui peut conduire à une insuffisance rénale terminale ou à une insuffisance respiratoire souvent létale à terme. Nous avons démontré que la microscopie multiphoton permet de visualiser la morphologie de ces tissus, de mettre en évidence toutes les caractéristiques de ces pathologies et d'évaluer quantitativement le remodelage de la matrice extracellulaire au cours de l'évolution de la fibrose. Finalement, nous avons proposé des scores de fibrose basés sur des densités volumiques de pixels SHG qui nous ont permis d'apprécier le rôle de certains facteurs (cellules/enzymes d'assemblage) responsables de la fibrose. Ce travail devrait ainsi permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces pathologies fibrosantes.

Dans cette thèse, le problème de l'infiltration de bio-adhésifs résineux dans la dentine a été abordé par le biais de deux études, expérimentale et numérique. L'originalité de ces travaux réside dans le fait que l'échelle à laquelle nous nous sommes placés est nanoscopique. En effet, c'est l'infiltration d'un réseau de fibres de collagène de diamètre de l'ordre de 80nm qui pilote l'adhésion des composites résineux à la dentine. Une étude MEB a été menée pour confirmer et compléter la connaissance actuelle du milieu poreux. Cependant un paramètre manque dans la perspective d'une modélisation géométrique du réseau : la porosité n'est pas connue. Une étude complémentaire du substrat par porosimétrie à intrusion de mercure a donc été menée. La porosité volumique de la dentine déminéralisée est estimée à 55%. Deux tailles de pores sont révélées : la première correspond aux tubules et canalicules (autour de 1micron) et la seconde aux espaces interfibrillaires (autour de 50nm) jamais encore caractérisés de manière volumique. Cette étude permet aussi une investigation méthodologique. La lyophilisation, technique de séchage peu utilisée en odontologie, est évaluée et comparée à la technique de séchage utilisant l'HMDS. La lyophilisation semble être une technique de séchage fiable et convient parfaitement aux essais de porosimétrie. La modélisation géométrique du réseau fibreux est ensuite réalisée : les fibres sont considérées comme des zones à viscosité élevée. Cette modélisation est validée par comparaison des écoulements entre une fibre modélisée implicitement et une autre modélisée plus classiquement. L'orientation des fibres n'étant pas connue quantitativement, il a été choisi de construire trois types de réseau, le plus proche de la réalité (à la vue des images MEB) étant le réseau où les fibres sont disposées aléatoirement. Sa perméabilité a été estimée et validée par comparaison avec différentes études de réseaux fibreux ou non. Enfin, l'avancée du front est abordée de manière dynamique. Les équations d'avancée du front sont mises en place. Les équations de Navier Stokes sont couplées avec une méthode level set : l'interface correspondant au front d'infiltration n'est pas maillé (tout comme les fibres) mais correspond à une isovaleur d'une certaine fonction. Un attention particulière est portée aux conditions aux limites au niveau de la ligne triple et par le biais d'un terme ajouté à la formulation variationnelle, l'angle de contact est fixé. Ici, la principale difficulté est la prise ne compte des fibres qui ont été définies de manière implicite. Cette fois, les fibres sont uniquement le lieu de l'application de la condition aux limites fixant l'angle de contact et ne sont plus des zones de viscosité élevée car cela bloquerait le front. Le problème est résolu pour différentes géométries de réseaux fibreux. Tout d'abord, l'influence de certains paramètres sur des réseaux simples est sondée puis l'infiltration du modèle géométrique complet (réseau fibreux et tubules) est réalisée. Une conclusion cruciale pour les praticiens est mis en avant : augmenter le temps d'infiltration de la résine n'améliore pas l'infiltration. La simulation d'un essai de porosimétrie permet de distinguer deux tailles de pores distinctes et nécessite un ajustement car un décalage en pression par rapport à la courbe expérimentale est observée. L'outil construit permet une approche pédagogique de l'essai de porosimétrie et, après ajustement, pourra permettre la validation de diverses géométries.

Les alliages de Magnésium (Mg) sont une nouvelle génération de matériaux biodégradables ayant une bonne ostéointégration et un module d'élasticité similaire à celle de l'os humain. Ces propriétés rendent ces matériaux attrayant pour produire des implants temporaires pour la réparation osseuse. Toutefois, les alliages Mg se dégradent rapidement in vivo, rendant nécessaire de contrôler leur vitesse de corrosion pour accompagner la régénération tissulaire. Parmi les approches proposées pour réduire la corrosion et la biocompatibilité des alliages Mg, les plus utilisées sont les couches de conversion et les revêtements de surface. Dans ce travail une approche synergique qui combine une réduction du taux de corrosion avec l'amélioration de la biocompatibilité des alliages Mg est proposée. De nouveaux revêtements bicouches ont été déposés sur la surface d'alliages AZ31 et ZE41 : (i) un revêtement de silane-TiO2 déposé par dip-coating et (ii) des couches supérieures de collagène de type I et/ou de chitosane. Le revêtement inférieur a été efficace pour réduire la corrosion des alliages dans un fluide corporel simulé et en milieu de culture. La culture cellulaire in vitro de fibroblastes et ostéoblastes, a révélé que le dépôt additionnel de biopolymères a amélioré la réponse biologique du revêtement de silane-TiO2. Ces résultats montrent qu'il existe un effet combiné des revêtements bicouches et de la composition des alliages sur la réponse à la corrosion et sur le comportement cellulaire. Ce travail apporte donc une nouvelle contribution à la compréhension de l'évolution de la corrosion des alliages Mg dans des environnements biologiques. / Magnesium (Mg) alloys are a new generation of biodegradable materials with good osseointegration and elastic modulus similar to that of human bone. These properties make them attractive materials to produce biodegradable implants for bone repairing applications that require temporary support. However, Mg alloys degrade rapidly in the in vivo environment making necessary to control their corrosion rate to accompany the tissue healing processes. Several approaches have been proposed for reducing corrosion rate and improving biocompatibility of Mg alloys. The most used ones are conversion films and surface coatings. This project proposes a synergistic approach that combines both decreased corrosion rate and improved biocompatibility of Mg alloys: we developed novel bi-layered coatings to functionalize the surface of AZ31 and ZE41 Mg alloys for bone repair applications. First, a bottom silane-TiO2 coating was formulated and deposited on both alloys by the dip-coating technique. The silane-based coating was effective in slowing down the corrosion rate of the substrates in simulated body fluid (SBF) and in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM). Secondly, top layers of type I collagen and/or chitosan were developed. Cell in vitro tests, with fibroblasts and osteoblasts, revealed that the biopolymers enhanced the biological response of the silane-TiO2 coating. Furthermore, the findings showed that there is a combined effect of the bi-layered coatings and the nature of the alloys on their final corrosion response and on the fate of the cells. In the same way, this work contributes to elucidating corrosion processes of Mg alloys in organic solutions in the long-term.

Dans cette thèse, le problème de l'infiltration de bio-adhésifs résineux dans la dentine a été abordé par le biais de deux études, expérimentale et numérique. L'originalité de ces travaux réside dans le fait que l'échelle à laquelle nous nous sommes placés est nanoscopique. En effet, c'est l'infiltration d'un réseau de fibres de collagène de diamètre de l'ordre de 80nm qui pilote l'adhésion des composites résineux à la dentine. Une étude MEB a été menée pour confirmer et compléter la connaissance actuelle du milieu poreux. Cependant un paramètre manque dans la perspective d'une modélisation géométrique du réseau : la porosité n'est pas connue. Une étude complémentaire du substrat par porosimétrie à intrusion de mercure a donc été menée. La porosité volumique de la dentine déminéralisée est estimée à 55%. Deux tailles de pores sont révélées : la première correspond aux tubules et canalicules (autour de 1micron) et la seconde aux espaces interfibrillaires (autour de 50nm) jamais encore caractérisés de manière volumique. Cette étude permet aussi une investigation méthodologique. La lyophilisation, technique de séchage peu utilisée en odontologie, est évaluée et comparée à la technique de séchage utilisant l'HMDS. La lyophilisation semble être une technique de séchage fiable et convient parfaitement aux essais de porosimétrie. La modélisation géométrique du réseau fibreux est ensuite réalisée : les fibres sont considérées comme des zones à viscosité élevée. Cette modélisation est validée par comparaison des écoulements entre une fibre modélisée implicitement et une autre modélisée plus classiquement. L'orientation des fibres n'étant pas connue quantitativement, il a été choisi de construire trois types de réseau, le plus proche de la réalité (à la vue des images MEB) étant le réseau où les fibres sont disposées aléatoirement. Sa perméabilité a été estimée et validée par comparaison avec différentes études de réseaux fibreux ou non. Enfin, l'avancée du front est abordée de manière dynamique. Les équations d'avancée du front sont mises en place. Les équations de Navier Stokes sont couplées avec une méthode level set : l'interface correspondant au front d'infiltration n'est pas maillé (tout comme les fibres) mais correspond à une isovaleur d'une certaine fonction. Un attention particulière est portée aux conditions aux limites au niveau de la ligne triple et par le biais d'un terme ajouté à la formulation variationnelle, l'angle de contact est fixé. Ici, la principale difficulté est la prise ne compte des fibres qui ont été définies de manière implicite. Cette fois, les fibres sont uniquement le lieu de l'application de la condition aux limites fixant l'angle de contact et ne sont plus des zones de viscosité élevée car cela bloquerait le front. Le problème est résolu pour différentes géométries de réseaux fibreux. Tout d'abord, l'influence de certains paramètres sur des réseaux simples est sondée puis l'infiltration du modèle géométrique complet (réseau fibreux et tubules) est réalisée. Une conclusion cruciale pour les praticiens est mis en avant : augmenter le temps d'infiltration de la résine n'améliore pas l'infiltration. La simulation d'un essai de porosimétrie permet de distinguer deux tailles de pores distinctes et nécessite un ajustement car un décalage en pression par rapport à la courbe expérimentale est observée. L'outil construit permet une approche pédagogique de l'essai de porosimétrie et, après ajustement, pourra permettre la validation de diverses géométries. / In dentin restoration, collagen fiber network infiltration is an issue. In this thesis, an experimental study is lead prior to numerical modelling. Demineralized dentin porosity is a key parameter in dentin bonding that will in?uence the hybrid layer quality. Its characterization could be helpful to improve the monomers in?ltration. So, the objectives of the experimental study were to assess demineralized dentin porosity and quantify the different porous features distribution within the material using mercury intrusion porosimetry (MIP) technique. We compared hexamethyldisilazane (HMDS) drying and lyophilization (LYO) (freeze-drying) in sample preparation. The results showed two types of pores corresponding either to tubules and microbranches or to inter-?brillar spaces created by demineralization. Global porosity varied from 59% (HMDS-dried samples) to 70% (freeze-dried samples). Lyophilization drying technique seems to lead to less shrinkage than HMDS drying. FESEM revealed that collagen ?bers of demineralized lyophilized samples are less melted together than in the HMDS-dried samples. Using our experimental data , we have constructed a relevant numerical geometrical model of the network. The specificity of our model is that the fibers are taken into account implicitly using a regularized Heaviside function. This function is either used to set the viscosity or to localize the contact line where capillary forces are applied. A level set technique with respect to fluid infiltration front tracking in five fiber networks using the level set method and Navier-Stokes equations with capillary terms is used to point out efficient critical infiltration parameters. A variational formulation which can be implemented in FEM is proposed both for the infiltration front and the contact line. Because of lack of knowledge on fiber orientation, different configurations were tested through permeability assessment of the whole network. Fiber orientation, interfibrillar space and contact angle influence were investigated. Then a network representing the dentinal porous substrate is infiltrated by a wetting fluid and we came to a useful conclusion : increasing infiltration time will not improve the quality of the bonding. In order to link the numerical and experimental studies, infiltration curves of mercury into the porous network are compared. We used a non-wetting fluid (mercury) to invade the numerical porous network to model the porosimetry test. As mercury do not invade the porous network naturally, an incremental pressure is applied to force it to penetrate the porous medium. The simulation is qualitatively satisfying and enables to point out the porosimetry test limitations in a pedagogical way. Thanks to the simulation, we can see the mercury invading pore spaces: big pores are penetrated first and then small pores (which obviously cannot be seen during the experimental process). Quantitatively, two sizes of pore are detected and their contributions to total porosity are satisfying. Nevertheless, the pore size values have to be ajusted. To conclude, this thesis contributed to the characterization of demineralized dentin. The numerical modeling allows us to point out influencing parameters during capillary infiltration of a fibrous network and to illustrate the porosimetry test process an its limitations. An interesting tool to confirm a geometrical model has been built. The tools that have been built can easily been used to other porous structures.

Le trafic intracellulaire est un processus fondamental qui maintient l'homéostasie cellulaire. Les RAB GTPases sont des régulateurs clés du trafic intracellulaire. RAB6 est la RAB résidente la plus abondante du Golgi. RAB6 est un régulateur clé de l'homéostasie Golgienne. Mon projet de thèse s'est intéressé à l'étude de la fonction de RAB6 dans la sécrétion post-Golgienne. Des études précédentes ont montré que la déplétion de RAB6 inhibe l'arrivée à la membrane plasmique de différents cargos : dans des cellules HeLa, NPY et VSV-G, et TNFα dans les macrophages. Nous avons donc émis l'hypothèse que RAB6 pourrait être un régulateur général de la sécrétion post-Golgienne. A l'aide de cellules MEFs RAB6 KO, nous avons d'abord montré que la sécrétion de toutes les protéines nouvellement synthétisées est inhibée. Pour comprendre les mécanismes entraînant cet effet, nous avons étudié le rôle de RAB6 dans le transport post-Golgien de trois types différents de cargos : GPI-APs (PLAP et CD59), collagen X, une protéine soluble, et une protéine transmembranaire TNFα. Afin de synchroniser le transport de cargos, nous avons utilisé le système RUSH. Ainsi, nous avons montré que RAB6 est présent sur les vésicules post-Golgiennes contenant les 3 types de cargos et que la déplétion de RAB6 affecte leur sécrétion. Les effecteurs de RAB6 sont aussi impliqués: Myosine II dans leur fission du Golgi, KIF5B dans leur transport vers la périphérie cellulaire, ELKS dans leur arrimage à la membrane plasmique. Finalement, nous avons pu montrer que les 3 cargos sont présents dans les mêmes vésicules post-Golgiennes avec RAB6. Ces résultats montrent que RAB6 régule la sécrétion de différents cargos. / Intracellular trafficking is a fundamental process which ensures cell homeostasis. RAB GTPases are key regulators of intracellular trafficking. RAB6 is the most abundant Golgi resident RAB and is a key regulator of Golgi homeostasis. My Ph.D project focused on understanding the function of RAB6 in post-Golgi secretion.Previous reports have shown that RAB6 depletion impairs the arrival at the plasma membrane of different cargoes: in HeLa cells, NPY and VSV-G and TNFα in macrophages. We thus hypothesized that RAB6 could be a general regulator of post-Golgi transport steps. Using MEF cells from RAB6 KO mice, we first showed that the secretion of all newly synthesized proteins is affected. To decipher the mechanisms leading to this inhibition, we have then investigated the role of RAB6 in the post-Golgi transport of three different classes of proteins, GPI-anchored proteins (such as Placental Alkaline phosphatase or PLAP and CD59), collagen X, a soluble protein, and the transmembrane protein TNFα. In order to synchronize transport of newly-synthetized cargoes along the secretory pathway, we used the RUSH system. Here, we show that RAB6 is present on post Golgi vesicles containing the three types of cargo and that RAB6 depletion affects their secretion to the plasma membrane. RAB6 effectors are also implicated: Myosin II for their fission from the Golgi, KIF5B for their transport to the cell periphery, ELKS/RAB2IP2 for their docking with the plasma membrane. Finally, we could show that these three cargoes are present in the same post-Golgi transport carriers with RAB6. Altogether, these results show that RAB6 regulates the secretion of a wide number of cargo proteins.