A inseminação artificial utlizando sêmen criopreservado de garanhões apresenta uma baixa utilização, principalmente pela variabilidade dos resultados e aumento dos custos relacionados à inseminação. Os lipídeos presentes nas membranas plasmáticas dos espermatozóides participam de diversos eventos associados à fertilização e por sofrerem alterações químicas e estruturais durantes os processos necessários à congelação podem estar relacionados a congelabilidade dos ejaculados. Este trabalho foi composto por dois experimentos. O experimento I utilizou amostras de espermatozóides de seis garanhões e seis touros e objetivou avaliar a possibilidade de análise direta das amostras de espermatozóides e o efeito do armazenamento em metanol por um período de 45 dias a -80°C. As amostras foram coletadas, \"lavadas\" por centrifugações sucessivas e armazenadas nos seguintes meios: PBS Ca++ Mg++ Free, Metanol padrão-HPLC e solução 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free e Metanol padrão-HPLC. As amostras em PBS foram analisadas após extração lipídica ou adição de metanol padrão-HPLC previamente à análise. Foi confirmada a possibilidade de análise direta da composição lipídica em MALDITOF, sem necessidade de extração. O armazenamento em metanol ou solução contendo o mesmo não resultou em degradação no período observado, no entanto o armazenamento de amostras previamente extraídas por longos períodos resultaram em resultados alterados. O experimento II utilizou amostras de 16 garanhões, armazenadas em solução 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free e Metanol padrão-HPLC. Os ejaculados de origem destas amostras foram submetidos à congelação e os resultados de análise in vitro de motilidade e morfologia espermática foram relacionados com os dados de composição lipídica através da análise dos componentes principais (PCA). Não foi observada nenhuma relação entre os resultados de análise seminal in vitro e a composição lipídica, apesar de alguns autores encontrarem tal relação, principalmente quanto à relação de determinados ácidos graxos e conteúdo total de fosfolipídeos. Estes autores utilizaram técnicas complexas, impossibilitando a aplicação na rotina veterinária a campo. A facilidade de preparo das amostras para MALDI-TOF torna esta técnica viável para análise de composição lipídica, no entanto novos testes devem ser realizados incluindo um maior número de amostas e dados de fertilidade a campo. / Artificial insemination with stallions\' frozen semen have not been widely used, mainly due to the high variability of field results and the increased cost associated with it. Sperm cell membrane lipids play an important role on several events associated with fertilization. These cells go through structural and chemicals changes during freezing and might participate in the freezeability of ejaculates. This work was composed by two experiments. In Experiment I sperm samples from six bulls and six stallions were collected, \"washed\" through centrifugation and stored at -80° in the following mediums: PBS Ca++ Mg++ Free, Methanol HPLC-standard and a solution 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free and Methanol HPLC-standard. The samples on PBS were analyzed immediately after lipid extraction or after the addition of methanol. These samples were evaluated onthe day after collection and 45 days later for evaluation of the possibility of a direct analyses with methanol and the effect of long periods of storage with methanol on lipid degradation. The possibility of an extraction-free direct MALDI-TOF analysis was confirmed. The storage with methanol did not resulted in lipid degradation for the period studied, however the storage of previously extract samples resulted on irregular spectrums. In Experiment II 16 sperm samples from stallions were collected and frozen. An aliquot of 500µl from each sample was washed through centrifugation and stored with a 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free and Methanol HPLC-standard solution. In vitro sperm analysis of motility and morphology were studied for relations with the lipid profile through a principal components analysis (PCA). It was not observed relation between lipid profile and sperm motility and morphology, as previously reported by others authors. However, these authors methodology were highly complex , making it difficult for field application. MALDI-TOF sample preparation its easy and fast and new test with a larger number of samples and field fertility results may prove this is a viable tool for improving field results with frozen semen artificial insemination.

A inseminação artificial utlizando sêmen criopreservado de garanhões apresenta uma baixa utilização, principalmente pela variabilidade dos resultados e aumento dos custos relacionados à inseminação. Os lipídeos presentes nas membranas plasmáticas dos espermatozóides participam de diversos eventos associados à fertilização e por sofrerem alterações químicas e estruturais durantes os processos necessários à congelação podem estar relacionados a congelabilidade dos ejaculados. Este trabalho foi composto por dois experimentos. O experimento I utilizou amostras de espermatozóides de seis garanhões e seis touros e objetivou avaliar a possibilidade de análise direta das amostras de espermatozóides e o efeito do armazenamento em metanol por um período de 45 dias a -80°C. As amostras foram coletadas, \"lavadas\" por centrifugações sucessivas e armazenadas nos seguintes meios: PBS Ca++ Mg++ Free, Metanol padrão-HPLC e solução 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free e Metanol padrão-HPLC. As amostras em PBS foram analisadas após extração lipídica ou adição de metanol padrão-HPLC previamente à análise. Foi confirmada a possibilidade de análise direta da composição lipídica em MALDITOF, sem necessidade de extração. O armazenamento em metanol ou solução contendo o mesmo não resultou em degradação no período observado, no entanto o armazenamento de amostras previamente extraídas por longos períodos resultaram em resultados alterados. O experimento II utilizou amostras de 16 garanhões, armazenadas em solução 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free e Metanol padrão-HPLC. Os ejaculados de origem destas amostras foram submetidos à congelação e os resultados de análise in vitro de motilidade e morfologia espermática foram relacionados com os dados de composição lipídica através da análise dos componentes principais (PCA). Não foi observada nenhuma relação entre os resultados de análise seminal in vitro e a composição lipídica, apesar de alguns autores encontrarem tal relação, principalmente quanto à relação de determinados ácidos graxos e conteúdo total de fosfolipídeos. Estes autores utilizaram técnicas complexas, impossibilitando a aplicação na rotina veterinária a campo. A facilidade de preparo das amostras para MALDI-TOF torna esta técnica viável para análise de composição lipídica, no entanto novos testes devem ser realizados incluindo um maior número de amostas e dados de fertilidade a campo. / Artificial insemination with stallions\' frozen semen have not been widely used, mainly due to the high variability of field results and the increased cost associated with it. Sperm cell membrane lipids play an important role on several events associated with fertilization. These cells go through structural and chemicals changes during freezing and might participate in the freezeability of ejaculates. This work was composed by two experiments. In Experiment I sperm samples from six bulls and six stallions were collected, \"washed\" through centrifugation and stored at -80° in the following mediums: PBS Ca++ Mg++ Free, Methanol HPLC-standard and a solution 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free and Methanol HPLC-standard. The samples on PBS were analyzed immediately after lipid extraction or after the addition of methanol. These samples were evaluated onthe day after collection and 45 days later for evaluation of the possibility of a direct analyses with methanol and the effect of long periods of storage with methanol on lipid degradation. The possibility of an extraction-free direct MALDI-TOF analysis was confirmed. The storage with methanol did not resulted in lipid degradation for the period studied, however the storage of previously extract samples resulted on irregular spectrums. In Experiment II 16 sperm samples from stallions were collected and frozen. An aliquot of 500µl from each sample was washed through centrifugation and stored with a 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free and Methanol HPLC-standard solution. In vitro sperm analysis of motility and morphology were studied for relations with the lipid profile through a principal components analysis (PCA). It was not observed relation between lipid profile and sperm motility and morphology, as previously reported by others authors. However, these authors methodology were highly complex , making it difficult for field application. MALDI-TOF sample preparation its easy and fast and new test with a larger number of samples and field fertility results may prove this is a viable tool for improving field results with frozen semen artificial insemination.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:38:31Z : No. of bitstreams: 1 crespilho_am_me_botfmvz.pdf: 507525 bytes, checksum: a1c92f545e77b50838125fbea8dfddd6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A despeito das inúmeras variáveis que influenciam direta e indiretamente a fertilidade das fêmeas bovinas, a qualidade das amostras seminais exerce um papel importante na determinação das taxas de concepção dos programas de inseminação artificial. Os objetivos dessa pesquisa foram comparar a efetividade de dois diluidores de criopreservação de sêmen bovino no processamento de amostras seminais apresentando diferentes concentrações espermáticas em relação aos índices de congelabilidade determinados laboratorialmente (Experimento I) e as taxas de concepção proporcionadas por cada metodologia quando utilizada em programas de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) em bovinos (Experimento II). No Experimento I foram utilizados 14 ejaculados de diferentes touros da raça Nelore. Cada ejaculado foi fracionado em oito alíquotas iguais, submetidas a criopreservação com os diluidores Tris-gema de ovo-frutose (meio TRIS) e MKA nas concentrações de 12, 25, 50 e 100 milhões de espermatozóides totais por mililitro de meio, formando oito grupos experimentais em função das variáveis diluidor e concentração. As amostras foram descongeladas a 46 ºC por 20 segundos, avaliando-se os padrões de motilidade através do método computadorizado (CASA), integridade de membrana plasmática (IMP), resistência ao teste de termorresistência rápido (TTR) e taxa de recuperação e IMP após seleção espermática pela técnica de swim-up. Para o Experimento II foram selecionados sete touros utilizados no Experimento I, obtendo-se um ejaculado de cada animal por eletroejaculação... / Although there are many variables which directly or indirectly influence female bovine fertility, the quality of sperm samples plays a important role in the determination of conception rates in artificial insemination programs. The aim of the present study was to compare the efficiency of two bovine semen extenders for sperm freezing with different spermatic concentrations in the freezability determined by lab tests (Experiment I), and conception rates after fixed time artificial insemination (FTAI; Experiment II). In Experiment I 14 ejaculates of different Nelore bulls were used. Each ejaculate was splitsampled in to eight equal parts and then submitted to cryopreservation with Tris-egg yolk fructose (TRIS) and MKA extenders, at concentrations of 12, 25, 50 and 100 millions spermatozoa per milliliter forming eight experimental groups. The samples were thawed at 46 ºC for 20 seconds, and the following parameters were evaluated: sperm motility and movement (by computer-assisted semen analysis - CASA), sperm membrane integrity (SMI), resistance to the fast thermoresistance test (TT), recovery rate and sperm membrane integrity after sperm selection through swim-up technique. Seven of 14 bulls used in Experiment I were selected for Experiment II, and semen was collected from each of the animals by electroejaculation. The seven ejaculates obtained were mixed (semen pool) and cryopreserved, thus forming eight experimental groups according to the freezing extenders and sperm concentrations/straws: TRIS 12, 25, 50 and 100, and MKA 12, 25, 50 and 100...(Complete abstract, click electronic address below)