L’eczéma allergique de contact (EAC) est une réaction inflammatoire aiguë médiée par les lymphocytes T (LT), survenant suite à l’exposition répétée de la peau avec une molécule allergisante présente dans l’environnement quotidien ou professionnel. Les molécules allergisantes sont des composés de faible poids moléculaire, appelés haptènes, qui activent les cellules dendritiques (DC). Les DC jouent un rôle essentiel dans la mise en place d’un EAC : elles acquièrent un phénotype mature, contrôlé par la voie des MAPK et la voie NF-B, leur permettant de présenter l’haptène aux LT afin d’initier ainsi une réponse immunitaire spécifique.Nous avons identifié au sein de la DC une nouvelle kinase, la protéine kinase CK2, indispensable à l’acquisition d’un phénotype mature et à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires clés dans l’orientation d’une réponse immunitaire. L’activité de la CK2 dans la DC est nécessaire à la génération d’une réponse Th1 en contrôlant la sécrétion d’IFN par les LT, et maintient une réponse Th17 préexistante. De plus, la CK2 permet à la DC de contrôler l’induction d’une réponse Th2 spontanée. Par ailleurs, la CK2 contrôle l’expression des gènes cibles de Nrf2, un facteur de transcription majeur dans la lutte contre le stress chimique induit par les haptènes. L’activation de Nrf2 met en jeu de nombreuses voies de signalisation, et nous avons mis en évidence c-Jun, facteur de transcription activé par les molécules allergisantes, comme un potentiel partenaire transcriptionnel de Nrf2. / Allergic contact dermatitis represents a severe health problem with increasing worldwide prevalence. It is a T cell-mediated inflammatory skin disease caused by chemicals present in daily or professional environment. Contact sensitizers are low molecular weight compounds termed haptens. These molecules are known to induce an up-regulation of phenotypic markers and cytokine secretion in dendritic cells (DCs), professional antigen-presenting cells, leading to the generation of effector T lymphocytes (LT).We identified a new kinase, termed CK2 (formerly casein kinase 2), as a key kinase in DCs in the acquisition of a mature phenotype and in the production of pro-inflammatory cytokines, involved in T cell polarization in response to contact sensitizers. CK2 activity in DC is necessary to induce a Th1 polarization by controlling the secretion of IFN- by LT, and maintains a pre-existing Th17 response. Moreover, CK2 in DC negatively controls a spontaneous Th2 response.Finally, CK2 controls the expression of Nrf2 target genes mRNA. Nrf2 is a protective transcription factor playing a major role in detoxification, oxidative stress and allergic inflammation generated by contact sensitizers. Nrf2 activation involves different kinases and we highlight that c-Jun could be bound to Nrf2 to generate an active transcriptional complex in response to chemicals.

Ein Großteil der Lebensmittel wird in der heutigen Zeit vor allem aufgrund ihrer langen Haltbarkeit in Konservendosen verpackt. Zur Qualitätserhaltung des Lebensmittels werden Weißblechdosen im Innenbereich in der Regel mit einer Lackierung versehen. Lackrohstoffe sind dabei u. a. Phenol- und Epoxidharze, die als Basis- oder Vernetzerkomponente eingesetzt werden. Bei der Herstellung und Lagerung dieser Lebensmittel kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass es zur Migration von Bestandteilen aus der Kunststoffinnenbeschichtung in das Füllgut kommt. Toxikologisch und somit auch analytisch sind dabei vor allem die migrierenden Verbindungen unter 1000 Da von Interesse, da Substanzen mit einer Molmasse von über 1000 Da nur zu weniger als 1 % im Gastrointestinaltrakt absorbiert werden. Analytik von phenolischen Verbindungen Bei Untersuchungen zur Migration phenolischer Verbindungen unter Verwendung verschiedener Modellcoatings und Simulanzlösemittel wurden Konzentrationen an migrierenden phenolischen Substanzen in Summe bis 160 µg/dm² bestimmt, womit dieser Gehalt deutlich unter dem gesetzlichen Grenzwert für die Gesamtmigration von 10 mg/dm² liegt. Die Quantifizierung erfolgte dabei über SEC-FLD-Kalibriergeraden der für diese Coatings verwendeten Phenolharze. Tendenziell steigt dabei die Menge an übergehenden Verbindungen mit abnehmender Polarität der verwendeten Simulanzien. Ebenso abhängig vom Lösungsmittel ist die Molekulargewichts¬verteilung der im Migrat enthaltenen Phenole. So zeigte sich eine deutliche Verschiebung der phenolischen Verbindungen zu höheren Molekulargewichten mit abnehmender Polarität der Simulanzlösemittel. Mit wenigen Ausnahmen besitzen jedoch alle migrierenden Substanzen eine Molmasse von unter 1000 Da. Das beobachtete Migrationsverhalten kann u. a. auf die unterschiedliche Reaktivität der phenolischen Basismonomere der Harze zurückgeführt werden, wodurch die Fähigkeit variiert, unter den Einbrennbedingungen ein ausgeprägtes Netzwerk zu bilden. Zur näheren Charakterisierung der Phenolharze wurden einzelne Hauptverbindungen der RP-HPLC-FLD-Chromatogramme identifiziert. Über Derivatisierungsreaktionen mit Picolinsäure, Essigsäureanhydrid sowie Dansylchlorid konnten Informationen zur Anzahl an alkoholischen und phenolischen Hydroxylgruppen im Molekül erhalten werden. Mit dem Wissen um die eingesetzten Phenolmonomere und einer eventuellen Veretherung konnten Strukturvorschläge erstellt werden. Die Quantifizierung der migrierenden phenolischen Verbindungen in Migraten kommerzieller Coatings in Summe wurde über eine universell anwendbare Kalibrierung angestrebt. Dazu wurden 17 verschiedene Phenolharze bezüglich der Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden, des mittleren Molekulargewichtes, der Hydroxylzahl und dem Verhältnis OH-Gruppen/Molekül charakterisiert. Wie erwartet steigt mit wenigen Ausnahmen die Anzahl der OH-Gruppen im Molekül tendenziell mit dem mittleren Molekulargewicht. Es zeigte sich zudem, dass die verschiedenen Phenolharze in ihren fluorophoren Eigenschaften stark variieren. Die Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden konnte zudem in keine Korrelation mit einem anderen ermittelten Parameter gebracht werden. Die Anwendung einer universellen Kalibriergerade zur Quantifizierung war deshalb nicht möglich. Die Größenordnungen der Migratkonzentrationen konnten daher nur über die zwei im Anstieg am stärksten variierenden SEC-FLD-Kalibriergeraden abgeschätzt werden. Bei der Analyse kommerzieller Epoxy-Phenol-Coatings war im Gegensatz zu Polyester-Phenol-Coatings die isolierte Detektion der phenolischen Verbindungen im Migrat mittels Fluoreszenz nicht möglich, da sowohl Epoxide als auch Phenole fluorophorer Eigenschaft besitzen. Es wurde daher eine Methode zur Abtrennung der Phenole von anderen im Migrat enthaltenen Subtanzen auf Basis eines Anionenaustauschermaterials entwickelt. Dabei wurde die Eigenschaft der Phenole genutzt, im basischen Milieu Phenolate zu bilden. Diese, aber auch Säuren adsorbieren am Austauschermaterial, während Epoxide oder Polyester nicht retardiert werden. Für zwei kommerzielle Epoxy-Phenol-Coatings konnte somit der Anteil an phenolischen Verbindungen im Migrat zu 7 und 28 % bestimmt werden. Mittels RP-HPLC/ESI-MS war es möglich, einige der phenolischen Verbindungen in diesen Migraten zu identifizieren. Dabei handelt es sich um nichtepoxidierte BPA-Derivate der Epoxidkomponente des Coatings, die aufgrund des BPA-Grundkörpers eine phenolische Hydroxylgruppe besitzen. Phenolische Vernetzungsprodukte beider Basisharze konnten dagegen nicht identifiziert werden. Die Menge an migrierenden phenolischen Verbindungen der beiden Epoxy-Phenol-Coatings konnte über die Kalibration eines niedermolekularen Epoxidharzes zu 0,1 mg/dm² bzw. 0,27 mg/dm² abgeschätzt werden. Während für einzelne phenolische Verbindungen gesetzliche Grenzwerte für die Migration bestehen, gibt es für Oligomere, mit Ausnahme von BPA keine spezifischen Migrationslimits. Ebenso sind in der Literatur kaum toxikologische Untersuchungen zu Phenololigomeren zu finden. Um einen ersten Einblick in die toxikologische Relevanz migrierender phenolischer Verbindungen zu erhalten, wurden mehrere kommerzielle als auch selbst synthetisierte phenolische Standardsubstanzen und verschiedene Molekulargewichtsfraktionen eines Phenolharzes, im Fischembryotest an Eiern des Zebrabärblings (Brachydanio rerio) nach DIN 38415-T647 und/oder Neutralrottest an Hep-G2 und HT-29 Zellen untersucht. Die stärksten Effekte im Fischembryotest bewirkte das Trimer BPM, hier reichte bereits eine Konzentration von etwa 2 mg/l aus, um 50 % der Fischembryonen letal zu schädigen. Im Gegensatz dazu waren beim Dimer 5-Hydroxymethyl-2,4´-dihydroxydiphenylmethan (M 230) mit einem EC50-Wert von 170 mg/l die geringste toxikologische Wirkung zu beobachten. Für alle anderen Subtanzen konnten EC50-Werte im Bereich 20 - 100 mg/l bestimmt werden. Tendenziell zeichnete sich dabei eine Zunahme der EC50-Werte mit steigender Lipophilie, ausgedrückt über den KOW-Wert ab, was auf den Aufbau der Fischeier zurückzuführen ist. So müssen die zu untersuchenden Xenobiotika mehrere lipophile Membranen durchdringen, um am eigentlichen Wirkungsort Einfluss auf die Embryonalentwicklung nehmen zu können. Im Zelltest konnten tendenziell ähnliche Ergebnisse ermittelt werden wie im Fischembryotest, wobei in der Regel die Hep-G2 Zellen empfindlicher reagieren als die HT-29 Zellen. Während für Phenol im untersuchten Konzentrationsbereich keine toxischen Effekte beobachtet werden konnten, liegen die EC50-Werte für das Trimer BPM, analog zum Fischembryotest deutlich unter 10 mg/l. Für die anderen Verbindungen wurden EC50-Werte zwischen 16 und 100 mg/l bestimmt. Analog zu den Untersuchungen der Einzelsubstanzen zeigte sich auch bei den 5 untersuchten Molekulargewichtsfraktionen zwischen 0 und 1000 Da, dass das toxikologische Potential im niedermolekularen Bereich (0 - 200 Da) gegenüber den Fraktionen 200 400 und 400 600 Da vergleichsweise gering ist. Bereits 25,1 mg/l bzw. 17,3 mg/l der Fraktionen 200 400 Da und 400 600 Da waren in den Tests ausreichend, um alle Embryonen letal zu schädigen. Im Molekulargewichtsbereich über 600 Da konnten dagegen lediglich subletale oder gar keine Missbildungen beobachtet werden. Analytik von Epoxiden In der amtlichen Überwachung beschränkt sich die Analytik von Epoxidverbindungen bisher auf die Bestimmung rechtlich geregelter Einzelsubstanzen. Eine Summenmethode zur Erfassung aller in einem Migrat enthaltenen Substanzen mit reaktionsfähigen Oxirangruppen, wodurch das gesamte Reaktionspotential erfasst werden kann, liegt dagegen nicht vor. Zur selektiven Erfassung aller oxirangruppenhaltigen Verbindungen wurde daher mittels statistischer Versuchsplanung eine Derivatisierung mittels Cysteamin entwickelt. Die Reaktion mit Cysteamin erfolgt dabei nach Abtrennung der Substanzen > 1000 Da mittels Größenausschlusschromatographie. Im Anschluss werden die Derivate durch Zugabe eines Kationenaustauschers aus der Lösung entfernt. Durch den Vergleich der RP-HPLC-FLD Chromatogramme vor und nach der Aufarbeitung können Substanzen mit intakten Oxirangruppen somit einfach erkannt werden. Eine quantitative Abschätzung der enthaltenen Epoxidverbindungen ist bei Lacken auf Basis von BPA-Harzen über die BPA-Chromophorkonzentration möglich. Bei der Untersuchung von 5 kommerziellen Coatings wurden in den einzelnen Migraten recht unterschiedliche Gehalte an Substanzen mit intakten Epoxidgruppen ermittelt. Ebenso ist die Anzahl der oxriangruppenhaltigen Verbindungen, auf die sich dieser Gehalt verteilt sehr unterschiedlich, was möglicherweise an unterschiedlichen Einbrennzeiten, -temperaturen aber auch der Menge an Lack pro m² und an der Art und Menge des Reaktionspartners liegt. Für die Konzentration der epoxidischen Verbindungen in den Coatingmigraten wurden Werte zwischen 18,5 und 835 µg/dm² bestimmt. Dies entspricht einem Anteil der reaktionsfähigen Substanzen an der Fraktion unter 1000 Da berechnet über die Flächen im Chromatogramm zwischen 2,6 und 76,3 %. Neben dem Einsatz als Basismaterial für Konservendoseninnenbeschichtungen werden Epoxidharzsysteme auch in Zubereitungen wie Grundierungen, Füllmassen, Lacken oder Klebstoffen für die Bauchemie vielfach in verschiedenen Mischungen (aromatische, aliphatische oder cycloaliphatische Glycidylether bzw. Siloxanglycidylether) eingesetzt. Durch den Kontakt dieser Materialien mit der Haut kann es zu Kontaktekzemen kommen, deren Ursache durch Epikutantests (Patchtests) mit den potentiell auslösenden Substanzen ermittelt werden kann. Der Umfang der in den Standardtestsystemen enthalten Testsubstanzen entspricht dabei jedoch nicht dem Spektrum der in der Industrie verwendeten Materialien. Über die genaue Zusammensetzung der in den Patchtest´s eingesetzten Materialien ist zudem wenig bekannt. Durch die Analyse einer Vielzahl von Patchtestsubstanzen und industriellen Epoxidkomponenten mittels RP-HPLC/UVD bzw. -ELSD Chromatographie und die Identifizierung der enthaltenen Verbindungen über RP-HPLC/ESI-MSD, konnte ein genaueres Bild über den Charakter dieser Materialen gewonnen werden. Bei den BPA- und BPF-Harzen wurden überwiegend Monomere, die entsprechenden Di- und Trimere aber auch dessen hydrolysierte Verbindungen identifiziert. Im Gegensatz dazu liegen bei den analysierten aliphatischen Produkten z. T. die reinen Glycidylether gar nicht oder nur in geringen prozentualen Anteilen vor. Vielmehr wird durch die sauer geführte Reaktion bei den aliphatischen Verbindungen die Bildung von 1,3 Chlorhydrinen als Nebenreaktion zur 1,2 Chlorhydrinbildung gefördert, wodurch eine beträchtliche Menge an Substanzen, die nicht verseifbares Chlor enthalten, in den Materialien vorhanden ist. Um die enthaltenen Verbindungen von aliphatischen und cycloaliphatischen Epoxidzubereitungen quantifizieren zu können, wurde eine Derivatisierung mit einem selbst synthetisierten Fluorophor (5-(Dimethylamino)-N-(2-mercaptoethyl)-1-naphthalen-sulfonamid) entwickelt. Dadurch konnten auch Verbindungen erfasst werden, die aufgrund ihrer Flüchtigkeit mittels ELSD nicht detektierbar waren. Bei der Analyse von Handelsprodukten zeigte sich, dass die einzelnen Komponenten in ihrer Zusammensetzung gut mit den untersuchten aromatischen und aliphatischen Rohmaterialien vergleichbar sind. Bei entsprechend eingesetzten Patchtestsubstanzen spiegeln diese somit die Produkte gut wieder, mit denen die Patienten in Kontakt kommen.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2005. / Härtill 6 uppsatser.

Les eczémas [eczéma allergique de contact (EAC) et l'eczéma atopique (EA)] sont des dermatoses inflammatoires fréquentes des pays industrialisés. Elles sont induites suite au recrutement et à l'activation dans la peau de lymphocytes T spécifiques d'allergènes, qui sont présents dans notre environnement, et qui sont habituellement très bien tolérés par la majoritédes individus exposés. Ce travail de thèse porte sur un aspect novateur de la physiopathologie des eczémas, à savoir : la contribution des lymphocytes T mémoires résidants (LTrm) dans la peau à la chronicité et à la sévérité de ces maladies.Capitalisant sur des modèles précliniques pertinents ainsi que sur des échantillons cliniques prélevés chez les patients, ce travail a permis d'acquérir de nouvelles connaissances : (i) de nombreux LTrm CD8+ spécifiques colonisent les lésions d'eczéma (ii) ils s'accumulent avecla persistance de l'allergène dans la peau, (iii) ils jouent un rôle majeur dans les récidives de la maladie, mais (iv) ils expriment à leur surface divers récepteurs inhibiteurs, tels que PD-1 ou TIM-3, qui empêchent la survenue de réponses allergiques excessives.Ces travaux apportent donc des informations majeures sur la nature unique des LTrm CD8+ spécifiques d'allergènes et des mécanismes qui contrôlent leur réactivation, afin de préserver l'intégrité de la peau et la survenue de réactions chroniques sévères. Le développement des nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la réactivation des LTrm via leurs récepteursinhibiteurs pourrait permettre de restaurer la tolérance chez les individus allergiques / Allergic contact dermatitis (ACD) and atopic dermatitis (AD), also referred to contact or atopic eczema, are frequent skin inflammatory diseases with increasing prevalence and high socioeconomic impact in Western countries. Eczemas are the prototype of skin delayed-type hypersensitivity reactions. Skin lesions are induced by the recruitment and activation in the skin of effector/memory T cells specific for environmental antigens that are innocuous to healthy non-allergic individuals.The aim of this work was to better understand the pathophysiology of eczemas by a comprehensive analysis of the contribution of skin resident memory T cells (Trm) to the chronicity and severity of these diseases.Capitalizing on relevant preclinical eczema models and on clinical samples collected from allergic patients, this work showed that: (i) numerous allergen-specific CD8+Trm colonize the eczema lesion, (ii) they accumulate in the epidermis in response to the long-term persistence of the allergen in the skin, (iii) they are instrumental for the recurrence of eczema, but (iv) theyexpress several inhibitory check point receptors (ICRs, such as PD-1, TIM-3) at their surface, which keep them in check to prevent the development of severe immunopathology.Thus, our work provides important information for considering the unique nature of hapteninduced CD8+ Trm and the mechanisms that prevent their unwanted reactivation and subsequent development of chronic or severe skin allergy. The development of therapeutic strategies targeting the reactivation of skin Trm in situ via their ICRs should open new avenues to restore tolerance in allergic individuals

Les nanoparticules (NPs) organiques représentent un outil majeur d'innovation en dermatologie. L'objectif de cette thèse a été de développer et d'optimiser des procédés d'encapsulation d'un mélange de molécules odorantes appelé fragrance mix I (FMI) dans des nanoparticules (NPs) de différentes natures: NPs polymères (poly-ε-caprolactone, PCL), ou NPs lipidiques solides (SLNs) (à base de vaseline, beurre de karité, cire de candelilla, triglycérides C10-18, ou palmitate de cétyle). Ces nouveaux systèmes ont alors été évalués pour la vectorisation de ce mélange à travers un explant de peau de porc, afin de modéliser la distribution des molécules composant le FMI dans les différentes assises cutanées. En parallèle, elles ont également été appliquées en tant que promoteurs de solubilisation du FMI pour le développement d'un nouveau test de diagnostic in vitro de l'allergie aux parfums. Nos résultats montrent que: (i) les NPs polymères, principalement anioniques, sont les plus adaptées pour promouvoir la pénétration transépidermique du FMI. Au contraire, les SLNs s'agglomèrent dans le stratum corneum, conduisant à une accumulation du FMI dans cette assise ; (ii) qu'au-delà du type de vecteur utilisé, la pénétration des molécules du FMI dans les couches les plus profondes de la peau dépend de leur coefficient de partage intrinsèque ; (iii) que les nanoparticules de PCL augmentent significativement la solubilisation du FMI dans les milieux de culture conventionnels et permettent ainsi une réactivation robuste des lymphocytes T spécifiques circulant chez des patients présentant une allergie au parfums. L'ensemble de ces résultats confirme donc tout le potentiel des NPs organiques pour le développement de futures stratégies de délivrance ciblée de plusieurs actifs dans les différents compartiments cutanés. Ces nouveaux vecteurs offrent en outre une alternative prometteuse pour améliorer le diagnostic de l'eczéma de contact induit par les parfums et plus généralement par des allergènes hydrophobes / The aim of this work was to develop and optimize methods for fragrance mix I (FMI) encapsulation into nanoparticles (NPs) of two types of nanoparticles (NPs) : polymeric NPs (poly-ε-caprolactone, PCL) and solid lipid NPs (SLNs) (prepared with petrolatum, shea butter, candelilla wax, C10-18 triglycerides, or cetyl palmitate). Then, these new NPss were evaluated as vectors through a pig skin to analyze the distribution of the FMI molecules in the different skin layers. In parallel, NPs have also been applied as solubilizers for the development of a new in vitro test for the diagnosis of fragrance allergy. Our results show that (i) NPs polymers, mainly anionic NPs, are the most suitable vectors to promote trans-epidermal penetration of fragrance. On the contrary, SLNs were found in the stratum corneum, leading to an accumulation of fragrance in this layer; (ii) whatever the type of NPs, the penetration of the FMI molecules in the deeper layers of the skin depends on their intrinsic partition coefficient; (iii) PCL-NPs significantly increase the FMI solubilization in conventional culture media and, allowing a robust reactivation of circulating specific T cells in patients with allergy to fragrances. All of these results confirm the potential of organic NPs for the development of future strategies (for the skin delivery of several actives in the different skin layers). These new vectors further offer a promising alternative to improve the diagnosis of contact dermatitis induced by fragrances and more generally by hydrophobic allergens

L’allergie de contact est une pathologie de la peau particulièrement répandue dans les pays industrialisés. Aucune thérapie ne permet actuellement de la soigner et seule l’éviction de l’allergène permet de la prévenir. Historiquement, l’évaluation du potentiel sensibilisant des molécules mises sur le marché a toujours été réalisée au moyen de tests sur l’animal. Cependant, le champ d’action de ces tests est aujourd’hui limité en raison de la nouvelle législation européenne sur les cosmétiques. Dans ce contexte, le développement de méthodes alternatives ne reposant pas sur l’utilisation d’animaux devient capital. L’allergie de contact repose sur une étape chimique clé : la formation d’un complexe antigénique allergène-protéine capable d’activer le système immunitaire cutané. Le but de ce travail de thèse a été d’étudier le comportement in situ d’allergènes au sein d’épidermes reconstruits de type SkinEthic®. A l’aide d’une technique d’analyse non invasive, la spectroscopie RMN HRMAS, il a été possible de suivre le devenir de différents allergènes, de leur éventuelle activation par voie métabolique, jusqu’à leur fixation sur les protéines épidermiques. / Contact dermatitis is a skin pathology particularly prevalent in industrialized countries. No therapy currently exists and only complete avoidance of the particular allergen can prevent an allergic reaction. Historically, the assessment of skin sensitisation potential of molecules placed on the market was always carried out by animal testing. However, the scope of this testing method is now limited by the new European cosmetics legislation. In this way, the development of alternative methods, not based on animal experimentation, become an important issue. Contact dermatitis results of a chemical key step: the formation of an antigenic complex allergen-protein complexe able to activate the cutaneous immune system. The aim of this PhD work was to study the in situ behaviour of allergens in reconstructed human epidermis (SkinEthic® model). By using an appropriate non-invasive analysis technique, HR-MAS NMR spectroscopy, it has been possible to study the mode of action of different allergens, from their possible activation through the metabolic pathway to the binding with epidermal proteins.

La voie des RLR (RIG-I like Receptors) joue un rôle essentiel dans la détection des virus à ARN, déclenchant une réponse immunitaire antivirale grâce au recrutement de la protéine adaptatrice mitochondriale MAVS (Mitochondrial AntiViral Signaling protein). Nous avons mis en évidence que les souris déficientes pour la protéine MAVS (MAVS KO) présentaient un phénotype proallergénique dans un modèle d'inflammation stérile d'hypersensibilité retardée de contact (HSRC) qui reproduit la dermatite allergique de contact (DAC) chez l'homme. Nous avons caractérisé le système immunitaire des souris MAVS KO en condition d'équilibre et durant la réponse d'HSRC. Nous avons identifié un rôle du microbiote intestinal des souris MAVS KO dans l'exacerbation de réponse d'HSRC et mis en évidence une dysbiose du microbiote bactérien. Nous avons démontré que la dysbiose était responsable du phénotype inflammatoire observé, phénotype transmissible à des souris sauvages par des expériences de cohébergement et de transplantation fécale. Cette dysbiose induit une augmentation de la perméabilité intestinale chez les souris MAVS KO lors de la réponse d'HSRC, aboutissant à une translocation bactérienne dans les organes lymphoïdes et à la modulation des réponses immunitaires à l'origine de l'exacerbation de réponse d'hypersensibilité. La 2ème partie de ma thèse vise à étudier les conséquences de la déficience en MAVS sur le métabolisme glucidique. Nos expériences ont démontré que les souris MAVS KO développaient une surcharge pondérale et une insulino-résistance sous régime riche en lipides et sucrose, dépendants de la dysbiose intestinale. Au niveau cellulaire, une altération des interactions aux points de contact entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique a été observée. Nos résultats permettent d'envisager le développement de nouvelles approches thérapeutiques des pathologies allergiques et métaboliques humaines par la modulation du microbiote intestinal / RIG-I like receptors (RLRs) play a major role in response to cytosolic viral RNAs by initiating an antiviral immune response through the recruitment of the mitochondrial adaptor protein MAVS (Mitochondrial AntiViral Signaling protein). We showed that MAVS-deficient mice developed an exacerbated response in a sterile inflammatory model of Contact Hypersensitivity (CHS), that reproduces the pathophysiology of allergic contact dermatitis (ACD) in human. We characterized the immune system of MAVS KO mice at steady state and during CHS response. We found that MAVS deficiency leads to changes in the gut bacterial composition suggesting an unexpected role of the RLR pathway in the regulation of intestinal homeostasis. We demonstrated that intestinal dysbiosis is responsible for the increased CHS response, and showed that the inflammatory phenotype of MAVS KO mice can be transferred to WT mice by cohousing and fecal transplantation. We demonstrated that the dysbiotic gut microbiota exerts its effect due to an increased intestinal permeability during DTH sensitization. The ensuing bacterial translocation within lymphoid organs enhances characteristic cytokines production that increases CHS response. The 2nd part of my thesis aimed to study the consequences of MAVS deficiency on glucose metabolism. Our experiments showed that MAVS KO mice exhibit disorders of glucose homeostasis during high fat diet (HFD) associated with the development of overweight and insulin resistance. We also observed alterations of MAM (Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes), contact poins between mitochondria and endoplasmic reticulum. Recent preliminary data suggested that the metabolic disorders associated with MAVS deficiency are due to intestinal dysbiosis. Our results highlight a new role for the RLR pathway and allow to consider the development of new therapeutic approaches to human allergic and metabolic diseases by modulation of the intestinal microbiota

La tolérance périphérique vis-à-vis de molécules potentiellement allergéniques en contact avec la peau joue un rôle essentiel pour prévenir le développement de l’eczéma allergique de contact (EAC). Au cours de ma thèse, j'ai contribué à l'identification des mécanismes et des acteurs responsables de l'induction de la tolérance par voie cutanée et à préciser le rôle respectif des sous-populations de cellules dendritiques (DC) cutanées dans la rupture de la tolérance et l'induction de lymphocytes T (LT) CD8+ initiant l'EAC. A l'aide d'un modèle murin d'induction de tolérance aux haptènes, j’ai pu montrer que les cellules de Langerhans (LC) épidermiques sont les cellules clés pour induire la tolérance cutanée et empêcher le développement d'un EAC médié par les LT CD8+. En effet, suite à l’application épicutanée d’un allergène/haptène faible, le DNTB, les LC migrent de la peau aux ganglions lymphatiques pour présenter l’antigène aux LT CD8+. Des expériences de déplétion in vivo et de transfert adoptif montrent que les LC sont responsables de la suppression de l’EAC en prévenant la différentiation des LT CD8+ spécifiques de l'allergène en cellules T cytotoxiques via deux mécanismes complémentaires: i) l’anergie/délétion des LT CD8+ et ii) l'activation de LT régulateurs Foxp3+ exprimant ICOS. Après avoir identifié des conditions d'immunisation conduisant au développement d'un EAC au DNTB, j'ai montré que la rupture de tolérance à ce type d'allergène est associée à i) à des modifications phénotypiques des LC épidermiques, ii) au recrutement rapide de monocytes inflammatoires Gr1+ dans la peau et iii) à une capacité équivalente des LC et des DC dermiques Langerin- à présenter l'allergène aux LT CD8+ dans les ganglions. Dans cette situation, les LC jouent un rôle pro-inflammatoire puisque leur déplétion réduit de manière dramatique l'induction de LT CD8+ effecteurs et l'EAC. Ces résultats indiquent que les LC jouent un rôle essentiel à la fois dans la prévention et dans l’induction de l’EAC, et que leur fonction tolérogène ou stimulatrice est vraisemblablement conditionnée par le microenvironnement cutané lors de la pénétration de l’allergène / Induction of peripheral tolerance to potentially allergenic molecules in contact with the skin is essential to prevent the development of allergic contact dermatitis (ACD). During my PhD, I contributed to the identification of the mechanisms and actors responsible for the induction of skin tolerance and clarified the respective roles of dendritic cell (DC) subsets in the breakdown of skin tolerance leading to the priming of cytotoxic CD8+ T cells and developpement of ACD. Using a mouse model of cutaneous tolerance to a model weak allergen, we show that epidermal Langerhans cells (LC) are essential to induce CD8+ T cell tolerance and prevent the development of ACD. Indeed, following the epicutaneous delivery of the weak allergen/hapten DNTB, LC were found to migrate from skin to draining lymph nodes to present the allergen to CD8+ T cells. Depletion and adoptive transfer experiments revealed that LC protect from development of ACD by preventing the priming of allergenspecific cytotoxic CD8+ T cells via two complementary mechanisms: i) anergy/deletion of allergen-specific CD8+ T cells and ii) activation of highly suppressive Foxp3+ regulatory T cells expressing ICOS. We identified DNTB skin delivery conditions that allow for CD8+ T cell priming and initiation of ACD. Breakdown of tolerance to this weak allergen was associated with i) phenotypic modifications of epidermal LC, ii) recruitment of inflammatory monocytes to the skin and iii) allergen presentation to CD8+ T cells by both LC and dermal Langerin- DC. In addition, LC are involved in tolerance breakdown as their depletion prior to skin immunization abrogated induction of CD8+ effector cells and ACD. These results demonstrate that LC are essential for both the induction of skin tolerance to weak skin allergens and for the induction of ACD, and suggest that their tolerogenic versus immuno-stimulatory function is likely dictated by signals from the skin microenvironment after penetration of the allergen

Ein Großteil der Lebensmittel wird in der heutigen Zeit vor allem aufgrund ihrer langen Haltbarkeit in Konservendosen verpackt. Zur Qualitätserhaltung des Lebensmittels werden Weißblechdosen im Innenbereich in der Regel mit einer Lackierung versehen. Lackrohstoffe sind dabei u. a. Phenol- und Epoxidharze, die als Basis- oder Vernetzerkomponente eingesetzt werden. Bei der Herstellung und Lagerung dieser Lebensmittel kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass es zur Migration von Bestandteilen aus der Kunststoffinnenbeschichtung in das Füllgut kommt. Toxikologisch und somit auch analytisch sind dabei vor allem die migrierenden Verbindungen unter 1000 Da von Interesse, da Substanzen mit einer Molmasse von über 1000 Da nur zu weniger als 1 % im Gastrointestinaltrakt absorbiert werden. Analytik von phenolischen Verbindungen Bei Untersuchungen zur Migration phenolischer Verbindungen unter Verwendung verschiedener Modellcoatings und Simulanzlösemittel wurden Konzentrationen an migrierenden phenolischen Substanzen in Summe bis 160 µg/dm² bestimmt, womit dieser Gehalt deutlich unter dem gesetzlichen Grenzwert für die Gesamtmigration von 10 mg/dm² liegt. Die Quantifizierung erfolgte dabei über SEC-FLD-Kalibriergeraden der für diese Coatings verwendeten Phenolharze. Tendenziell steigt dabei die Menge an übergehenden Verbindungen mit abnehmender Polarität der verwendeten Simulanzien. Ebenso abhängig vom Lösungsmittel ist die Molekulargewichts¬verteilung der im Migrat enthaltenen Phenole. So zeigte sich eine deutliche Verschiebung der phenolischen Verbindungen zu höheren Molekulargewichten mit abnehmender Polarität der Simulanzlösemittel. Mit wenigen Ausnahmen besitzen jedoch alle migrierenden Substanzen eine Molmasse von unter 1000 Da. Das beobachtete Migrationsverhalten kann u. a. auf die unterschiedliche Reaktivität der phenolischen Basismonomere der Harze zurückgeführt werden, wodurch die Fähigkeit variiert, unter den Einbrennbedingungen ein ausgeprägtes Netzwerk zu bilden. Zur näheren Charakterisierung der Phenolharze wurden einzelne Hauptverbindungen der RP-HPLC-FLD-Chromatogramme identifiziert. Über Derivatisierungsreaktionen mit Picolinsäure, Essigsäureanhydrid sowie Dansylchlorid konnten Informationen zur Anzahl an alkoholischen und phenolischen Hydroxylgruppen im Molekül erhalten werden. Mit dem Wissen um die eingesetzten Phenolmonomere und einer eventuellen Veretherung konnten Strukturvorschläge erstellt werden. Die Quantifizierung der migrierenden phenolischen Verbindungen in Migraten kommerzieller Coatings in Summe wurde über eine universell anwendbare Kalibrierung angestrebt. Dazu wurden 17 verschiedene Phenolharze bezüglich der Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden, des mittleren Molekulargewichtes, der Hydroxylzahl und dem Verhältnis OH-Gruppen/Molekül charakterisiert. Wie erwartet steigt mit wenigen Ausnahmen die Anzahl der OH-Gruppen im Molekül tendenziell mit dem mittleren Molekulargewicht. Es zeigte sich zudem, dass die verschiedenen Phenolharze in ihren fluorophoren Eigenschaften stark variieren. Die Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden konnte zudem in keine Korrelation mit einem anderen ermittelten Parameter gebracht werden. Die Anwendung einer universellen Kalibriergerade zur Quantifizierung war deshalb nicht möglich. Die Größenordnungen der Migratkonzentrationen konnten daher nur über die zwei im Anstieg am stärksten variierenden SEC-FLD-Kalibriergeraden abgeschätzt werden. Bei der Analyse kommerzieller Epoxy-Phenol-Coatings war im Gegensatz zu Polyester-Phenol-Coatings die isolierte Detektion der phenolischen Verbindungen im Migrat mittels Fluoreszenz nicht möglich, da sowohl Epoxide als auch Phenole fluorophorer Eigenschaft besitzen. Es wurde daher eine Methode zur Abtrennung der Phenole von anderen im Migrat enthaltenen Subtanzen auf Basis eines Anionenaustauschermaterials entwickelt. Dabei wurde die Eigenschaft der Phenole genutzt, im basischen Milieu Phenolate zu bilden. Diese, aber auch Säuren adsorbieren am Austauschermaterial, während Epoxide oder Polyester nicht retardiert werden. Für zwei kommerzielle Epoxy-Phenol-Coatings konnte somit der Anteil an phenolischen Verbindungen im Migrat zu 7 und 28 % bestimmt werden. Mittels RP-HPLC/ESI-MS war es möglich, einige der phenolischen Verbindungen in diesen Migraten zu identifizieren. Dabei handelt es sich um nichtepoxidierte BPA-Derivate der Epoxidkomponente des Coatings, die aufgrund des BPA-Grundkörpers eine phenolische Hydroxylgruppe besitzen. Phenolische Vernetzungsprodukte beider Basisharze konnten dagegen nicht identifiziert werden. Die Menge an migrierenden phenolischen Verbindungen der beiden Epoxy-Phenol-Coatings konnte über die Kalibration eines niedermolekularen Epoxidharzes zu 0,1 mg/dm² bzw. 0,27 mg/dm² abgeschätzt werden. Während für einzelne phenolische Verbindungen gesetzliche Grenzwerte für die Migration bestehen, gibt es für Oligomere, mit Ausnahme von BPA keine spezifischen Migrationslimits. Ebenso sind in der Literatur kaum toxikologische Untersuchungen zu Phenololigomeren zu finden. Um einen ersten Einblick in die toxikologische Relevanz migrierender phenolischer Verbindungen zu erhalten, wurden mehrere kommerzielle als auch selbst synthetisierte phenolische Standardsubstanzen und verschiedene Molekulargewichtsfraktionen eines Phenolharzes, im Fischembryotest an Eiern des Zebrabärblings (Brachydanio rerio) nach DIN 38415-T647 und/oder Neutralrottest an Hep-G2 und HT-29 Zellen untersucht. Die stärksten Effekte im Fischembryotest bewirkte das Trimer BPM, hier reichte bereits eine Konzentration von etwa 2 mg/l aus, um 50 % der Fischembryonen letal zu schädigen. Im Gegensatz dazu waren beim Dimer 5-Hydroxymethyl-2,4´-dihydroxydiphenylmethan (M 230) mit einem EC50-Wert von 170 mg/l die geringste toxikologische Wirkung zu beobachten. Für alle anderen Subtanzen konnten EC50-Werte im Bereich 20 - 100 mg/l bestimmt werden. Tendenziell zeichnete sich dabei eine Zunahme der EC50-Werte mit steigender Lipophilie, ausgedrückt über den KOW-Wert ab, was auf den Aufbau der Fischeier zurückzuführen ist. So müssen die zu untersuchenden Xenobiotika mehrere lipophile Membranen durchdringen, um am eigentlichen Wirkungsort Einfluss auf die Embryonalentwicklung nehmen zu können. Im Zelltest konnten tendenziell ähnliche Ergebnisse ermittelt werden wie im Fischembryotest, wobei in der Regel die Hep-G2 Zellen empfindlicher reagieren als die HT-29 Zellen. Während für Phenol im untersuchten Konzentrationsbereich keine toxischen Effekte beobachtet werden konnten, liegen die EC50-Werte für das Trimer BPM, analog zum Fischembryotest deutlich unter 10 mg/l. Für die anderen Verbindungen wurden EC50-Werte zwischen 16 und 100 mg/l bestimmt. Analog zu den Untersuchungen der Einzelsubstanzen zeigte sich auch bei den 5 untersuchten Molekulargewichtsfraktionen zwischen 0 und 1000 Da, dass das toxikologische Potential im niedermolekularen Bereich (0 - 200 Da) gegenüber den Fraktionen 200 400 und 400 600 Da vergleichsweise gering ist. Bereits 25,1 mg/l bzw. 17,3 mg/l der Fraktionen 200 400 Da und 400 600 Da waren in den Tests ausreichend, um alle Embryonen letal zu schädigen. Im Molekulargewichtsbereich über 600 Da konnten dagegen lediglich subletale oder gar keine Missbildungen beobachtet werden. Analytik von Epoxiden In der amtlichen Überwachung beschränkt sich die Analytik von Epoxidverbindungen bisher auf die Bestimmung rechtlich geregelter Einzelsubstanzen. Eine Summenmethode zur Erfassung aller in einem Migrat enthaltenen Substanzen mit reaktionsfähigen Oxirangruppen, wodurch das gesamte Reaktionspotential erfasst werden kann, liegt dagegen nicht vor. Zur selektiven Erfassung aller oxirangruppenhaltigen Verbindungen wurde daher mittels statistischer Versuchsplanung eine Derivatisierung mittels Cysteamin entwickelt. Die Reaktion mit Cysteamin erfolgt dabei nach Abtrennung der Substanzen > 1000 Da mittels Größenausschlusschromatographie. Im Anschluss werden die Derivate durch Zugabe eines Kationenaustauschers aus der Lösung entfernt. Durch den Vergleich der RP-HPLC-FLD Chromatogramme vor und nach der Aufarbeitung können Substanzen mit intakten Oxirangruppen somit einfach erkannt werden. Eine quantitative Abschätzung der enthaltenen Epoxidverbindungen ist bei Lacken auf Basis von BPA-Harzen über die BPA-Chromophorkonzentration möglich. Bei der Untersuchung von 5 kommerziellen Coatings wurden in den einzelnen Migraten recht unterschiedliche Gehalte an Substanzen mit intakten Epoxidgruppen ermittelt. Ebenso ist die Anzahl der oxriangruppenhaltigen Verbindungen, auf die sich dieser Gehalt verteilt sehr unterschiedlich, was möglicherweise an unterschiedlichen Einbrennzeiten, -temperaturen aber auch der Menge an Lack pro m² und an der Art und Menge des Reaktionspartners liegt. Für die Konzentration der epoxidischen Verbindungen in den Coatingmigraten wurden Werte zwischen 18,5 und 835 µg/dm² bestimmt. Dies entspricht einem Anteil der reaktionsfähigen Substanzen an der Fraktion unter 1000 Da berechnet über die Flächen im Chromatogramm zwischen 2,6 und 76,3 %. Neben dem Einsatz als Basismaterial für Konservendoseninnenbeschichtungen werden Epoxidharzsysteme auch in Zubereitungen wie Grundierungen, Füllmassen, Lacken oder Klebstoffen für die Bauchemie vielfach in verschiedenen Mischungen (aromatische, aliphatische oder cycloaliphatische Glycidylether bzw. Siloxanglycidylether) eingesetzt. Durch den Kontakt dieser Materialien mit der Haut kann es zu Kontaktekzemen kommen, deren Ursache durch Epikutantests (Patchtests) mit den potentiell auslösenden Substanzen ermittelt werden kann. Der Umfang der in den Standardtestsystemen enthalten Testsubstanzen entspricht dabei jedoch nicht dem Spektrum der in der Industrie verwendeten Materialien. Über die genaue Zusammensetzung der in den Patchtest´s eingesetzten Materialien ist zudem wenig bekannt. Durch die Analyse einer Vielzahl von Patchtestsubstanzen und industriellen Epoxidkomponenten mittels RP-HPLC/UVD bzw. -ELSD Chromatographie und die Identifizierung der enthaltenen Verbindungen über RP-HPLC/ESI-MSD, konnte ein genaueres Bild über den Charakter dieser Materialen gewonnen werden. Bei den BPA- und BPF-Harzen wurden überwiegend Monomere, die entsprechenden Di- und Trimere aber auch dessen hydrolysierte Verbindungen identifiziert. Im Gegensatz dazu liegen bei den analysierten aliphatischen Produkten z. T. die reinen Glycidylether gar nicht oder nur in geringen prozentualen Anteilen vor. Vielmehr wird durch die sauer geführte Reaktion bei den aliphatischen Verbindungen die Bildung von 1,3 Chlorhydrinen als Nebenreaktion zur 1,2 Chlorhydrinbildung gefördert, wodurch eine beträchtliche Menge an Substanzen, die nicht verseifbares Chlor enthalten, in den Materialien vorhanden ist. Um die enthaltenen Verbindungen von aliphatischen und cycloaliphatischen Epoxidzubereitungen quantifizieren zu können, wurde eine Derivatisierung mit einem selbst synthetisierten Fluorophor (5-(Dimethylamino)-N-(2-mercaptoethyl)-1-naphthalen-sulfonamid) entwickelt. Dadurch konnten auch Verbindungen erfasst werden, die aufgrund ihrer Flüchtigkeit mittels ELSD nicht detektierbar waren. Bei der Analyse von Handelsprodukten zeigte sich, dass die einzelnen Komponenten in ihrer Zusammensetzung gut mit den untersuchten aromatischen und aliphatischen Rohmaterialien vergleichbar sind. Bei entsprechend eingesetzten Patchtestsubstanzen spiegeln diese somit die Produkte gut wieder, mit denen die Patienten in Kontakt kommen.