Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo125_1.pdf: 8710063 bytes, checksum: 5fa58f68876dbc7851b7d451308b76bb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O bagaço da cana-de-açúcar é um subproduto da indústria sucroalcooleira que é constituído, entre outros açúcares, de celulose, um carboidrato cuja unidade monomérica é a glicose e de hemicelulose, que possui como principal constituinte a xilana cuja unidade monomérica é a xilose. Estes polissacarídeos possuem aplicabilidade na indústria biotecnológica, podendo ser utilizados como substrato para produção de enzimas do complexo celulolítico e a xilanase, enzimas essas que possuem ampla aplicabilidade na indústria biotecnológica, como em processos na indústria têxtil, na extração de componentes do chá verde e de proteínas da soja. A seleção de um fungo filamentoso capaz de produzir quantidade significante de enzimas do complexo celulolítico da xilanase utilizando bagaço de cana-de-açúcar tornará o uso deste substrato viável para produção das citadas enzimas. O objetivo deste trabalho foi selecionar uma espécie de Aspergillus procedente da Coleção de Culturas Micoteca URM, UFPE, para produção de enzimas do complexo celulolítico e da xilanase utilizando bagaço de cana-de-açúcar e selecionar variáveis que influenciam a produção enzimática. Nove linhagens de Aspergillus foram cultivadas em meio contendo bagaço de cana-de-açúcar residual (BCR) e cru (BCC) como fonte de carbono. Após o período de cultivo de cinco dias (30ºC, 90 rpm) o extrato enzimático foi obtido através da centrifugação (5000.g) da cultura. A produção do complexo celulolítico foi avaliada através da atividade de celulases totais, endoglucanase, exoglucanase e celobiase, como também da xilanase. Após a seleção das linhagens foi realizada a seleção de variáveis que influenciam na produção das enzimas do complexo celulolítico e xilanase através de planejamento fatorial fracionário 28-4. As linhagens que produziram enzimas do complexo celulolítico e xilanase nos maiores níveis utilizando bagaço de cana-de-açúcar foram A. phoenicis URM 4924 e A. aculeatus URM 4953 e essas linhagens foram escolhidas para estudo da seleção de variáveis que influenciam a produção das enzimas que degradam celulose e hemicelulose. Todas as oito variáveis (pH, concentração do substrato e inóculo, linhagem de Aspergillus, tipo de bagaço de cana-de-açúcar, tempo de cultivo, agitação e temperatura) apresentaram efeito estatisticamente significo para a produção de enzimas do complexo celulolítico e xilanase. Os níveis em que foram produzidas todas enzimas do complexo celulolítico e xilanase simultaneamente foram: pH 6,0, 168 horas de tempo de cultivo, BCR como substrato para produção das enzimas por A. aculeatus URM 4953. As variáveis que foram determinadas como as que mais influenciam a produção das enzimas do complexo celulolítico e xilanase por Aspergillus foram: pH, tempo de cultivo, tipo de bagaço de cana-de-açúcar e linhagem de Aspergillus. A linhagem A. aculeatus URM 4953 demonstrou ser uma alternativa para a produção de todas as enzimas do complexo celulolítico e xilanase utilizando bagaço de cana-de-açúcar, um substrato de baixo custo que propiciou o crescimento fúngico e a produção enzimática

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5706.pdf: 7869131 bytes, checksum: 3a35e736b3418ca357ef4fc2e657c0af (MD5) Previous issue date: 2013-10-16 / Universidade Federal de Minas Gerais / Enzymes are potent catalysts, but operationally fragile, expensive and soluble. Industrial applications of enzymes, often, are possible only using immobilized enzyme. Nowadays, various studies have been performed aiming to immobilize enzymes onto magnetic carriers, which allow the selective recovery of the derivative by applying an external magnetic field even in complex reaction media containing other suspended solids. There are many studies using magnetic carriers in enzymes immobilization procedures, however there are no commercially available enzymes immobilized onto magnetic materials. In these studies usually are used carriers with not ideal characteristics for applications in industrial processes. The present study aimed to develop new magnetic carriers and methods for immobilization of enzymes in these carriers, penicillin G acylase (PGA) and cellulases have been used as model enzymes. The thesis was divided into five parts, in the first part (Chapter 1) the state-of-art is presented. The second part (Chapter 2) describes the synthesis of magnetic carriers robust, cheap and with good characteristics for applications in bioprocesses. For this purpose were tested the synthesis of silica magnetic microparticles (SMMps) in water-in-oil micro-emulsion using sodium silicate as silica source and superparamagnetic iron oxide nanoparticles as magnetic core. Materials with good magnetic properties, high surface area and mesoporous structure were obtained. SMMps structure was characterized, it was possible to control the final structure of the material according to the synthesis conditions. In the third part of this study (Chapter 3) was evaluated a new concept in enzymes immobilization using magnetic materials. Magnetic tags were co-aggregated with PGA and cross-linked with glutaraldehyde, producing magnetic cross-linked enzymes aggregates (M-CLEAs). Several reaction conditions were tested producing M-CLEAs with different characteristics and strong response to external magnetic fields. Derivatives with good recovered activity and increased thermal and methanol 50% (v/v) stabilities were obtained. M-CLEAs presented superior performance, in comparison with the free enzyme, in penicillin G hydrolysis experiments, being reused for three reaction cycles without loss of activity. In the fourth part of this study (Chapter 4) the immobilization of the Trichoderma reesei cellulolytic complex onto 17 carriers using 60 different immobilization conditions was evaluated. Covalent methods to cellulases immobilization resulted in total loss of the enzymatic activity. The immobilization by adsorption allowed preserving a portion of the enzymatic activity, however, the enzyme was desorbed from the carrier with the increase in the ionic strength. The best results were achieved for adsorption in MANAE-agarose followed by cross-linking with glutaraldehyde. Hydrolysis experiments using insoluble substrates showed that it is possible to hydrolyze such substrates even using immobilized enzyme onto porous carriers. The derivative was reused for ten reaction cycles (hydrolysis of filter paper) saving more than 90% of its activity. Finally, in Chapter 5, the T. reesei cellulolytic complex was immobilized by adsorption onto SMMp activated with amino groups followed by glutaraldehyde cross-linking achieving good results in terms of recovered activity. / Enzimas são potentes catalisadores, porém frágeis operacionalmente, caras e solúveis. Aplicações industriais desses catalisadores, muitas vezes, são possíveis apenas com o uso de enzima imobilizada. Estudos indicam que o uso de suportes magnéticos para imobilizar enzimas pode permitir a recuperação seletiva do derivado através da aplicação de um campo magnético externo mesmo em meios complexos contendo outros sólidos em suspensão. Apesar de existirem muitos estudos empregando suportes magnéticos para imobilização de enzimas, não existem enzimas imobilizadas em materiais magnéticos disponíveis comercialmente. Nestes estudos geralmente são utilizados suportes magnéticos com características não ideais para aplicações em bioprocessos. O presente estudo teve como principal objetivo o desenvolvimento de novos suportes magnéticos e métodos para imobilização de enzimas nestes suportes, a enzima penicilina G acilase (PGA) e celulases foram utilizadas como modelo. O estudo foi dividido em cinco partes, no Capítulo 1 é apresentada uma introdução indicando o estado da arte. O Capítulo 2 apresenta o preparo de novos suportes magnéticos robustos, baratos e com características ótimas para aplicações em bioprocessos. Nesta etapa foi testada a síntese de micro-partículas magnéticas de sílica (SMMps) em micro-emulsão água-em-óleo, empregando silicato de sódio como fonte de sílica e nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro como núcleo magnético. Os materiais obtidos apresentaram excelentes propriedades magnéticas, alta área de superfície e estrutura mesoporosa. A partir da caracterização físico-química e morfológica das SMMps foi possível controlar a estrutura final do material de acordo com as condições de síntese. No Capítulo 3 foi avaliado um novo conceito em imobilização de enzimas empregando materiais magnéticos. Neste estudo etiquetas magnéticas foram co-agregadas com PGA e entrecruzadas com glutaraldeído, gerando agregados enzimáticos entrecruzados com propriedades magnéticas (M-CLEAs). Várias condições reacionais foram testadas rendendo M-CLEAs com diferentes características e com resposta robusta a campos magnéticos externos. Derivados imobilizados com boa atividade recuperada e incremento na estabilidade térmica e frente a metanol 50% (v/v) foram obtidos. M-CLEAs apresentaram desempenho superior ao observado para a enzima livre em experimentos de hidrólise de penicilina G, sendo reutilizados por três ciclos reacionais sem perda de atividade. No Capítulo 4 foi avaliada a imobilização do complexo celulolítico de Trichoderma reesei em 17 suportes, empregando 60 diferentes condições de imobilização. Os experimentos de imobilização realizados empregando técnicas de imobilização por união covalente ocasionaram perda total de atividade enquanto métodos de imobilização por adsorção permitiram conservar boa atividade enzimática, porém a enzima dessorveu do suporte com o aumento na força iônica do meio. Os melhores resultados foram alcançados para adsorção em MANAE-agarose seguido de entrecruzamento com glutaraldeído. Experimentos de hidrólise de substratos insolúveis mostraram que é possível hidrolisar este tipo de substrato mesmo com enzima imobilizada em suportes porosos. O derivado foi reutilizado por dez ciclos (hidrólise de papel filtro) conservando mais de 90% de sua atividade. Por fim, no Capítulo 5, o complexo celulolítico de T. reesei foi imobilizado por adsorção em SMMp ativado com grupos amino seguido de entrecruzamento com glutaraldeído apresentando bons resultados em termos de atividade recuperada.