L’expression des gènes mitochondriaux est grande partie dirigée par des protéines codées dans le noyau et importées dans l’organite depuis le cytosol. Diverses études ont montré que les protéines de la famille PentatricoPeptide Repeat (PPR) jouent un rôle prépondérant et varié dans ce phénomène. Au cours de ma thèse, j’ai déterminé la fonction de deux nouvelles protéines PPR chez Arabidopsis thaliana, nommées MTSF1 (pour Mitochondrial Stability Factor 1) et PPR24. Chacune de ces protéines est impliquée dans l’expression d’un ARNm mitochondrial codant une sous-unité du complexe I de la chaine respiratoire. J’ai montré que la protéine MTSF1 était requise pour stabiliser l’ARN mitochondrial nad4. Le site de liaison de MTSF1 a été déterminé et il correspond aux vingt derniers nucléotides de l’ARN nad4. Nous pensons donc qu’en s’associant à l’extrémité 3’ terminale de cet ARN, la protéine MTSF1 bloque la progression d’exoribonucléases 3’-5’ et stabilise ainsi l’ARN nad4 in vivo. L’étude de la protéine PPR24 nous a conduit à observer qu’elle était essentielle à la traduction de l’ARNm mitochondrial nad7. J’ai pu démontrer que la protéine NAD7 n’était pas synthétisée chez les mutants ppr24 et que cela était associé à l’absence de ribosomes sur l’ARNm nad7. J’ai aussi montré que la protéine PPR24 pouvait se lier spécifiquement à une courte région située au milieu de la 5’ UTR de l’ARN nad7. La modélisation de la 5’ UTR de cet ARN indique que ce site de liaison se situerait à la base d’une structure en tige-boucle pouvant diminuer fortement l’accessibilité au codon initiateur de la traduction de l’ARN nad7. Il est donc possible que la fixation de la protéine PPR24 puisse déstabiliser cette structure en tige-boucle et permettre aux ribosomes mitochondriaux d’accéder plus facilement au codon AUG. L’ensemble de ces études a permis d’apporter des informations essentielles sur la fonction et le mode d’action des protéines PPR dans l’expression génétique mitochondriale chez les plantes. / Gene expression in mitochondria is for the most controlled by nuclear encoded proteins that are from the cytosol into the organelle. Recent genetic and biochemical analysis have revealed that proteins of the PentatricoPeptide Repeat (PPR) family play preponderant and multifarious role in this process. During my thesis, I characterized the function of two novel Arabidopsis thaliana PPR protein called MTSF1 (for Mitochondrial Stability Factor 1) and PPR24. Each of these proteins is involved in the expression of a single mitochondrial gene encoding respiratory complex I subunit. I showed that the MTSF1 protein is essential for the stabilization of nad4 mRNA. The MTSF1 binding site was determined and was shown to correspond to the last twenty nucleotides of nad4 3’ UTR. We propose that, through an interaction with the extremity of nad4 transcript, the MTSF1 protein blocks the progression of 3’ to 5’ exoribonucleases and protects nad4 mRNA from degradation in vivo. PPR24 analysis indicated that this PPR protein is essential for nad7 mRNA translation. I observed that the NAD7 protein is not produced in ppr24 mutants and that this correlated with lack of ribosome loading of nad7 mature mRNA. I also showed that PPR24 binds to a short RNA fragment with high specificity located in the center of nad7 5’ leader. Structural predictions indicated that PPR24 binding site could correspond to the basis of a long stem-loop RNA structure just upstream of the AUG codon, which could prevent the accessibility to the nad7 translation codon. PPR24 binding could destabilize this stem-loop structure and permit a better access of the ribosome to the nad7 translation initiation codon. These findings shed light on the function and the mode of action of PPR proteins involved in mitochondrial gene expression in plants.

Les anticoagulants antivitamines K (AVKs) sont des molécules qui par inhibition de l’activation des PVKDs, empêchent ou retardent la coagulation sanguine. Aujourd’hui, le traitement par AVKs est la première cause d’accidents iatrogènes médicamenteux chez l’homme. Cependant le bénéfice par rapport au risque étant largement supérieur. Elles sont également utilisées dans le contrôle des populations de rongeurs nuisibles. Les AVKs agissent en inhibant l’enzyme VKORC1. Des phénomènes d’hypersensibilité et de résistance aux AVKs sont apparus et plusieurs mutations spontanées ont été découvertes dans le gène vkorc1. Ces mutations ont alors été associées à la résistance sans que ce lien n’ait jamais été démontré. Le travail, présenté dans ce mémoire, a pour objectif de confirmer ou d’infirmer ces liens de causalité. Cette étude a permis de démontrer la responsabilité des mutations Leu120Gln, Leu128Gln et Tyr139Phe, Ser et Cys dans l’apparition du phénotype résistant aux AVKs de 1ère génération chez le rat sauvage. Les propriétés catalytiques expliquent de plus le coût biologique associé à l’apparition de cette résistance chez certaines lignées de rats sauvages. Ainsi, les mutations en position 139 sont responsables d’un détournement de la catalyse avec production majoritaire d’hydroxyvitamine K directement éliminable par l’organisme. Chez l’homme, 29 mutations sur 30 ont été caractérisées. Alors que ces mutations ont été observées chez des patients résistants aux AVKs, la causalité de ces mutations n’a été démontrée que pour 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His). Les autres mutations ne seraient pas responsables du phénotype observé / The antivitamines K (AVKs) are molecules which can be inhibiting the activation of PVKDs, preventing or delaying the blood clotting. Today, the treatment by AVKs is the first cause of iatrogenic accidents medicated in humans. In addition, the benefits are significantly higher than the risk so they are used to control the populations of rodent pests. The AVKs are acting as inhibitor for the enzyme VKORC1. The phenomena of hypersensitivity and the resistance to AVKs have been emerged and several spontaneous mutations have been discovered in the gene vkorc1. These mutations were associated with resistance despite the fact that this link has been never been demonstrated. The objective of this work is to confirm or deny these causal links. This study helps to demonstrate the responsibility of the mutations Leu120Gln, Leu128Gln and Tyr139Phe, Ser or Cys in the emergence of the phenotype resistant to AVKs 1ST generation among the wild rat. The catalytic property explains the biological cost associated with the emergence of this resistance in some strains of wild rats. Thus, the mutations at position 139 are responsible for the misappropriation of the catalysis with majority production of hydroxyvitamine K which is directly consumable by the body. In humans, 29 mutations out of 30 have been characterized. While these mutations have been observed in patients resistant to AVKs, the causality of these mutations has been demonstrated only for 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His) and the other mutations would not be responsible for the phenotype observed

The mammary gland is a dynamic organ that undergoes the majority of its development in the postnatal period in four stages; mature virgin, pregnancy, lactation, and involution. Every stage relies on tightly regulated cellular proliferation, programmed cell death, and tissue remodeling mechanisms. Misregulation of autophagy, an intracellular catabolic process to maintain energy stores, has long been associated with mammary tumorigenesis and other pathologies. We hypothesize that appropriate regulation and execution of autophagy are necessary for proper development of the mammary ductal tree and maintenance of the secretory epithelia during late pregnancy and lactation. To test this hypothesis we examined the role of two genes during development of the mammary gland. Beclin1 (Becn1) is an essential autophagy gene. Since the Becn1 knockout model is embryonic lethal, we have generated a Becn1 conditional knockout (cKO). We used two discrete mammary gland-specific Cre transgenic lines to interrogate the role of BECN1 during development. We report that MMTV-CreD; Becn1fl/fl mice have a hyper-branching phenotype and WAP-Cre; Becn1fl/- mice are unable to sustain a lactation phase. Becn1 mutants exhibit abnormal glandular morphology during pregnancy and after parturition. Moreover, when autophagy is chemically inhibited in vitro, mammary epithelial cells have an increased mean number of lipid droplets per cell. MTOR inhibits autophagy upstream of BECN1; we looked higher in the regulatory pathway for regulatory candidates. It has been well characterized that Tuberous sclerosis complex 1 (TSC1), in a heterodimer with its primary binding partner TSC2, inhibits MTOR signaling via inhibition of RHEB. Using the Tsc1 floxed model we generated a mammary gland specific Tsc1 cKO and found that these mice phenocopy the Becn1 cKO mice, including a gross lactation failure. Tsc1 cKO glands have altered morphology, retained lipid droplets in secretory epithelia, and an overall increase in MTOR signaling. We show that TSC1 and BECN1 are interacting partners, and that the interaction is nutrient responsive. These results suggest that Becn1 and Tsc1 are necessary for proper mammary gland development and differentiation. Furthermore, we have demonstrated a novel murine protein-protein interaction and an important link between regulation of MTOR pathway and regulation of autophagy in a developmental context.

Thesis (Ph.D.)--University of Florida, 2004. / Typescript. Title from title page of source document. Document formatted into pages; contains 100 pages. Includes Vita. Includes bibliographical references.

La voie de signalisation mTORC1 hypothalamique (mammalian target of rapamycincomplexe 1) intègre les signaux hormonaux et nutritionnels. La disponibilité des nutrimentsmodule les espèces réactives derivées de l’oxygène (ROS) qui régulent l’activité des neuronesà propiomélanocortine (POMC). La modulation de la prise alimentaire induite par les ROSpourrait impliquer mTORC1.Des souris C57Bl6J et wild-type (WT) ou invalidées pour S6K1 (S6K1-KO), principaleprotéine cible de mTORC1, ou invalidées pour raptor, protéine clé de mTORC1,sélectivement au niveau des neurones anorexigènes POMC (POMC-raptor-KO) ont ététraitées par injections intracérébroventriculaires (ICV) d’H2O2 ou d’honokiol (piégeur deROS), uniques ou combinées avec un inhibiteur de mTOR (rapamycine) ou un activateur demTOR (leptine).L’H2O2 ICV induit une augmentation de l’activité hypothalamique mTORC1, de l’activationneuronale du noyau arqué, de l’expression des ROS dans les neurones POMC, associée à unediminution de la prise alimentaire et du poids. Cet effet anorexigène est diminué chez lessouris S6K1-KO, chez les C57Bl6J après administration de rapamycine, et chez les POMCraptor-KO.L’honokiol ICV bloque l’effet anorexigène de la leptine, suggérant que cet effet soitdépendant des ROS. La leptine ICV entraine une augmentation des ROS dans les neuronesPOMC des souris C57Bl6J et POMC-raptor-WT, mais pas chez les POMC-raptor-KO.Nos résultats montrent que la régulation de la prise alimentaire induite par les ROS nécessiteune voie mTORC1 fonctionnelle et que l’effet anorexigène de la leptine nécessite uneaugmentation de ROS, mTORC1 dépendante, au niveau des neurones POMC. / The mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) pathway is an importanthypothalamic integrator of nutrients and hormones. Nutrient availability also affects thereactive oxygen species (ROS) in propiomelanocortin (POMC) neurons and regulatesneuronal activity. We hypothesize that modulation of mTORC1 activity mediates ROS effectson food intake.To this purpose, C57Bl6J mice or WT mice and their KO littermates either deficient for themTORC1 downstream target S6K1 or for the mTORC1 component raptor specifically inPOMC neurons (POMC-raptor-KO) were treated with an intracerebroventricular (ICV)injection of the ROS producer H2O2 or the ROS scavenger honokiol, alone or in combinationwith the mTOR inhibitor rapamycin or the mTOR activator leptin.ICV H2O2 induced phosphorylation of S6K1 within the hypothalamus, increased expressionof c-fos, a marker of neuronal activity, in the arcuate nucleus and increased ROS in POMCneurons. These effects were associated with a significant decrease in food intake. Theanorexigenic effect of ICV H2O2 was not seen in S6K1-KO mice, in C57Bl6J mice cotreatedwith rapamycin (an mTOR inhibitor) and in POMC-raptor-KO mice.Similarly, ICV honokiol administration combined with a leptin injection blunted theanorexigenic effect of leptin, suggesting that leptin requires ROS formation to reduce FI. ICVadministration of leptin increased ROS in POMC neurons in C57Bl6J and POMC-raptor-WTmice, but not in POMC-raptor-KO mice.Our results demonstrate that ROS modulators require a functional mTORC1 pathway toregulate food intake and that leptin needs an mTORC1-dependent increase in ROS levels inPOMC neurons to decrease food intake.

Les anticoagulants antivitamines K (AVKs) sont des molécules qui par inhibition de l'activation des PVKDs, empêchent ou retardent la coagulation sanguine. Aujourd'hui, le traitement par AVKs est la première cause d'accidents iatrogènes médicamenteux chez l'homme. Cependant le bénéfice par rapport au risque étant largement supérieur. Elles sont également utilisées dans le contrôle des populations de rongeurs nuisibles. Les AVKs agissent en inhibant l'enzyme VKORC1. Des phénomènes d'hypersensibilité et de résistance aux AVKs sont apparus et plusieurs mutations spontanées ont été découvertes dans le gène vkorc1. Ces mutations ont alors été associées à la résistance sans que ce lien n'ait jamais été démontré. Le travail, présenté dans ce mémoire, a pour objectif de confirmer ou d'infirmer ces liens de causalité. Cette étude a permis de démontrer la responsabilité des mutations Leu120Gln, Leu128Gln et Tyr139Phe, Ser et Cys dans l'apparition du phénotype résistant aux AVKs de 1ère génération chez le rat sauvage. Les propriétés catalytiques expliquent de plus le coût biologique associé à l'apparition de cette résistance chez certaines lignées de rats sauvages. Ainsi, les mutations en position 139 sont responsables d'un détournement de la catalyse avec production majoritaire d'hydroxyvitamine K directement éliminable par l'organisme. Chez l'homme, 29 mutations sur 30 ont été caractérisées. Alors que ces mutations ont été observées chez des patients résistants aux AVKs, la causalité de ces mutations n'a été démontrée que pour 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His). Les autres mutations ne seraient pas responsables du phénotype observé

La plasticité synaptique activité-dépendante forme la base physiologique de l’apprentissage et de la mémoire dépendants de l’hippocampe. Le rôle joué par les différents sous-types d’interneurones dans l’apprentissage et la mémoire hippocampiques reste inconnu, mais repose probablement sur des mécanismes de la plasticité spécifique aux synapses de certains sous-types d’interneurones. Les synapses excitatrices établies sur les interneurones de l’oriens-alveus dans l’aire CA1 exhibent une forme persistante de potentialisation à long terme induite par la stimulation chimique des récepteurs métabotropiques du glutamate de type 1 (mGluR1) [mGluR1-mediated chemical late long-term potentiation (cL-LTPmGluR1)]. Le présent projet de recherche avait pour objectifs d’identifier les sous-types d’interneurones de l’oriens-alveus exprimant la cL-LTPmGluR1 et d’examiner les mécanismes d’induction et d’expression de celle-ci. Nous avons déterminé que la stimulation répétée des mGluR1 induit de la cL-LTPmGluR1 aux synapses excitatrices établies sur le sous-type d’interneurones exprimant le peptide somatostatine (SOM-INs). Des enregistrements électrophysiologiques couplés à des inhibiteurs pharmacologiques et à un knock-out fonctionnel de mammalian target of rapamycin complexe 1 (mTORC1) ont montré que l’induction de la cL-LTPmGluR1 (qui consiste en trois applications de l’agoniste des mGluR1/5, le (S)-3,5-dihydroxyphénylglycine (DHPG) en présence de l’antagoniste des récepteurs métabotropiques du glutamate de type 5 (mGluR5), le 2-méthyl-6-(phényléthynyl)-pyridine (MPEP)) des SOM-INs requiert les voies de signalisation des mGluR1, de extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) et de mTORC1. L’ensemble de nos résultats montre qu’une forme persistante de plasticité synaptique sous-tendue par mTORC1 est induite par la stimulation répétée des mGluR1 dans les interneurones hippocampiques exprimant le peptide somatostatine. La connaissance des mécanismes sous-tendant la cL-LTPmGluR1, couplée à l’utilisation de modèles animal in vivo, rendront maintenant possible le blocage de la cL-LTPmGluR1 dans les SOM-INs et l’examen de son rôle dans l’apprentissage et la mémoire dépendants de l’hippocampe. / Hippocampus-dependent learning and memory are mediated by activity-dependent synaptic plasticity. The role that different subtypes of interneurons play in hippocampal learning and memory remains largely unknown, but likely relies on cell type-specific plasticity mechanisms at interneuron synapses. Excitatory synapses onto CA1 oriens-alveus interneurons show persistent long-term potentiation induced by chemical stimulation of metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) [mGluR1-mediated chemical late long-term potentiation (cL-LTPmGluR1)]. The objectives of this project were to identify the oriens-alveus interneuron subtypes expressing cL-LTPmGluR1 and examine its induction and expression mechanisms. We determined that repeated mGluR1 stimulation induces cL-LTPmGluR1 at excitatory synapses onto the somatostatin-expressing interneuron subtype (SOM-INs). Electrophysiological recordings coupled to pharmacological inhibitors and a functional knock-out of mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) showed that SOM-INs cL-LTPmGluR1 induction (which consisted of three applications of the mGluR1/5 agonist (S)-3,5-dihydroxyphenylglycine (DHPG) in the presence of metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) antagonist 2-methyl-6-(phenylethynyl)-pyridine (MPEP)) requires mGluR1, extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) and mTORC1 signaling pathways. Collectively, our results show that persistent synaptic plasticity mediated by mTORC1 is induced by repeated mGluR1 stimulation in somatostatin-expressing hippocampal interneurons. Knowledge of cL-LTPmGluR1’s underlying mechanisms, coupled to in vivo models, will now make it possible to interfere with SOM-INs cL-LTPmGluR1 and examine its role in hippocampal-dependent learning and memory.

Thymic epithelial cells (TECs) are the main component of the thymic stroma, which supports T-cell proliferation and repertoire selection. Here, we demonstrate that Cbx4, a Polycomb protein that is highly expressed in the thymic epithelium, has an essential and non-redundant role in thymic organogenesis. Targeted disruption of Cbx4 causes severe hypoplasia of the fetal thymus as a result of reduced thymocyte proliferation. Cell-specific deletion of Cbx4 shows that the compromised thymopoiesis is rooted in a defective epithelial compartment. Cbx4-deficient TECs exhibit impaired proliferative capacity, and the limited thymic epithelial architecture quickly deteriorates in postnatal mutant mice, leading to an almost complete blockade of T-cell development shortly after birth and markedly reduced peripheral T-cell populations in adult mice. Furthermore, we show that Cbx4 physically interacts and functionally correlates with p63, which is a transcriptional regulator that is proposed to be important for the maintenance of the stemness of epithelial progenitors. Together, these data establish Cbx4 as a crucial regulator for the generation and maintenance of the thymic epithelium and, hence, for thymocyte development.