Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive disease that causes a disorder of steroidogenesis in the adrenal cortex. This disease is a part of a panel of diseases searched in preclinical nationwide neonatal screening. The methodology is based on measuring the concentration of 17-hydroxyprogesterone (17-OHP) in a dried blood spot using fluorescence immunoassay (FIA). However, this determination is not entirely specific and generates a high rate of false positive results (up to 4.3 %). In this diploma thesis the LC-MS / MS method was developed. This method measures selected steroid hormones involved in cortisol metabolism with respect to the diagnosis of CAH disease. The method was validated and applied to clinical samples, it identified CAH patients from negative controls and significantly reduced the false positivity of neonatal screening results. Compared to the FIA results, the LC-MS / MS method reduced false positivity up to 50 % by evaluating the concentration of 17-OHP. Moreover, by extending the diagnostic algorithm with other measured markers, the reduction was enhanced up to 98%. The developed method is also applicable for the measurement of serum and plasma samples, respectively, and has become a part of the confirmation tests for suspected CAH screening findings. Key...

A deficiência da 21-hidroxilase é uma freqüente doença autossômica recessiva caracterizada por manifestações hiperandrogênicas, que se iniciam na infância, puberdade ou vida adulta. Observa-se existência de forte correlação do comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com a forma clínica e com as concentrações basais e pós-estímulo da 17OH-progesterona. Entretanto, não se observa a mesma correlação com a intensidade, idade de início das manifestações e com as concentrações séricas de testosterona. Sugere-se que variações individuais na sensibilidade periférica aos andrógenos ou no metabolismo da testosterona poderiam estar implicadas na variabilidade fenotípica desta doença. Porém, os possíveis mecanismos nunca foram estudados na literatura. Os andrógenos têm sua ação mediada pelo receptor de andrógenos (AR), cujo gene apresenta um trato polimórfico de repetições CAG, o qual modula sua atividade de transativação. Em tecidos periféricos a ação androgênica pode ser ainda potencializada pela enzima 5 alfa-redutase, que transforma testosterona em dihidrotestosterona. O seu gene codificador (SRD5A2) possui vários polimorfismos que alteraram esta atividade de biotransformação nos tecidos periféricos. No clearance da testosterona, os citocromos hepáticos P4503a4, P4503a5 p4503a7 e P4502c19 são os principais envolvidos. Além disso, outro citocromo, o P450c17 representa uma enzima chave na via de produção de andrógenos. Para os citocromos P450 tipo 2, tanto da via de clearance como de síntese dos andrógenos, é necessário ainda a interação com o P450 óxido-redutase para realizar suas reações de hidroxilação. São descritos polimorfismos em todos os genes acima referidos, que alteram sua expressão ou a eficiência catalítica e, consequentemente, tem sido envolvidos na etiologia de doenças andrógeno-dependentes. Consideramos que alterações nos genes codificadores das proteínas relacionadas ao metabolismo e/ou ação periférica dos andrógenos possam atuar na modulação do fenótipo da forma não clássica. Objetivos: Correlacionar o nCAG do gene AR e os polimorfismos nos genes CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4, CYP2C19 e CYP17A1, POR e SRD5A2 com a idade de aparecimento dos sintomas, score de Ferriman do hirsutismo ao diagnóstico, presença de virilização, com as concentrações séricas basais de testosterona, bem como com a ausência ou presença de sintomas. Casuística: Selecionamos 122 pacientes com diagnóstico de forma não clássica confirmado por 17OH-progesterona basal ou pós-estímulo com ACTH 10 ng/mL. Todos os pacientes tiveram o diagnóstico molecular, ou seja, mutações identificadas nos dois alelos do gene CYP21A2. As pacientes foram divididas de acordo com o comprometimento da atividade da 21-OH predito pelo genótipo em grupos A/C (grave) e C/C (moderado). As pacientes também foram divididas em grupos pediátrico e adulto, início das manifestações antes e após os 12 anos, respectivamente. Metodologia: O DNA foi extraído de leucócitos periféricos. As regiões de repetições CAG foram amplificadas por PCR e os produtos submetidos à eletroforese capilar e análise pelo software GeneScan. Amostras de DNA das pacientes heterozigotas para o número de repetições CAG foram digeridas com a enzima Hpa II e os produtos submetidos à amplificação da região CAG para se determinar o padrão de inativação do cromossomo X. Os genes CYP3A5, CYP3A4, CYP3A7, CYP17A1, CYP2C19, POR e SRD5A2 foram amplificados por PCR e submetidos à reação de seqüenciamento ou à reação de digestão enzimática para rastreamento das variantes alélicas. Os resultados foram comparados com as respectivas seqüências selvagens depositadas no GeneBank. Na análise estatística foram empregados os testes t de Student, ANOVA, Wilcoxon rank-sun, Kruskall Wallis rank e regressão linear. Resultados: Observamos uma frequência significativamente menor de alelos longos (> 26 repetições) do trato CAG do AR no grupo pediátrico em relação ao de adultos com genótipo 21-OH do grupo C/C (p=0,01). Adicionalmente, a média ponderada do trato CAG foi significativamente menor nas pacientes com clitoromegalia (19,1 ± 2,7) em comparação com a de pacientes sem virilização (21,6 ± 2,5), correlação que independeu do genótipo da 21-OH. A mediana das concentrações séricas de testosterona foi significativamente maior nas carreadoras da variante CYP17A1*A2 (145,7 ng/dL, 126-153) em relação às carreadoras da variante selvagem (57 ng/dL, 36-87) com genótipo 21-OH do grupo A/C. As demais variantes não se correlacionaram com os fenótipos clínico e hormonal. Conclusão: Observamos que o trato CAG apresentou efeito na modulação do fenótipo de virilização de mulheres com forma não clássica. Além disso, o trato CAG pode ter contribuído no período de início das manifestações, uma vez que o grupo pediátrico com genótipo C/C teve freqüência menor de alelos longos em relação às adultas. Dentre as variantes alélicas pesquisadas, que alteram a síntese e/ou metabolismo dos andrógenos, identificamos associação do alelo CYP17A1*A2 com concentrações maiores de testosterona. Embora tenhamos avaliado uma casuística expressiva para esta patologia, para as demais correlações com resultados negativos, não podemos afastar um efeito do tamanho da amostra. / Introduction: The 21-hydroxylase deficiency is a common autosomal recessive disease characterized by clinical hyperandrogenism, which could begin at childhood, puberty or adulthood. There is a strong correlation among impairment of enzymatic activity conferred by genotypes, clinical forms, basal and post-stimulation 17OH-progesterone (17-OHP) levels. However, we did not observe the same correlation with the intensity, age at onset of manifestations and basal testosterone levels. It is suggested that individual variations in the androgen peripheral sensitivity and/or metabolism could be implicated in the phenotypic variability of this disease. However, potential mechanisms have never been studied before. The androgen action is mediated by the androgen receptor (AR), whose gene has a polymorphic CAG repeat that modulates its transactivation activity. In the peripheral tissues, the androgen action is modified by the 5 alpha-reductase type 2 activity, which converts testosterone into a potent androgen, dihydrotestosterone. Its coding gene (SRD5A2) carries several polymorphisms altering its catalytic activity in the peripheral tissues. Regarding the testosterone clearance, hepatic cytochromes P4503a4, P4503a5 p4503a7 P4502c19 are the most important. In addition, another cytochrome, P450c17, is a key enzyme in the androgen production pathway. For the cytochrome P450 type 2 activities, involved in the androgen clearance and/or synthesis, an interaction with the P450 oxidoreductase is still necessary. Polymorphisms are described in all the aforementioned genes, which change their expression and/or catalytic efficiencies; consequently, they have been implicated in the etiology of androgen-dependent diseases. We supposed that changes in the coding genes for the aforesaid proteins could act in modulating the nonclassical phenotype. Objectives: To compare the nCAG of AR gene and polymorphisms of CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4, CYP2C19, and CYP17A1, SRD5A2 and POR genes with the age of onset of symptoms, Ferriman score of hirsutism at diagnosis, presence of virilization, basal testosterone levels, as well as with the absence or the presence of symptoms. Patients: We selected 122 patients with basal or post-ACTH 17-OHP 10 ng/mL. All patients had confirmed nonclassical molecular diagnoses. Patients were divided according to the impairment of 21-OH activity predicted by genotype groups into A/C (severe) and C/C (moderate). Patients were also classified according to the onset of manifestations into pediatric and adult groups, younger than or older than 12 years, respectively. Methods: DNA was extracted from peripheral leukocytes. CAG repeat regions were PCR amplified, products submitted to capillary electrophoresis and analyzed by GeneScan software. DNA samples from CAG heterozygous patients were digested with the Hpa II enzyme and also submitted to PCR, in order to determine X-chromosome inactivation pattern. The CYP3A5, CYP3A4, CYP3A7, CYP17A1, CYP2C19, POR and SRD5A2 genes were PCR amplified and submitted to sequencing or enzymatic assays to screen the allelic variants. The results were compared with their wild sequences in the GenBank. Statistical comparisons employed Student\'s t tests, ANOVA, Wilcoxon rank-sun, Kruskal Wallis rank and linear regression. Results: We observed a significantly lower frequency of longer CAG alleles (> 26 repeats) of AR in the pediatric group compared to the adults carrying the 21-OH genotype from group C/C (p = 0.01). Additionally, the weighted biallelic mean of the CAG tract was considerably lower in patients with clitoromegaly (19.1 ± 2.7) in comparison to patients without it (21.6 ± 2.5), a correlation that was independent of the 21-OH genotype severity. The median of testosterone levels was significantly higher in the CYP17A1*A2 carriers (145.7 ng/dL, 126-153) compared to the ones carrying the wild allele (57 ng/dL, 36-87), from the group A/C of 21-OH genotype. The other variants did not show a correlation with clinical and hormonal phenotypes. Conclusions: We observed that the CAG tract was effective in modulating the phenotype of virilization in nonclassical women as well as influenced the period of onset of manifestations of patients carrying moderate CYP21A2 genotype. Considering the remaining allelic variants, which alter the androgen synthesis or metabolism, we identified the association of CYP17A1*A2 alleles with higher testosterone levels. Although we evaluated a significant number of patients with 21-OHD, we cannot rule out a sample size effect.

A deficiência da 21-hidroxilase é uma doença genética comum, causada por mutações no gene CYP21A2, que codifica a enzima 21-hidroxilase (P450c21). A deficiência da 21-hidroxilase afeta a síntese de cortisol e aldosterona e promove acúmulo de precursores, que são desviados para a síntese de andrógenos. Observa-se três principais fenótipos: a forma clássica virilizante simples (VS), na qual as meninas nascem com virilização da genitália externa e ambos os sexos apresentam virilização pós-natal; a forma perdedora de sal (PS), na qual além da virilização, ambos os sexos apresentam crise de perda de sal no período neonatal; e a forma não clássica (NC), na qual os sintomas de hiperandrogenismo iniciam-se mais tardiamente, na infância, adolescência ou idade adulta. Os estudos in vitro das mutações do CYP21A2 demonstram que existe uma boa correlação do grau de comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com o fenótipo. Entretanto, existem algumas divergências como: pacientes que apresentam quadro clínico e hormonal de forma não clássica, nos quais mutações não são identificadas em um ou em ambos os alelos do CYP21A2, e pacientes que apresentam o fenótipo mais leve do que o predito pelo genótipo. Essas divergências sugerem a presença de fatores moduladores do fenótipo na deficiência da 21-hidroxilase. A primeira hipótese foi de que houvesse mutações no gene P450 óxido-redutase (POR), que codifica uma flavoproteína que doa elétrons para as enzimas microssomais P450, inclusive a P450c21, passo fundamental para a atividade enzimática das mesmas. A segunda hipótese foi de que outras enzimas P450, que não a P450c21, tivessem a capacidade de realizar a 21-hidroxilação extra-adrenal da progesterona e 17OH-progesterona (17OHP), sendo então capazes de modular o fenótipo da perda de sal e/ou virilização. Os citocromos P450 hepáticos CYP2C19 e CYP3A4, responsáveis pelo metabolismo de drogas, são capazes de realizar 21-hidroxilação da progesterona, porém essa atividade nunca foi comparada com a atividade de 21-hidroxilação da P450c21, a fim de que se possa extrapolar a importância dessa atividade extra-adrenal in vivo. A casuística desse estudo constou de 11 pacientes com a forma NC e genótipo incompleto, e 6 pacientes com fenótipo discordante do genótipo (5 com genótipo predizendo forma PS e manifestando forma VS, e 1 com genótipo predizendo VS e apresentando forma NC). O gene POR foi sequenciado em todos 17 pacientes e 10/30 alelos não relacionados apresentavam o polimorfismo A503V. O estudo funcional foi realizado através da expressão em bactéria do P450c21, do POR selvagem (PORwt) e da variante do POR A503V, e de estudo enzimático in vitro comparando a 21-hidroxilação da P450c21 promovida pela PORwt e POR A503V. Essa comparação foi realizada através de cálculos dos parâmetros que avaliam cinética enzimática (Km, Vmax e Vmax/Km). Apesar da variante POR A503V diminuir significativamente a atividade da P450c17 in vitro, nosso estudo demonstrou que ela não altera a capacidade de 21-hidroxilase da P450c21. Portanto, não existem substituições no POR que justifiquem as discordâncias de fenótipo/genótipo na deficiência da 21-hidroxilase nesta casuística. Para avaliarmos o papel da 21-hidroxilação extra-adrenal, as enzimas P450c21, as enzimas P450 hepáticas CYP2C19 e CYP3A4 e o POR foram expressos em bactéria. A capacidade das enzimas P450c21, CYP2C19 e CYP3A4 de 21- hidroxilar progesterona e 17OHP foram avaliadas in vitro e medidas através dos mesmos parâmetros de cinética enzimática. Comparado com a P450c21, o Vmax/Km da 21-hidroxilação da progesterona pelos CYP2C19 e CYP3A4 foram 17% e 10%, respectivamente. Os citocromos hepáticos não apresentaram atividade de 21-hidroxilação da 17OHP. Considerando que uma atividade residual mínima de 21-hidroxilação da progesterona é satisfatória para produzir quantidades suficientes de aldosterona para se evitar a perda de sal, este estudo sugere que a atividade de 21-hidroxilação extra-adrenal do CYP2C19 e CYP3A4 é capaz de melhorar o fenótipo de perda de sal, mas não o da deficiência de glicocorticóide. O gene CYP2C19, ao contrário do CYP3A4, é extremamente polimórfico, e são descritos vários haplótipos com diferentes atividades enzimáticas, os quais explicam as diferenças no metabolismo de várias drogas utilizadas na prática clínica. O único polimorfismo ultra-metabolizador é o CYP2C19*17, representado por duas substituições na região promotora que aumentam a transcrição do gene em 2-4 vezes. Os indivíduos que apresentam o haplótipo ultra-metabolizador podem ter maior atividade de 21-hidroxilação extraadrenal da progesterona e, dessa forma, não apresentarem a crise de perda de sal. O gene CYP2C19 foi sequenciado nos cinco pacientes com genótipo de forma perdedora de sal e que não desidrataram como predito, e encontramos o haplótipo ultra-metabolizador em homozigose em 1/5 pacientes e em heterozigose em 1/5 pacientes. Heterozigose para o CYP2C19*17 também foi encontrada no grupo controle (indivíduos perdedores de sal com genótipo/fenótipo concordantes). Portanto, o haplótipo CYP2C19*17 em heterozigose é insuficiente para modular a perda de sal e, provavelmente, em homozigose pode evitar a perda de sal. Em conclusão, pela primeira vez descrevemos o efeito modulador de uma variante alélica dos citocromos hepáticos P450 melhorando o fenótipo da forma perdedora de sal; no entanto, os demais casos permanecem com indefinição do genótipo. Estes resultados sugerem que não apenas uma única enzima, mas múltiplas enzimas extra-adrenais estão possivelmente envolvidas na modulação do fenótipo da deficiência da 21-hidroxilase. / Adrenal 21-hydroxylase deficiency is a common genetic disorder, caused by mutations in the CYP21A2 gene, which encodes the 21-hydroxylase P450c21. The 21-hydroxylase deficiency disrupts cortisol and aldosterone biosynthesis and leads to accumulation of androgen precursors. There are 3 main phenotypes: the simple virilizing (SV) form, in which girls present with virilized external genitalia at birth and both sexes present with precocious pseudopuberty; the salt wasting (SW) form, characterized by additional salt-wasting crisis in the neonatal period in both sexes; and the nonclassic (NC) form, in which the hyperandrogenic signs occur later in life, during childhood, adolescence or adulthood. In vitro studies show a good correlation between the degree of enzymatic impairment determined by genotype and phenotype. However, there are some discrepancies as: patients with clinical and hormonal profiles of nonclassic form in whom mutations are not found in one or both alleles, and patients with milder phenotype than the ones predicted by genotyping. These discrepancies suggest the existence of modulatory factors in 21- hydroxylase deficiency phenotype. The first hypothesis was that there were mutations in P450 oxidoreductase (POR), a gene which encodes a flavoprotein that donates electrons for all microsomal P450s, including P450c21, an essential step for P450s activity. The second hypothesis was that other enzymes that not P450c21 could perform extra-adrenal 21-hydroxylation of progesterone and 17OHprogesterone (17OHP), modulating salt balance and virilization. Hepatic drugmetabolizing P450 enzymes CYP2C19 and CYP3A4 can 21-hydroxylate progesterone; however, this activity was never compared to 21-hydroxylation performed by P450c21, in order to determine the importance of this extra-adrenal activity in vivo. The present cohort consisted of 11 patients with nonclassic form and incomplete genotype and 6 patients with genotype/phenotype discrepancies (genotype-predicted SW form and manifested SV form, n=5; genotyped-predicted SV form and manifested NC form, n=1). The POR gene was sequenced in these 17 patients, and 10/30 alleles presented the polymorphism A503V. P450c21, PORwt and POR A503V were expressed in bacteria, assayed in vitro, and the kinetics parameters Km, Vmax and Vmax/Km were calculated. Although POR A503V variant decreases the activity of P450c17, our study showed that it does not alter the 21-hydroxylation by P450c21. Therefore, there are no POR variants in this cohort that could explain discrepancies between genotype and phenotype in 21- hydroxylase deficiency. To evaluate the hypothesis of extra-adrenal 21- hydroxylation, P450c21, CYP2C19, CYP3A4, and POR were expressed in bacteria, assayed in vitro, and kinetic parameters assessed. Compared to P450c21, the Vmax/Km of 21-hydroxylation of progesterone by CYP2C19 and CYP3A4 was 17% and 10%, respectively. Neither CYP2C19 nor CYP3A4 were able to 21-hydroxylate 17OHP. Considering that little 21-hydroxylation activity is enough to produce sufficient amount of aldosterone to avoid the dehydration, this study suggests that extra-adrenal 21-hydroxylation by CYP2C19 and CYP3A4 may be able to ameliorate the mineralocorticoid, but not the glucocorticoid deficiency. CYP2C19 is very polymorphic, and some haplotypes can modify enzymatic activity. For example, the unique ultrametabolizer allele CYP2C19*17 has two polymorphisms in the promoter region that increase gene transcription in 2-4 times. Thus, patients harboring the CYP2C19 ultra-metabolizer allele could present an increased extraadrenal 21-hydroxylation of progesterone, and hence be able to avoid salt wasting crisis. CYP2C19 gene was sequenced in the 5 patients who did not present salt wasting crisis as expected, and 1/5 patients was homozygous and 1/5 patients was heterozygous for the CYP2C19*17 allele. Heterozygosity was also present in the control group (patients with salt wasting form and genotype/phenotype concordance). Therefore, heterozygosity for CYP2C19*17 seems to be insufficient to modulate salt balance but homozygosity might be able to avoid salt wasting crisis. In conclusion, we described for the first time the modulatory effect of an allelic variant of an extra-adrenal P450 enzyme ameliorating the salt wasting phenotype in a patient with 21-hydroxylase deficiency. Taken together with the remaining undefined genotypes, these results suggest that multiple extra-adrenal enzymes, rather than a single one, modulate the phenotypic expression of defects in 21-hydroxylase.

Introdução: A deficiência da 21-hidroxilase (21-OHD) é um frequente erro herdado do metabolismo que resulta no comprometimento da síntese do cortisol e/ou aldosterona e aumento da produção de andrógenos. A doença é caracterizada por uma diversidade fenotípica, variando desde virilização pré-natal da genitália externa de fetos femininos e pós-natal em ambos os sexos, com ou sem perda de sal, até quadros assintomáticos. Em seu tratamento é necessária reposição com glicocorticoide para se evitar a insuficiência adrenocortical e os sinais de virilização. Um fino ajuste na dose diária do glicocorticoide é essencial para se evitar sub ou supertratamento, com o objetivo de preservar o potencial de estatura final e fertilidade. Entretanto, tem sido observada maior frequência de obesidade e outras comorbidades metabólicas nestes pacientes; porém, a prevalência destas complicações ainda não é conhecida, bem como se estariam associadas à exposição ao glicocorticoide e/ou com fatores genéticos. Objetivos: avaliar a frequência de obesidade e de síndrome metabólica (SM) em pacientes com 21OHD; caracterizar a distribuição alélica dos polimorfismos dos genes do receptor de glicocorticoide (NR3C1) e da enzima 11beta-hidroxiesteróide desidrogenase tipo I (HSD11B1), e correlacionar a distribuição destes polimorfismos com a presença das complicações metabólicas. Métodos: Foram selecionados 109 pacientes (60 PS/49 VS), sendo 41 crianças e adolescentes (idade média 11,4 ± 3,9 anos) e 68 adultos (idade média 28,4 ± 9 anos) em tratamento com glicocorticoide e com adequado controle hormonal. Pacientes com a forma PS também receberam fludrocortisona. Adequado controle foi caracterizado por concentração normal de atividade plasmática de renina e de andrógenos de acordo com o sexo e idade nos últimos 2 anos. A obesidade nos adultos foi definida pelo IMC >= 30 kg/m² e em crianças e adolescentes pelo IMC acima do percentil 95. Síndrome metabólica foi definida segundo o critério do National Cholesterol Education Program em adultos e crianças. História familiar de hipertensão arterial, diabetes, dislipidemia, obesidade e/ou doença cardiovascular também foi avaliada. Foram mensuradas glicemia, lipoproteínas, triglicérides, colesterol total e insulina. Os alelos BclI, A3669G, ER22/23EK e N363S do gene NR3C1 e o alelo 4436InsA do gene HSD11B1 foram genotipados e as análises de associação com os fenótipos foram realizadas por meio dos testes Chi-quadrado, t-studant e análise de regressão. As análises de correlação foram feitas utilizando o teste de correlação de Pearson. Resultados: Obesidade foi observada em 31,7% das crianças e 23,5% dos adultos. Síndrome metabólica foi observada em 14,6% das crianças e 7,3% dos adultos. A prevalência dos componentes da SM foi maior no grupo dos obesos quando comparada a de pacientes não obesos (crianças e adultos). Não houve correlação significante entre o IMC, sexo, forma clínica da 21-OHD, duração da terapia e dose de GC. História familiar positiva para obesidade, hipertensão, dislipidemia e doença cardiovascular foi mais frequente nos pacientes obesos quando comparada a de pacientes não obesos, em adultos e crianças. Os polimorfismos BclI, A3669G e 4436InsA foram identificados em 23,2%, 9,7% e 14,6% dos alelos das crianças, respectivamente, e nos adultos em 26,4%, 9,6% e 18,4% dos alelos, respectivamente. A variante A3669G foi associada à maiores concentrações de LDL-c em crianças quando comparada aos carreadores do alelo selvagem. Os pacientes adultos carreadores do polimorfismo BclI apresentaram maior IMC, circunferência abdominal e PAS quando comparados aos carreadores do alelo selvagem. Não observamos diferenças estatisticamente significantes no perfil metabólico entre pacientes carreadores e não carreadores do polimorfismo 4436InsA (adultos e crianças). Conclusão: observamos que pacientes 21-OHD possuem maior prevalência de obesidade, e o grupo pediátrico maior prevalência de SM em relação à população de referência, sendo ambas independentes da dose de glicocorticoide e do tempo do tratamento. A presença de perfil metabólico adverso esteve associada à obesidade e à predisposição genética, tais como história familiar e variantes genéticas do receptor de glicocorticoide / Introduction: Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency (21OHD) is a common autosomal recessive disorder that leads to decreased glucocorticoid secretion, with or without mineralocorticoid deficiency, and increased androgen production. The disease is characterized by phenotypic variability, including a severe form with prenatal virilization of the external genitalia in female fetuses and postnatal virilization in both sexes, with or without salt loss. Current therapy aims to provide adequate glucocorticoid (GC) replacement and to suppress the abnormal androgen secretion; mineralocorticoid replacement aims to control the renal salt balance to avoid adrenal crisis. Nevertheless, these therapeutic goals are difficult to achieve in practice due to the complexity of replicating the physiologic cortisol circadian rhythm. Increased prevalence of obesity, insulin resistance, hypertension and adverse lipid profile have been observed among CAH patients under GC therapy; however, the extent of its prevalence and also whether it is associated with the GC dose or with genetic factors are not known. Objectives: to evaluate the obesity and metabolic syndrome (SM) frequencies in 21-OHD patients; to characterize the allelic distribution of the NR3C1 and HSD11B1 polymorphisms, and to correlate with the metabolic profile. Methods: One hundred and nine patients (60SW/49SV) were selected, 41 being children and adolescents (mean age 11.4 ± 3.9 yrs) and 68 adults (mean age 28.4 ± 9 yrs) all of whom received GC treatment and had adequate hormonal control. SW patients also received fludrocortisone. Adequate hormonal control was characterized by normal plasmatic rennin activity and androgen levels according to age and sex for at least two years. Blood fasting was used to obtain glucose, lipoproteins, triglycerides, total cholesterol and insulin levels. Obesity in the adult group was defined by BMI >= 30 kg/m², and in the young group by BMI > 95th percentile. Metabolic syndrome was defined by the NCEP ATPIII criteria. Family history of the hypertension, diabetes, dyslipidemia, obesity and/or cardiovascular disease was also evaluated. The BclI, A3669G, ER22/23EK and N363S alleles of the NR3C1 gene and 4436InsA of the HSD11B1 gene were genotyped and association analyses with phenotype were carried out with Chi-square, t-test and regression analysis. Correlation analyses were performed by Pearson correlation test. Results: obesity was observed in 31.7% of children and 23.5% of adults. SM was observed in 14.6% of young and 7.3% of adult patients. SM prevalence was higher in the obese group than the nonobese group (children and adults). There was no significant correlation between GC dose and BMI, sex, clinical form or treatment duration. Prevalence of family history of obesity, hypertension, dyslipidemia and cardiovascular disease was higher in the obese than in non-obese patients (children and adults). The BclI, A3669G and 4436InsA polymorphisms were found in 23.2%, 9.7% and 14.6% of the alleles in children, respectively and in 26.4%, 9.6% and 18.4% of the alleles in adults. The A3669G variant was associated to increased LDL-c levels in comparison with noncarriers in the young group. The BclI adult carriers presented higher BMI, abdominal circumference and systolic blood pressure in comparison with noncarriers. Statistically significant differences were not observed in the metabolic profile between carriers and non-carriers of the 4436InsA polymorphism (children and adults). Conclusion: in the present study, which analyzed the clinical and metabolic profile of 21-OHD patients, high obesity prevalence, independent of GC dose and treatment duration, was observed. Adverse metabolic profile was mainly associated with obesity and genetic predisposition, such as family history and NR3C1 polymorphisms

A deficiência da 21-hidroxilase é uma doença genética comum, causada por mutações no gene CYP21A2, que codifica a enzima 21-hidroxilase (P450c21). A deficiência da 21-hidroxilase afeta a síntese de cortisol e aldosterona e promove acúmulo de precursores, que são desviados para a síntese de andrógenos. Observa-se três principais fenótipos: a forma clássica virilizante simples (VS), na qual as meninas nascem com virilização da genitália externa e ambos os sexos apresentam virilização pós-natal; a forma perdedora de sal (PS), na qual além da virilização, ambos os sexos apresentam crise de perda de sal no período neonatal; e a forma não clássica (NC), na qual os sintomas de hiperandrogenismo iniciam-se mais tardiamente, na infância, adolescência ou idade adulta. Os estudos in vitro das mutações do CYP21A2 demonstram que existe uma boa correlação do grau de comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com o fenótipo. Entretanto, existem algumas divergências como: pacientes que apresentam quadro clínico e hormonal de forma não clássica, nos quais mutações não são identificadas em um ou em ambos os alelos do CYP21A2, e pacientes que apresentam o fenótipo mais leve do que o predito pelo genótipo. Essas divergências sugerem a presença de fatores moduladores do fenótipo na deficiência da 21-hidroxilase. A primeira hipótese foi de que houvesse mutações no gene P450 óxido-redutase (POR), que codifica uma flavoproteína que doa elétrons para as enzimas microssomais P450, inclusive a P450c21, passo fundamental para a atividade enzimática das mesmas. A segunda hipótese foi de que outras enzimas P450, que não a P450c21, tivessem a capacidade de realizar a 21-hidroxilação extra-adrenal da progesterona e 17OH-progesterona (17OHP), sendo então capazes de modular o fenótipo da perda de sal e/ou virilização. Os citocromos P450 hepáticos CYP2C19 e CYP3A4, responsáveis pelo metabolismo de drogas, são capazes de realizar 21-hidroxilação da progesterona, porém essa atividade nunca foi comparada com a atividade de 21-hidroxilação da P450c21, a fim de que se possa extrapolar a importância dessa atividade extra-adrenal in vivo. A casuística desse estudo constou de 11 pacientes com a forma NC e genótipo incompleto, e 6 pacientes com fenótipo discordante do genótipo (5 com genótipo predizendo forma PS e manifestando forma VS, e 1 com genótipo predizendo VS e apresentando forma NC). O gene POR foi sequenciado em todos 17 pacientes e 10/30 alelos não relacionados apresentavam o polimorfismo A503V. O estudo funcional foi realizado através da expressão em bactéria do P450c21, do POR selvagem (PORwt) e da variante do POR A503V, e de estudo enzimático in vitro comparando a 21-hidroxilação da P450c21 promovida pela PORwt e POR A503V. Essa comparação foi realizada através de cálculos dos parâmetros que avaliam cinética enzimática (Km, Vmax e Vmax/Km). Apesar da variante POR A503V diminuir significativamente a atividade da P450c17 in vitro, nosso estudo demonstrou que ela não altera a capacidade de 21-hidroxilase da P450c21. Portanto, não existem substituições no POR que justifiquem as discordâncias de fenótipo/genótipo na deficiência da 21-hidroxilase nesta casuística. Para avaliarmos o papel da 21-hidroxilação extra-adrenal, as enzimas P450c21, as enzimas P450 hepáticas CYP2C19 e CYP3A4 e o POR foram expressos em bactéria. A capacidade das enzimas P450c21, CYP2C19 e CYP3A4 de 21- hidroxilar progesterona e 17OHP foram avaliadas in vitro e medidas através dos mesmos parâmetros de cinética enzimática. Comparado com a P450c21, o Vmax/Km da 21-hidroxilação da progesterona pelos CYP2C19 e CYP3A4 foram 17% e 10%, respectivamente. Os citocromos hepáticos não apresentaram atividade de 21-hidroxilação da 17OHP. Considerando que uma atividade residual mínima de 21-hidroxilação da progesterona é satisfatória para produzir quantidades suficientes de aldosterona para se evitar a perda de sal, este estudo sugere que a atividade de 21-hidroxilação extra-adrenal do CYP2C19 e CYP3A4 é capaz de melhorar o fenótipo de perda de sal, mas não o da deficiência de glicocorticóide. O gene CYP2C19, ao contrário do CYP3A4, é extremamente polimórfico, e são descritos vários haplótipos com diferentes atividades enzimáticas, os quais explicam as diferenças no metabolismo de várias drogas utilizadas na prática clínica. O único polimorfismo ultra-metabolizador é o CYP2C19*17, representado por duas substituições na região promotora que aumentam a transcrição do gene em 2-4 vezes. Os indivíduos que apresentam o haplótipo ultra-metabolizador podem ter maior atividade de 21-hidroxilação extraadrenal da progesterona e, dessa forma, não apresentarem a crise de perda de sal. O gene CYP2C19 foi sequenciado nos cinco pacientes com genótipo de forma perdedora de sal e que não desidrataram como predito, e encontramos o haplótipo ultra-metabolizador em homozigose em 1/5 pacientes e em heterozigose em 1/5 pacientes. Heterozigose para o CYP2C19*17 também foi encontrada no grupo controle (indivíduos perdedores de sal com genótipo/fenótipo concordantes). Portanto, o haplótipo CYP2C19*17 em heterozigose é insuficiente para modular a perda de sal e, provavelmente, em homozigose pode evitar a perda de sal. Em conclusão, pela primeira vez descrevemos o efeito modulador de uma variante alélica dos citocromos hepáticos P450 melhorando o fenótipo da forma perdedora de sal; no entanto, os demais casos permanecem com indefinição do genótipo. Estes resultados sugerem que não apenas uma única enzima, mas múltiplas enzimas extra-adrenais estão possivelmente envolvidas na modulação do fenótipo da deficiência da 21-hidroxilase. / Adrenal 21-hydroxylase deficiency is a common genetic disorder, caused by mutations in the CYP21A2 gene, which encodes the 21-hydroxylase P450c21. The 21-hydroxylase deficiency disrupts cortisol and aldosterone biosynthesis and leads to accumulation of androgen precursors. There are 3 main phenotypes: the simple virilizing (SV) form, in which girls present with virilized external genitalia at birth and both sexes present with precocious pseudopuberty; the salt wasting (SW) form, characterized by additional salt-wasting crisis in the neonatal period in both sexes; and the nonclassic (NC) form, in which the hyperandrogenic signs occur later in life, during childhood, adolescence or adulthood. In vitro studies show a good correlation between the degree of enzymatic impairment determined by genotype and phenotype. However, there are some discrepancies as: patients with clinical and hormonal profiles of nonclassic form in whom mutations are not found in one or both alleles, and patients with milder phenotype than the ones predicted by genotyping. These discrepancies suggest the existence of modulatory factors in 21- hydroxylase deficiency phenotype. The first hypothesis was that there were mutations in P450 oxidoreductase (POR), a gene which encodes a flavoprotein that donates electrons for all microsomal P450s, including P450c21, an essential step for P450s activity. The second hypothesis was that other enzymes that not P450c21 could perform extra-adrenal 21-hydroxylation of progesterone and 17OHprogesterone (17OHP), modulating salt balance and virilization. Hepatic drugmetabolizing P450 enzymes CYP2C19 and CYP3A4 can 21-hydroxylate progesterone; however, this activity was never compared to 21-hydroxylation performed by P450c21, in order to determine the importance of this extra-adrenal activity in vivo. The present cohort consisted of 11 patients with nonclassic form and incomplete genotype and 6 patients with genotype/phenotype discrepancies (genotype-predicted SW form and manifested SV form, n=5; genotyped-predicted SV form and manifested NC form, n=1). The POR gene was sequenced in these 17 patients, and 10/30 alleles presented the polymorphism A503V. P450c21, PORwt and POR A503V were expressed in bacteria, assayed in vitro, and the kinetics parameters Km, Vmax and Vmax/Km were calculated. Although POR A503V variant decreases the activity of P450c17, our study showed that it does not alter the 21-hydroxylation by P450c21. Therefore, there are no POR variants in this cohort that could explain discrepancies between genotype and phenotype in 21- hydroxylase deficiency. To evaluate the hypothesis of extra-adrenal 21- hydroxylation, P450c21, CYP2C19, CYP3A4, and POR were expressed in bacteria, assayed in vitro, and kinetic parameters assessed. Compared to P450c21, the Vmax/Km of 21-hydroxylation of progesterone by CYP2C19 and CYP3A4 was 17% and 10%, respectively. Neither CYP2C19 nor CYP3A4 were able to 21-hydroxylate 17OHP. Considering that little 21-hydroxylation activity is enough to produce sufficient amount of aldosterone to avoid the dehydration, this study suggests that extra-adrenal 21-hydroxylation by CYP2C19 and CYP3A4 may be able to ameliorate the mineralocorticoid, but not the glucocorticoid deficiency. CYP2C19 is very polymorphic, and some haplotypes can modify enzymatic activity. For example, the unique ultrametabolizer allele CYP2C19*17 has two polymorphisms in the promoter region that increase gene transcription in 2-4 times. Thus, patients harboring the CYP2C19 ultra-metabolizer allele could present an increased extraadrenal 21-hydroxylation of progesterone, and hence be able to avoid salt wasting crisis. CYP2C19 gene was sequenced in the 5 patients who did not present salt wasting crisis as expected, and 1/5 patients was homozygous and 1/5 patients was heterozygous for the CYP2C19*17 allele. Heterozygosity was also present in the control group (patients with salt wasting form and genotype/phenotype concordance). Therefore, heterozygosity for CYP2C19*17 seems to be insufficient to modulate salt balance but homozygosity might be able to avoid salt wasting crisis. In conclusion, we described for the first time the modulatory effect of an allelic variant of an extra-adrenal P450 enzyme ameliorating the salt wasting phenotype in a patient with 21-hydroxylase deficiency. Taken together with the remaining undefined genotypes, these results suggest that multiple extra-adrenal enzymes, rather than a single one, modulate the phenotypic expression of defects in 21-hydroxylase.

A deficiência da 21-hidroxilase é uma freqüente doença autossômica recessiva caracterizada por manifestações hiperandrogênicas, que se iniciam na infância, puberdade ou vida adulta. Observa-se existência de forte correlação do comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com a forma clínica e com as concentrações basais e pós-estímulo da 17OH-progesterona. Entretanto, não se observa a mesma correlação com a intensidade, idade de início das manifestações e com as concentrações séricas de testosterona. Sugere-se que variações individuais na sensibilidade periférica aos andrógenos ou no metabolismo da testosterona poderiam estar implicadas na variabilidade fenotípica desta doença. Porém, os possíveis mecanismos nunca foram estudados na literatura. Os andrógenos têm sua ação mediada pelo receptor de andrógenos (AR), cujo gene apresenta um trato polimórfico de repetições CAG, o qual modula sua atividade de transativação. Em tecidos periféricos a ação androgênica pode ser ainda potencializada pela enzima 5 alfa-redutase, que transforma testosterona em dihidrotestosterona. O seu gene codificador (SRD5A2) possui vários polimorfismos que alteraram esta atividade de biotransformação nos tecidos periféricos. No clearance da testosterona, os citocromos hepáticos P4503a4, P4503a5 p4503a7 e P4502c19 são os principais envolvidos. Além disso, outro citocromo, o P450c17 representa uma enzima chave na via de produção de andrógenos. Para os citocromos P450 tipo 2, tanto da via de clearance como de síntese dos andrógenos, é necessário ainda a interação com o P450 óxido-redutase para realizar suas reações de hidroxilação. São descritos polimorfismos em todos os genes acima referidos, que alteram sua expressão ou a eficiência catalítica e, consequentemente, tem sido envolvidos na etiologia de doenças andrógeno-dependentes. Consideramos que alterações nos genes codificadores das proteínas relacionadas ao metabolismo e/ou ação periférica dos andrógenos possam atuar na modulação do fenótipo da forma não clássica. Objetivos: Correlacionar o nCAG do gene AR e os polimorfismos nos genes CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4, CYP2C19 e CYP17A1, POR e SRD5A2 com a idade de aparecimento dos sintomas, score de Ferriman do hirsutismo ao diagnóstico, presença de virilização, com as concentrações séricas basais de testosterona, bem como com a ausência ou presença de sintomas. Casuística: Selecionamos 122 pacientes com diagnóstico de forma não clássica confirmado por 17OH-progesterona basal ou pós-estímulo com ACTH 10 ng/mL. Todos os pacientes tiveram o diagnóstico molecular, ou seja, mutações identificadas nos dois alelos do gene CYP21A2. As pacientes foram divididas de acordo com o comprometimento da atividade da 21-OH predito pelo genótipo em grupos A/C (grave) e C/C (moderado). As pacientes também foram divididas em grupos pediátrico e adulto, início das manifestações antes e após os 12 anos, respectivamente. Metodologia: O DNA foi extraído de leucócitos periféricos. As regiões de repetições CAG foram amplificadas por PCR e os produtos submetidos à eletroforese capilar e análise pelo software GeneScan. Amostras de DNA das pacientes heterozigotas para o número de repetições CAG foram digeridas com a enzima Hpa II e os produtos submetidos à amplificação da região CAG para se determinar o padrão de inativação do cromossomo X. Os genes CYP3A5, CYP3A4, CYP3A7, CYP17A1, CYP2C19, POR e SRD5A2 foram amplificados por PCR e submetidos à reação de seqüenciamento ou à reação de digestão enzimática para rastreamento das variantes alélicas. Os resultados foram comparados com as respectivas seqüências selvagens depositadas no GeneBank. Na análise estatística foram empregados os testes t de Student, ANOVA, Wilcoxon rank-sun, Kruskall Wallis rank e regressão linear. Resultados: Observamos uma frequência significativamente menor de alelos longos (> 26 repetições) do trato CAG do AR no grupo pediátrico em relação ao de adultos com genótipo 21-OH do grupo C/C (p=0,01). Adicionalmente, a média ponderada do trato CAG foi significativamente menor nas pacientes com clitoromegalia (19,1 ± 2,7) em comparação com a de pacientes sem virilização (21,6 ± 2,5), correlação que independeu do genótipo da 21-OH. A mediana das concentrações séricas de testosterona foi significativamente maior nas carreadoras da variante CYP17A1*A2 (145,7 ng/dL, 126-153) em relação às carreadoras da variante selvagem (57 ng/dL, 36-87) com genótipo 21-OH do grupo A/C. As demais variantes não se correlacionaram com os fenótipos clínico e hormonal. Conclusão: Observamos que o trato CAG apresentou efeito na modulação do fenótipo de virilização de mulheres com forma não clássica. Além disso, o trato CAG pode ter contribuído no período de início das manifestações, uma vez que o grupo pediátrico com genótipo C/C teve freqüência menor de alelos longos em relação às adultas. Dentre as variantes alélicas pesquisadas, que alteram a síntese e/ou metabolismo dos andrógenos, identificamos associação do alelo CYP17A1*A2 com concentrações maiores de testosterona. Embora tenhamos avaliado uma casuística expressiva para esta patologia, para as demais correlações com resultados negativos, não podemos afastar um efeito do tamanho da amostra. / Introduction: The 21-hydroxylase deficiency is a common autosomal recessive disease characterized by clinical hyperandrogenism, which could begin at childhood, puberty or adulthood. There is a strong correlation among impairment of enzymatic activity conferred by genotypes, clinical forms, basal and post-stimulation 17OH-progesterone (17-OHP) levels. However, we did not observe the same correlation with the intensity, age at onset of manifestations and basal testosterone levels. It is suggested that individual variations in the androgen peripheral sensitivity and/or metabolism could be implicated in the phenotypic variability of this disease. However, potential mechanisms have never been studied before. The androgen action is mediated by the androgen receptor (AR), whose gene has a polymorphic CAG repeat that modulates its transactivation activity. In the peripheral tissues, the androgen action is modified by the 5 alpha-reductase type 2 activity, which converts testosterone into a potent androgen, dihydrotestosterone. Its coding gene (SRD5A2) carries several polymorphisms altering its catalytic activity in the peripheral tissues. Regarding the testosterone clearance, hepatic cytochromes P4503a4, P4503a5 p4503a7 P4502c19 are the most important. In addition, another cytochrome, P450c17, is a key enzyme in the androgen production pathway. For the cytochrome P450 type 2 activities, involved in the androgen clearance and/or synthesis, an interaction with the P450 oxidoreductase is still necessary. Polymorphisms are described in all the aforementioned genes, which change their expression and/or catalytic efficiencies; consequently, they have been implicated in the etiology of androgen-dependent diseases. We supposed that changes in the coding genes for the aforesaid proteins could act in modulating the nonclassical phenotype. Objectives: To compare the nCAG of AR gene and polymorphisms of CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4, CYP2C19, and CYP17A1, SRD5A2 and POR genes with the age of onset of symptoms, Ferriman score of hirsutism at diagnosis, presence of virilization, basal testosterone levels, as well as with the absence or the presence of symptoms. Patients: We selected 122 patients with basal or post-ACTH 17-OHP 10 ng/mL. All patients had confirmed nonclassical molecular diagnoses. Patients were divided according to the impairment of 21-OH activity predicted by genotype groups into A/C (severe) and C/C (moderate). Patients were also classified according to the onset of manifestations into pediatric and adult groups, younger than or older than 12 years, respectively. Methods: DNA was extracted from peripheral leukocytes. CAG repeat regions were PCR amplified, products submitted to capillary electrophoresis and analyzed by GeneScan software. DNA samples from CAG heterozygous patients were digested with the Hpa II enzyme and also submitted to PCR, in order to determine X-chromosome inactivation pattern. The CYP3A5, CYP3A4, CYP3A7, CYP17A1, CYP2C19, POR and SRD5A2 genes were PCR amplified and submitted to sequencing or enzymatic assays to screen the allelic variants. The results were compared with their wild sequences in the GenBank. Statistical comparisons employed Student\'s t tests, ANOVA, Wilcoxon rank-sun, Kruskal Wallis rank and linear regression. Results: We observed a significantly lower frequency of longer CAG alleles (> 26 repeats) of AR in the pediatric group compared to the adults carrying the 21-OH genotype from group C/C (p = 0.01). Additionally, the weighted biallelic mean of the CAG tract was considerably lower in patients with clitoromegaly (19.1 ± 2.7) in comparison to patients without it (21.6 ± 2.5), a correlation that was independent of the 21-OH genotype severity. The median of testosterone levels was significantly higher in the CYP17A1*A2 carriers (145.7 ng/dL, 126-153) compared to the ones carrying the wild allele (57 ng/dL, 36-87), from the group A/C of 21-OH genotype. The other variants did not show a correlation with clinical and hormonal phenotypes. Conclusions: We observed that the CAG tract was effective in modulating the phenotype of virilization in nonclassical women as well as influenced the period of onset of manifestations of patients carrying moderate CYP21A2 genotype. Considering the remaining allelic variants, which alter the androgen synthesis or metabolism, we identified the association of CYP17A1*A2 alleles with higher testosterone levels. Although we evaluated a significant number of patients with 21-OHD, we cannot rule out a sample size effect.

Introdução: A deficiência da 21-hidroxilase (21-OHD) é um frequente erro herdado do metabolismo que resulta no comprometimento da síntese do cortisol e/ou aldosterona e aumento da produção de andrógenos. A doença é caracterizada por uma diversidade fenotípica, variando desde virilização pré-natal da genitália externa de fetos femininos e pós-natal em ambos os sexos, com ou sem perda de sal, até quadros assintomáticos. Em seu tratamento é necessária reposição com glicocorticoide para se evitar a insuficiência adrenocortical e os sinais de virilização. Um fino ajuste na dose diária do glicocorticoide é essencial para se evitar sub ou supertratamento, com o objetivo de preservar o potencial de estatura final e fertilidade. Entretanto, tem sido observada maior frequência de obesidade e outras comorbidades metabólicas nestes pacientes; porém, a prevalência destas complicações ainda não é conhecida, bem como se estariam associadas à exposição ao glicocorticoide e/ou com fatores genéticos. Objetivos: avaliar a frequência de obesidade e de síndrome metabólica (SM) em pacientes com 21OHD; caracterizar a distribuição alélica dos polimorfismos dos genes do receptor de glicocorticoide (NR3C1) e da enzima 11beta-hidroxiesteróide desidrogenase tipo I (HSD11B1), e correlacionar a distribuição destes polimorfismos com a presença das complicações metabólicas. Métodos: Foram selecionados 109 pacientes (60 PS/49 VS), sendo 41 crianças e adolescentes (idade média 11,4 ± 3,9 anos) e 68 adultos (idade média 28,4 ± 9 anos) em tratamento com glicocorticoide e com adequado controle hormonal. Pacientes com a forma PS também receberam fludrocortisona. Adequado controle foi caracterizado por concentração normal de atividade plasmática de renina e de andrógenos de acordo com o sexo e idade nos últimos 2 anos. A obesidade nos adultos foi definida pelo IMC >= 30 kg/m² e em crianças e adolescentes pelo IMC acima do percentil 95. Síndrome metabólica foi definida segundo o critério do National Cholesterol Education Program em adultos e crianças. História familiar de hipertensão arterial, diabetes, dislipidemia, obesidade e/ou doença cardiovascular também foi avaliada. Foram mensuradas glicemia, lipoproteínas, triglicérides, colesterol total e insulina. Os alelos BclI, A3669G, ER22/23EK e N363S do gene NR3C1 e o alelo 4436InsA do gene HSD11B1 foram genotipados e as análises de associação com os fenótipos foram realizadas por meio dos testes Chi-quadrado, t-studant e análise de regressão. As análises de correlação foram feitas utilizando o teste de correlação de Pearson. Resultados: Obesidade foi observada em 31,7% das crianças e 23,5% dos adultos. Síndrome metabólica foi observada em 14,6% das crianças e 7,3% dos adultos. A prevalência dos componentes da SM foi maior no grupo dos obesos quando comparada a de pacientes não obesos (crianças e adultos). Não houve correlação significante entre o IMC, sexo, forma clínica da 21-OHD, duração da terapia e dose de GC. História familiar positiva para obesidade, hipertensão, dislipidemia e doença cardiovascular foi mais frequente nos pacientes obesos quando comparada a de pacientes não obesos, em adultos e crianças. Os polimorfismos BclI, A3669G e 4436InsA foram identificados em 23,2%, 9,7% e 14,6% dos alelos das crianças, respectivamente, e nos adultos em 26,4%, 9,6% e 18,4% dos alelos, respectivamente. A variante A3669G foi associada à maiores concentrações de LDL-c em crianças quando comparada aos carreadores do alelo selvagem. Os pacientes adultos carreadores do polimorfismo BclI apresentaram maior IMC, circunferência abdominal e PAS quando comparados aos carreadores do alelo selvagem. Não observamos diferenças estatisticamente significantes no perfil metabólico entre pacientes carreadores e não carreadores do polimorfismo 4436InsA (adultos e crianças). Conclusão: observamos que pacientes 21-OHD possuem maior prevalência de obesidade, e o grupo pediátrico maior prevalência de SM em relação à população de referência, sendo ambas independentes da dose de glicocorticoide e do tempo do tratamento. A presença de perfil metabólico adverso esteve associada à obesidade e à predisposição genética, tais como história familiar e variantes genéticas do receptor de glicocorticoide / Introduction: Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency (21OHD) is a common autosomal recessive disorder that leads to decreased glucocorticoid secretion, with or without mineralocorticoid deficiency, and increased androgen production. The disease is characterized by phenotypic variability, including a severe form with prenatal virilization of the external genitalia in female fetuses and postnatal virilization in both sexes, with or without salt loss. Current therapy aims to provide adequate glucocorticoid (GC) replacement and to suppress the abnormal androgen secretion; mineralocorticoid replacement aims to control the renal salt balance to avoid adrenal crisis. Nevertheless, these therapeutic goals are difficult to achieve in practice due to the complexity of replicating the physiologic cortisol circadian rhythm. Increased prevalence of obesity, insulin resistance, hypertension and adverse lipid profile have been observed among CAH patients under GC therapy; however, the extent of its prevalence and also whether it is associated with the GC dose or with genetic factors are not known. Objectives: to evaluate the obesity and metabolic syndrome (SM) frequencies in 21-OHD patients; to characterize the allelic distribution of the NR3C1 and HSD11B1 polymorphisms, and to correlate with the metabolic profile. Methods: One hundred and nine patients (60SW/49SV) were selected, 41 being children and adolescents (mean age 11.4 ± 3.9 yrs) and 68 adults (mean age 28.4 ± 9 yrs) all of whom received GC treatment and had adequate hormonal control. SW patients also received fludrocortisone. Adequate hormonal control was characterized by normal plasmatic rennin activity and androgen levels according to age and sex for at least two years. Blood fasting was used to obtain glucose, lipoproteins, triglycerides, total cholesterol and insulin levels. Obesity in the adult group was defined by BMI >= 30 kg/m², and in the young group by BMI > 95th percentile. Metabolic syndrome was defined by the NCEP ATPIII criteria. Family history of the hypertension, diabetes, dyslipidemia, obesity and/or cardiovascular disease was also evaluated. The BclI, A3669G, ER22/23EK and N363S alleles of the NR3C1 gene and 4436InsA of the HSD11B1 gene were genotyped and association analyses with phenotype were carried out with Chi-square, t-test and regression analysis. Correlation analyses were performed by Pearson correlation test. Results: obesity was observed in 31.7% of children and 23.5% of adults. SM was observed in 14.6% of young and 7.3% of adult patients. SM prevalence was higher in the obese group than the nonobese group (children and adults). There was no significant correlation between GC dose and BMI, sex, clinical form or treatment duration. Prevalence of family history of obesity, hypertension, dyslipidemia and cardiovascular disease was higher in the obese than in non-obese patients (children and adults). The BclI, A3669G and 4436InsA polymorphisms were found in 23.2%, 9.7% and 14.6% of the alleles in children, respectively and in 26.4%, 9.6% and 18.4% of the alleles in adults. The A3669G variant was associated to increased LDL-c levels in comparison with noncarriers in the young group. The BclI adult carriers presented higher BMI, abdominal circumference and systolic blood pressure in comparison with noncarriers. Statistically significant differences were not observed in the metabolic profile between carriers and non-carriers of the 4436InsA polymorphism (children and adults). Conclusion: in the present study, which analyzed the clinical and metabolic profile of 21-OHD patients, high obesity prevalence, independent of GC dose and treatment duration, was observed. Adverse metabolic profile was mainly associated with obesity and genetic predisposition, such as family history and NR3C1 polymorphisms