Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / Introdução: A criptococose e a terceira causa de infeccao fungica invasiva nos pacientes submetidos a transplante renal, apresentando alta mortalidade. Objetivo: Descrever as caracteristicas epidemiologicas, clinicas e diagnostica, assim como os fatores prognosticos e o impacto da anfotericina B sobre a funcao do enxerto da criptococose em pacientes submetidos a transplante renal. Metodos: Foi utilizada ficha clinica padrao, com mais de 250 variaveis, para avaliar todos os casos de criptococose acompanhados nos hospitais do complexo UNIFESP/EPM durante o periodo de janeiro de 1995 a janeiro de 2007. Resultados: Um total de 40 casos de criptococose foi identificado entre 4.727 transplantes renais, sendo 67,5 por cento do genero masculino. Desses, 37,5 por cento apresentaram rejeicao do enxerto previa a micose e 30 por cento dos casos eram portadores de hepatite C. A criptococose ocorreu com media de 4,5 anos apos o transplante renal, sendo que em 77,5 por cento dos casos ocorreu apos um ano do transplante. O antigeno criptococico teve alta sensibilidade, mas, correlacao limitada com a evolucao clinica frente ao tratamento. Os comprometimentos mais frequentes foram: do sistema nervoso central (75 por cento), pulmonar (30 por cento), cutaneo (30 por cento) e doenca disseminada (40 por cento). Dos 40 pacientes, 97,5 por cento foram tratados, sendo a anfotericina B utilizada em 89,7 por cento dos casos. A diminuicao da imunossupressao durante o tratamento foi realizado em 57,9 por cento dos casos. Apenas 41,4 por cento apresentaram resposta terapeutica favoravel em duas semanas. A mortalidade de 90 dias ocorreu em 29,4 por cento dos individuos, sendo maior no comprometimento disseminado. Os fatores prognosticos encontrados foram: sonolencia na admissao; hipoglicorraquia e tinta da China positiva no liquor inicial e resposta desfavoravel ao tratamento com duas semanas. A anfotericina B desoxicolato causou nefrotoxicidade em 97,1 por cento dos casos, sendo grave em 45,5 por cento. Observou-se a perda do enxerto em 12,1 por cento dos pacientes que utilizaram essa medicacao. A perda do enxerto em 30 dias foi significantemente mais frequente nos pacientes com idade superior a 50 anos; nos com creatinina basal ou do diagnostico elevada e nos pacientes que apresentavam causas adicionais para a nefrotoxicidade. Conclusoes: A criptococose se mantem como uma complicacao importante nos pacientes submetidos a transplante renal, com uma apresentacao tardia no periodo pos-transplante e alta mortalidade. A anfotericina B desoxicolato mostrou alta nefrotoxicidade nessa populacao, associada a significante taxa de perda do enxerto / Introduction: Cryptococcosis, which is the third cause of invasive fungal infections in renal transplant recipients, is an important life-threatening opportunistic infection. Objective: Describe the epidemiological, clinical and diagnostic features of cryptococcosis in renal transplant recipients, as well as the outcome, predictors of mortality and the amphotericin B impact on renal graft function. Methods: Cases of cryptococcosis among renal transplant recipients were identified in UNIFESP/EPM hospitals from January 1995 through January 2007. Results: Forty renal transplant recipients were diagnosed with cryptococcosis among 4,727 consecutive transplant recipients, being 67.5% male. 37.5% out of 40 patients had graft rejection preceding the infection and 30% had hepatitis C. Cryptococcosis occurred a mean of 4.5 years after transplantation; 77,5% of the infections developed more than 1 year after transplantation. The cryptococcal antigen had a high sensibility, although a limited clinical correlation during treatment. Cryptococcus neoformans was isolated in 22 patients and in 1 patient, Cryptococcus gattii infection was documented. Central nervous system involvement occurred in 75% of the cases, pulmonary and cutaneous involvement in 30% each and disseminated infection was observed in 40% of the patients. Regarding treatment, 97.5% of cases received antifungal therapy, whose primary therapy comprised amphotericin B in 89.7%. Primary Immunosuppression was reduced in 57.9% of cases during the infection and the outcome was favorable in 41.4% within 2 weeks. Mortality rate at 90 days was 29.4% and it was higher in disseminated cryptococcosis. Drowsiness on admission; low glucose and positive India ink in the initial cerebrospinal fluid and unfavorable outcome within 2 weeks were a significant predictor of death in these patients. In 45.5% of cases, the baseline serum creatinine level increased more than 50% during amphotericin B therapy and 12.1% had graft loss. The graft loss within 30 days was significantly more likely to occur in patient older than 50; in those with higher baseline and diagnostic serum creatinine levels and in patients who had an additional factor for nephrotoxicity. Conclusion: Cryptococcosis remains a relevant late-onset complication in renal transplant recipients, which describes high mortality rate. Amphotericin B deoxycholate had a negative influence on graft function, with a significant high graft loss rate. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-07-01T12:29:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 jose_junior_ioc_mest_2015.pdf: 7529877 bytes, checksum: beaacc058f833030013e0a0f26fe3c35 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:42Z (GMT). No. of bitstreams: 3 jose_junior_ioc_mest_2015.pdf.txt: 171971 bytes, checksum: 2fcd8d231a793ff2dcb2b181a85fbdd1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) jose_junior_ioc_mest_2015.pdf: 7529877 bytes, checksum: beaacc058f833030013e0a0f26fe3c35 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Teresina, PI, Brasil / Introdução: A criptococose é uma micose sistêmica causada por duas espécies de leveduras do gênero Cryptococcus, C. gattii acometendo hospedeiros imunocompetentes, e C. neoformans, atingindo principalmente indivíduos imunocomprometidos. Na forma sistêmica da doença o órgão mais acometido é o sistema nervoso central (SNC) com manifestações clínicas de síndromes meningoencefálicas sendo esta a forma mais diagnosticada no Brasil. Objetivo: Descrever o perfil clínico-epidemiológico da meningite criptocócica em indivíduos não portadores do HIV. Metodologia: Foi realizado um estudo do tipo série de casos com análise descritiva dos dados contidos em prontuários de pacientes com meningite criptocócica, admitidos no Instituto de Doenças Tropicais Natan Portella (IDTNP) no período de janeiro de 2006 a dezembro de 2014, com ênfase na descrição dos aspectos clínico-epidemiológicos e terapêuticos da doença correlacionados com a letalidade e desenvolvimento de sequelas. Resultados: Detectamos uma letalidade de 27%, observamos que 33,33% (20/60) dos pacientes estavam na faixa etária abaixo de 20 anos (27,03% dos homens e 43,48% das mulheres), que 68.2% dos pacientes com medida de pressão do LCR realizada nas primeiras 48 horas tinha pressão liquórica acima de 25 cmH2O e que 22.41% dos pacientes não apresentavam pleocitose liquórica. Os sintomas mais frequentes foram cefaleia (98,33%), hipertermia (71,67%), vômitos e rigidez de nuca (61,67% cada) Conclusões: a maioria dos indivíduos tinha menos de 20 anos de idade seguido pelo grupo na 6ª década de vida numa proporção de 1 mulher para 1.6 homens. Não foi observada a ocorrência de surtos. Os sintomas mais encontrados foram: cefaleia, hipertermia, vômitos e rigidez de nuca. Pacientes com alteração de nível de consciência e déficits neurológicos focais tinham maior risco de óbito enquanto que os que tinham alguma comorbidade, apresentassem crises convulsivas ou necessitassem de UTI tinham mais chances de desenvolver sequelas / Abstract: Introduction: Cryptococcosis is a systemic mycosis caused by two species of Cryptococcus spp, C. gattii affecting immunocompetent hosts, and C. neoformans, mainly afflicting immunocompromised individuals. In the systemic form of the disease the most affected organ is the central nervous system (CNS) with clinical manifestations of meningoencephalitis being the form most commonly found in Brazil. Objective: To describe the clinical and epidemiological profile of cryptococcal meningitis in patients without HIV. Methods: We conducted a study of case series with descriptive analysis of data contained in records of patients with cryptococcal meningitis, admitted to the Natan Portella Institute of Tropical Diseases, emphasizing the description of the clinical-epidemiological and therapeutic aspects of the disease correlated with the lethality and development of sequelae. Results: We detected a mortality of 27%, we found that 33.33% (20/60) of patients were aged below 20 years (27.03% men and 43.48% women), that 68.2% of patients with CSF pressure measurement performed in the first 48 hours had CSF pressure above 25 cmH2O and 22.41% of patients showed no CSF pleocytosis. The most common symptoms were headache (98.33%), hyperthermia (71.67%), vomiting and neck stiffness (61.67% each). Patients with altered level of consciousness and focal neurological deficits had increased risk of death while patients who already had some comorbidity, presented seizures or needed intensive care had a higher risk of developing sequelae Conclusions: Most of the individuals were under 20 years of age followed by the group in the 6th decade of life in a 1 woman to 1.6 men ratio. Outbreaks weren\2019t observed. The most common symptoms were: headache, fever, vomiting and neck stiffness. Patients with decreased consciousness levels and focal neurologic deficits had increased risk of death while those who had underlying phisical conditions, presented seizures or needed ICU admission were more likely to develop sequelae

A criptococose é uma doença invasiva capaz de apresentar-se de forma fatal podendo acometer pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos. Os agentes etiológicos Cryptococcus neoformans var. grubii e C. neoformans var. neoformans apresentam distribuição cosmopolita, sendo as excretas de pombos o seu principal reservatório. Com o advento de terapias imunossupressoras e a pandemia de HIV, observou-se o aumento significativo de casos de pacientes com criptococose. Atualmente, o diagnóstico é baseado na apresentação clínica, na observação microscópica de líquor corado com tinta da Índia e/ou no isolamento em cultura. Neste trabalho desenvolveu-se um ELISA para detecção de anticorpos contra C. neoformans var. grubii em soro de pacientes utilizando como antígeno um extrato protéico total de uma linhagem clínica isolada de um paciente com criptococose (HC6). Foram testados através de ELISA 40 amostras de soros de pacientes com criptococose, sendo 67,5% positivos e 32,5% falsos negativos. Como controles negativos foram testados 82 amostras de soros de indivíduos hígidos, dos quais 26,82% apresentaram resultados positivos para os testes realizados. Para testar a reatividade cruzada, foram utilizadas 10 amostras de pacientes com histoplasmose (20% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com paracoccidioidomicose (66,6% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com candidose (13,3% de reatividade cruzada) e 7 amostras de pacientes com aspergilose (14,28% de reatividade cruzada). Visando solucionar o problema da reatividade cruzada, identificamos proteínas antigênicas de C. neoformans var. grubii por eletroforese bidimensional seguida por western blot e espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). Das 75 amostras analisadas, quatro foram identificadas: uma proteína hipotética, 2 isoformas de HSPs 70 e uma catalase-2. As proteínas identificadas apresentaram baixa similaridade com ortólogas de outros fungos patogênicos, sendo, dessa forma, possíveis alvos para a padronização do ELISA e diagnóstico da criptococose. / Cryptococosis is an invasive and potentially fatal disease. Cryptococcus neoformans is the etiological agent, which can affect both immunocompromised and immunocompetent individuals. C. neoformans var. grubii and C. neoformans var. neoformans are cosmopolitan and their major natural reservoir is the excrement from pigeons. With the advent of immunosupressor therapies and the pandemic HIV infection, a significant augmentation of cryptococosis cases in humans was observed. Nowadays cryptococcosis diagnosis is based on the clinical presentation, India ink sample preparation methods and/or in vitro culture isolation. In this work we had developed an ELISA to detect antibodies against C. neoformans var. grubii in serum from patients with cryptococcosis using as antigens a whole cell protein extract from a clinical cell line isolate (HC6). Sera from 40 patients with cryptococcosis were tested by ELISA. From these, 67.5% were positives and 32.5% were false-negatives. As a negative control 82 samples from health subjects were also tested, from these 26.82% were positives. To test cross-reactivity, samples from 10 patients with histoplasmosis (20% cross-reactivity), 9 from patients with paracoccidioidomicosis (66.6% cross-reactivity), 9 from patients with candidosis (13.3% cross-reactivity) and 7 from patients with aspergilosis (14.28% cross-reactivity) were tested. To solve the cross-reactivity problem, we searched immunogenic proteins which were specific to C. neoformans var. grubii applying two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE-PAGE) followed by western blot and mass spectrometry (MALDI-TOF MS). From the 75 sample analyzed, four were identified: one as a hypothetic protein, two HSPs 70 isoforms and the protein catalase 2. These proteins showed low similarity with orthologues from other pathogenic fungi, and are potential targets to further of the standardizing cryptococosis diagnosis by ELISA.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-18T21:43:20Z No. of bitstreams: 1 2017_FabiánAndrésHurtadoErazo.pdf: 1577377 bytes, checksum: fbcc285d4a9db38da107507c2b9fac14 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-05-24T21:53:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_FabiánAndrésHurtadoErazo.pdf: 1577377 bytes, checksum: fbcc285d4a9db38da107507c2b9fac14 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-24T21:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_FabiánAndrésHurtadoErazo.pdf: 1577377 bytes, checksum: fbcc285d4a9db38da107507c2b9fac14 (MD5) Previous issue date: 2017-05-21 / O fungo patogênico Cryptococcus neoformans é um dos agentes etiológicos da criptococose, uma infecção fúngica invasiva que pode se disseminar ao sistema nervoso central e que afeta principalmente pacientes imunocomprometidos. Uma das principais células em detectar a infecção são as células dendríticas, que reconhecem e fagocitam o fungo orquestrando a resposta imune adaptativa para erradicar a infecção. A resposta imune do hospedeiro às infecções por patógenos microbianos envolve ampla reprogramação gênica, que é finamente controlada de modo a conter ou eliminar efetivamente o patógeno sem causar danos excessivos no hospedeiro. Micro-RNAs (miRNAs) são pequenos RNAs regulatórios envolvidos em mecanismos de regulação gênica e já foram detectados em diversos processos fisiológicos e patológicos controlando a estabilidade ou a taxa de tradução de RNA mensageiros (mRNA). Portanto, essas moléculas foram identificadas como um componente crucial na maquinaria da regulação gênica, afetando a produção e função das proteínas durante a homeostase ou sua perturbação. Esse estudo visou a caracterização do perfil de miRNAs expressos em células dendríticas derivadas de medula óssea de camundongos BALB/c (BMDCs) em resposta à infecção por C. neoformans. BMDCs foram co-cultivadas com a linhagem B3501 de C. neoformans por 24 h e tiveram RNA extraído para análise de expressão de miRNAs por RT-qPCR array. Os níveis de acúmulo de 29 miRNAs foram alterados nas BMDCs infectadas. Desse grupo, 22 miRNAs foram regulados positivamente e 7 miRNAs mostraram uma diminuição nos níveis de seus transcritos. Em seguida, analisou-se o papel do miR-155 nas principais funções das BMDCs em resposta à infecção por C. neoformans, por meio da abordagem de perda da função, mediante a transfecção de inibidores de miRNAs. Em tais experimentos, observou-se uma alteração na fagocitose e no controle intracelular do fungo pelas BMDCs quando miR-155-3p foi inibido. A análise da expressão, por citometria de fluxo, de MHCII nas BMDCs revelou um aumento na média da intensidade de fluorescência quando miR-155-5p foi inibido, sugerindo um papel na regulação desse complexo. Os resultados desse trabalho são pioneiros ao sugerir a participação de miRNAs na resposta de células dendríticas à infecção por C. neoformans. Estudos posteriores serão realizados visando ao aprofundamento da avaliação funcional desses miRNAs e seus respetivos mecanismos de ativação nesse modelo de infecção. / The pathogenic fungus Cryptococcus neoformans is one of the etiological agents of cryptococcosis, an invasive fungal infection that can spread to the central nervous system and mainly affects immunocompromised patients. One of the main cells in detecting the infection are dendritic cells, which recognize and phagocyte the fungus, orchestrating the adaptive immune response to eradicate the infection. The immune response to microbial pathogen infections involves extensive genetic reprogramming, which is finely controlled to contain or to effectively eliminate the pathogen without causing excessive damage to the host. Micro-RNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs involved in gene regulation mechanisms; these molecules are observed in a wide range of physiological and pathological processes controlling either messenger RNA (mRNA) stability or translation rate. Therefore, these molecules have been identified as a crucial component in the gene regulation machinery, affecting the production and function of proteins in homeostasis and its alterations. This study focused on characterizing the profile of miRNAs expressed in bone marrow-derived dendritic cells from BALB/c mice (BMDCs) in response to C. neoformans infection. BMDCs were co-cultured with the B-3501 strain of C. neoformans for 24 hours, after which the RNA was extracted for analysis of miRNA expression by RT-qPCR array. The expression levels of 29 miRNAs were altered in the infected BMDCs. Out of this group, 22 miRNAs were upregulated and 7 miRNAs showed a decrease in the levels of transcripts. Subsequently, the effect of miR-155 in the main functions of BMDCs in response to C. neoformans infection was analyzed by of a lossof-function approach: transfection of miRNA inhibitors into BMDCs. When miR-155-3p was inhibited, a change in BMDCs phagocytosis ability and in the intracellular control of the fungus was observed. Analysis of the MHCII expression in infected BMDCs by flow cytometry revealed an increase in the Mean Fluorescence Intensity when miR-155-5p was inhibited. These results are pioneering in indicating the participation of miRNAs in the dendritic cells response to C. neoformans infection.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo liberado: Resumos e referências. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-03T21:09:27Z No. of bitstreams: 1 2017_JéssicadosSantosFolha_PARCIAL.pdf: 294375 bytes, checksum: 61910b439c6baaa52f5602c55bb55f2c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-22T20:57:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_JéssicadosSantosFolha_PARCIAL.pdf: 294375 bytes, checksum: 61910b439c6baaa52f5602c55bb55f2c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-22T20:57:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_JéssicadosSantosFolha_PARCIAL.pdf: 294375 bytes, checksum: 61910b439c6baaa52f5602c55bb55f2c (MD5) Previous issue date: 2017-08-22 / Projeto financiado pelo Edital Auxílio à Pesquisa DPP-UnB Nº 02/2016 - Auxílio Financeiro a Estudantes para o Desenvolvimento de Pesquisas de Natureza Científica. / A criptococose, micose sistêmica causada por leveduras do gênero Cryptococcus, atinge principalmente indivíduos imunocomprometidos, e é atualmente uma importante doença fúngica sistêmica em todo mundo. Está fortemente ligada ao estado imunitário do hospedeiro, sendo os macrófagos considerados as principais células efetoras na imunidade contra essa levedura. Nosso grupo de pesquisa faz parte da Rede de Criptococose brasileira que tem por objetivo estudar o perfil epidemiológico e a evolução clínica dos casos de criptococose primária e oportunista no Brasil, identificando fatores de risco associados aos diversos desfechos clínicos. Mais especificamente, nosso grupo vem trabalhando na caracterização fenotípica de isolados clínicos de Cryptococcus quanto a sua habilidade de produzir diferentes fatores de virulência e interagir com diferentes modelos hospedeiros. E esse trabalho teve como objetivo analisar fatores associados à interação de 16 isolados clínicos de Cryptococcus neoformans obtidos pela FIOCRUZ (Fundação Oswaldo Cruz) RJ/Brasil com macrófagos murinos primários (BMMs). Após ensaios de interação dos diferentes isolados clínicos com macrófagos, foram analisados os diferentes percentuais de fagocitose, as taxas de sobrevivência fúngica, bem como produção de citocinas inflamatórias produzidos pelos macrófagos. Tais resultados foram então correlacionados com resultados previamente obtidos da análise de produção in vitro de fatores de virulência por esses isolados realizadas por outros componentes do nosso grupo de pesquisa (produção de cápsula, melanização, mediana de sobrevida de larvas de Galleria mellonella infectadas com os diferentes isolados, etc). As porcentagens de fagocitose e sobrevivência fúngica apresentaram valores bastante variados entre os diferentes isolados clínicos estudados. Além disso, as diferentes linhagens foram capazes de promover aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e MCP-1 pelos macrófagos. Foram obtidas correlações significativas entre a taxa de sobrevivência fúngica após a interação com macrófagos e a porcentagem de fagocitose (p= 0,0066) e também entre porcentagem de fagocitose e a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas com os diferentes isolados (p= 0,0052). Também observamos uma correlação significativa da produção das citocinas pró-inflamatórias detectadas com a porcentagem de fagocitose dos diferentes isolados. Esses resultados demostram a variabilidade fenotípica desses diferentes isolados clínicos de C. neoformans na sua interação com macrófagos.Uma melhor caracterização desses fungos, bem como a correlação desses fenótipos com características clínicas desses isolados poderão colaborar futuramente como o estabelecimento de estratégias mais eficazes para o tratamento de criptococose no Brasil. / Cryptococcosis, a systemic mycosis caused by yeasts of the genus Cryptococcus, is currently an important systemic fungal disease affecting mainly immunocompromised people worldwide. It is strongly associated with the immune status of the host, being macrophages considered the main effector cells against the immunity against this yeast. Our group is part of the Brazilian Cryptococcosis Research Network which aims to study the epidemiological and clinical evolution of primary and opportunistic cases of cryptococcosis in Brazil, identifying risk factors associated with clinical outcomes. Our group is more specifically working on phenotypic characterization of clinical isolates of Cryptococcus regarding their ability to produce different virulence factors and interact with different host models. This work aimed to analyze factors associated with the interaction of sixteen clinical isolates of Cryptococcus neoformans obtained from FIOCRUZ (Oswaldo Cruz Fundation) Rio de Janeiro/Brazil with primary murine macrophages (BMMs). After interaction assays of the different isolates with macrophages, we analyzed the different percentages of phagocytosis, rates of fungal survival and production of inflammatory cytokines by macrophages. Those results were correlated to previous results regarding the in vitro production of virulence factors obtained from our group (capsule production, melanization, mean survival of infected Galleria mellonella larvae, etc). The percentages of fungal phagocytosis viability post interaction showed a significant variation among the clinical strains studied. Additionally, all the strains were able to induce production of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, IL-6 and MCP-1 by macrophages. We observed a significant correlation between fungal survival and the percentage of phagocytosis (p=0,0066), and also between percentage of phagocytosis and median survival of G. mellonella larvae infected with the different fungal isolates (p=0,0052). Also, there was a significant correlation of production of all the detected cytokines with the percentage of phagocytosis. These results demonstrated the phenotypic variability of those clinical isolates of C. neoformans. Further characterization of these fungal isolates, and the correlation of this features to their clinical profiles may help in the development of new strategies more efficient for the treatment of cryptococcosis in Brazil.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-02-01T16:05:48Z No. of bitstreams: 1 2016_JorgeAntonioChamonJúnior.pdf: 2367299 bytes, checksum: 42dea312014c0ea857854aba2a361a7e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-27T17:39:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JorgeAntonioChamonJúnior.pdf: 2367299 bytes, checksum: 42dea312014c0ea857854aba2a361a7e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-27T17:39:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JorgeAntonioChamonJúnior.pdf: 2367299 bytes, checksum: 42dea312014c0ea857854aba2a361a7e (MD5) / Introdução: A criptococose vem assumindo um papel relevante dentre as infecções fúngicas oportunistas por ser considerada uma das micoses mais comuns nos indivíduos imunodeprimidos apresentando elevada morbidade e mortalidade, com cerca de 650.000 mortes por ano em todo mundo. Esta doença é causada pelos fungos leveduriformes encapsulados Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. O C. neoformans acomete pacientes imunocomprometidos, já o C. gattii, vem se tornando um grave problema de saúde pública, pois é capaz de acometer pacientes imunocompetentes. Fato que promove ainda mais preocupação é o fato de existir escassos medicamentos antifúngicos disponíveis, que possuem elevada toxicidade e já apresentam resistência por mecanismos pouco elucidados. Diante destas circunstâncias, estratégias farmacológicas vem sendo estudadas e desenvolvidas, inclusive empregando extratos de plantas com potencial terapêutico. Neste sentido, o estudo do efeito antifúngico do extrato aquoso das folhas de Eugenia dysenterica (Mart.) DC sobre isolados de Cryptococcus spp foi realizado. Objetivos: Identificar isolados clínicos de Cryptococcus spp. por métodos clássicos, bioquímicos, manuais e automatizados, moleculares e por espectrometria de massa, visando caracterizá-los fenotipicamente e genotipicamente, e avaliar o perfil de susceptibilidade aos agentes antifúngicos convencionais e ao extrato aquoso bruto de Eugenia dysenterica. Materiais e métodos: Neste estudo, 20 isolados clínicos contendo Cryptococcus spp. foram submetidos a identificações microscópicas (tinta nanquim e hidróxido de potássio), provas bioquímicas manuais (assimilação de glicina, produção de urease e melanina), provas bioquímicas automatizadas, PCR-RFLP e espectometria de massa (MALDI-TOF). Além disso, foi realizado teste de suscetibilidade a antifúngicos convencionais e microdiluição em placa para o extrato aquoso de folhas de E. dysenterica. Resultados: A partir da diversas metodologias empregadas obtivemos a caracterização das espécies (12 C. neoformans e 8 C. gattii) e variantes (12 VNI e 8 VGII), assim como a presença de resistência aos antifúngicos usuais (3 casos de resistência a Anfotericina B). Além da demonstração do efeito antifúngico do extrato de E. dysenterica. Conclusão: Neste estudo, visualizou-se o predomínio da espécie C. neoformans VNI frente a C. gattii VGII, em consonância com os estudos já realizados e as informações epidemiológicas existentes, e que esta caracterização é fundamental para fins terapêuticos e de saúde pública, diante do quadro de limitação de tratamento e iminentes casos de resistências a antifúngicos. Além disso, fornece subsídios para que o extrato aquoso de E. dysenterica seja considerado a um forte canditado na elaboração de novos fármacos antifúngicos. / Introduction: Cryptococcosis has been playing an important role among fungal opportunistic infections, being considered one of the most common mycoses in immunocompromised individuals presenting high morbidity and mortality, with around 650,000 deaths per year worldwide. This disease is caused by the encapsulated yeast Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. C. neoformans affects immunocompromised patients, and C. gattii has become a serious public health problem since it is capable of injuring immunocompetent patients. A fact that promotes even more concern is the fact that there are few antifungal drugs available, which present high toxicity and are already resistant by poorly elucidated mechanisms. Facing these circumstances, pharmacological strategies have been studied and developed, including using plants with therapeutic potential in their extracts. In this sense, the study of the antifungal effect of the aqueous extracts of Eugenia dysenterica (Mart.) DC leaves on Cryptococcus spp isolates was performed. Objectives: To identify clinical isolates of Cryptococcus spp. by classical, biochemical manual and automated, molecular and mass spectrometry methods, aiming to characterize them phenotypically and genotypically. Added to this is the assessment of the susceptibility profile to the conventional antifungal agents and to the crude aqueous extract of Eugenia dysenterica. Materials and methods: In this study, 20 clinical isolates containing Cryptococcus spp. (Glycine assimilation, urease and melanin production), automated biochemical tests, PCR-RFLP and mass spectrometry (MALDI-TOF) were performed. In addition, the antifungal susceptibility test and plaque microdilution for the aqueous extract of leaves of E. dysenterica were performed. Results: Based on the different methodologies used, we characterized the species (12 C. neoformans and 8 C. gattii) and variants (12 VNI and 8 VGII), as well as the presence of resistance to the usual antifungal agents (3 cases of resistance to Amphotericin B). In addition to demonstrating the antifungal effect of E. dysenterica extract. Conclusion: In this study, the prevalence of the C. neoformans VNI species in relation to C. gattii VGII was observed, in agreement with the studies already carried out and the existing epidemiological information, and that this characterization is fundamental for therapeutic and public health purposes, In view of the limitation of treatment and imminent cases of antifungal resistance. In addition, it provides subsidies for the aqueous extract of E. dysenterica to be considered a strong candidate in the development of new antifungal drugs.

A criptococose é uma doença fúngica invasiva causada majoritariamente pelas espécies patogênicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Estudos epidemiológicos recentes sugerem que a infecção causada por C. gattii desenvolve mais frequentemente criptococomas pulmonares, enquanto que C. neoformans estabelece principalmente quadros de meningoencefalite. Embora ocorra essa associação, o mecanismo de disseminação dessas espécies não está completamente elucidado, instigando a utilização de diferentes abordagens na caracterização da infecção. O desenvolvimento de microrganismos bioluminescentes tem permitido o monitoramento em tempo real da infecção em modelos animais. No presente trabalho, diferentes estratégias foram utilizadas para a construção de linhagens de C. neoformans e de C. gattii expressando o gene repórter luciferase Renilla, sem sucesso. Paralelamente, em uma segunda abordagem, bactérias bioluminescentes (BL) foram isoladas de amostras de água marinha coletadas nas adjacências da zona estuarina do rio Tramandaí, com o objetivo de selecionar o cassete lux (CDABE) para a utilização como gene repórter. Todos os isolados apresentaram luminescência a 28°C, mas, quando incubados a 37°C, somente o isolado BL6 permaneceu com uma atividade luminescente consideravelmente reduzida. Portanto as bactérias bioluminescentes pertencentes aos gêneros Vibrio, Photobacterium e Enterovibrio isoladas do rio Tramandaí não apresentaram níveis de emissão de luminescência adequados à temperatura fisiológica humana para a utilização do cassete lux como gene repórter para monitoramento de infecções in vivo. / Cryptococcosis is an invasive fungal disease caused mainly by pathogenic species Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. Recent epidemiological studies have suggested that infection with C. gattii develops more frequently pulmonary cryptococcomas, while C. neoformans establishes mainly neurological damages. Although exists this association, the mechanism of dissemination of these species is not completely understood, instigating the use of different approaches for the characterization of the infections. Alternatively, the development of bioluminescent organisms has allowed the real-time monitoring of infection in animal models. In this study, different strategies were used to construct strains of C. neoformans and C. gattii expressing Renilla luciferase reporter gene without success. In a second approach, bioluminescent bacteria (BL) were isolated from seawater samples collected in the vicinity of the river Tramandaí estuarine zone, in order to select the lux cassette (CDABE) for use as a reporter gene. All isolates showed luminescence at 28°C, but when incubated at 37°C, only the isolate BL6 remained with a considerably reduced luminescent activity. Thus, bioluminescent bacteria belonging to the genera Vibrio, Photobacterium and Enterovibrio isolated from Tramandaí river estuary zone presented unsuitable luminescence emission levels at human physiological temperature, preventing the use of lux cassette as a reporter gene in experiments to monitoring cryptococcosis infection.

A criptococose é uma doença fúngica invasiva causada majoritariamente pelas espécies patogênicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Estudos epidemiológicos recentes sugerem que a infecção causada por C. gattii desenvolve mais frequentemente criptococomas pulmonares, enquanto que C. neoformans estabelece principalmente quadros de meningoencefalite. Embora ocorra essa associação, o mecanismo de disseminação dessas espécies não está completamente elucidado, instigando a utilização de diferentes abordagens na caracterização da infecção. O desenvolvimento de microrganismos bioluminescentes tem permitido o monitoramento em tempo real da infecção em modelos animais. No presente trabalho, diferentes estratégias foram utilizadas para a construção de linhagens de C. neoformans e de C. gattii expressando o gene repórter luciferase Renilla, sem sucesso. Paralelamente, em uma segunda abordagem, bactérias bioluminescentes (BL) foram isoladas de amostras de água marinha coletadas nas adjacências da zona estuarina do rio Tramandaí, com o objetivo de selecionar o cassete lux (CDABE) para a utilização como gene repórter. Todos os isolados apresentaram luminescência a 28°C, mas, quando incubados a 37°C, somente o isolado BL6 permaneceu com uma atividade luminescente consideravelmente reduzida. Portanto as bactérias bioluminescentes pertencentes aos gêneros Vibrio, Photobacterium e Enterovibrio isoladas do rio Tramandaí não apresentaram níveis de emissão de luminescência adequados à temperatura fisiológica humana para a utilização do cassete lux como gene repórter para monitoramento de infecções in vivo. / Cryptococcosis is an invasive fungal disease caused mainly by pathogenic species Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. Recent epidemiological studies have suggested that infection with C. gattii develops more frequently pulmonary cryptococcomas, while C. neoformans establishes mainly neurological damages. Although exists this association, the mechanism of dissemination of these species is not completely understood, instigating the use of different approaches for the characterization of the infections. Alternatively, the development of bioluminescent organisms has allowed the real-time monitoring of infection in animal models. In this study, different strategies were used to construct strains of C. neoformans and C. gattii expressing Renilla luciferase reporter gene without success. In a second approach, bioluminescent bacteria (BL) were isolated from seawater samples collected in the vicinity of the river Tramandaí estuarine zone, in order to select the lux cassette (CDABE) for use as a reporter gene. All isolates showed luminescence at 28°C, but when incubated at 37°C, only the isolate BL6 remained with a considerably reduced luminescent activity. Thus, bioluminescent bacteria belonging to the genera Vibrio, Photobacterium and Enterovibrio isolated from Tramandaí river estuary zone presented unsuitable luminescence emission levels at human physiological temperature, preventing the use of lux cassette as a reporter gene in experiments to monitoring cryptococcosis infection.

A criptococose é uma doença invasiva capaz de apresentar-se de forma fatal podendo acometer pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos. Os agentes etiológicos Cryptococcus neoformans var. grubii e C. neoformans var. neoformans apresentam distribuição cosmopolita, sendo as excretas de pombos o seu principal reservatório. Com o advento de terapias imunossupressoras e a pandemia de HIV, observou-se o aumento significativo de casos de pacientes com criptococose. Atualmente, o diagnóstico é baseado na apresentação clínica, na observação microscópica de líquor corado com tinta da Índia e/ou no isolamento em cultura. Neste trabalho desenvolveu-se um ELISA para detecção de anticorpos contra C. neoformans var. grubii em soro de pacientes utilizando como antígeno um extrato protéico total de uma linhagem clínica isolada de um paciente com criptococose (HC6). Foram testados através de ELISA 40 amostras de soros de pacientes com criptococose, sendo 67,5% positivos e 32,5% falsos negativos. Como controles negativos foram testados 82 amostras de soros de indivíduos hígidos, dos quais 26,82% apresentaram resultados positivos para os testes realizados. Para testar a reatividade cruzada, foram utilizadas 10 amostras de pacientes com histoplasmose (20% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com paracoccidioidomicose (66,6% de reatividade cruzada), 9 amostras de pacientes com candidose (13,3% de reatividade cruzada) e 7 amostras de pacientes com aspergilose (14,28% de reatividade cruzada). Visando solucionar o problema da reatividade cruzada, identificamos proteínas antigênicas de C. neoformans var. grubii por eletroforese bidimensional seguida por western blot e espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). Das 75 amostras analisadas, quatro foram identificadas: uma proteína hipotética, 2 isoformas de HSPs 70 e uma catalase-2. As proteínas identificadas apresentaram baixa similaridade com ortólogas de outros fungos patogênicos, sendo, dessa forma, possíveis alvos para a padronização do ELISA e diagnóstico da criptococose. / Cryptococosis is an invasive and potentially fatal disease. Cryptococcus neoformans is the etiological agent, which can affect both immunocompromised and immunocompetent individuals. C. neoformans var. grubii and C. neoformans var. neoformans are cosmopolitan and their major natural reservoir is the excrement from pigeons. With the advent of immunosupressor therapies and the pandemic HIV infection, a significant augmentation of cryptococosis cases in humans was observed. Nowadays cryptococcosis diagnosis is based on the clinical presentation, India ink sample preparation methods and/or in vitro culture isolation. In this work we had developed an ELISA to detect antibodies against C. neoformans var. grubii in serum from patients with cryptococcosis using as antigens a whole cell protein extract from a clinical cell line isolate (HC6). Sera from 40 patients with cryptococcosis were tested by ELISA. From these, 67.5% were positives and 32.5% were false-negatives. As a negative control 82 samples from health subjects were also tested, from these 26.82% were positives. To test cross-reactivity, samples from 10 patients with histoplasmosis (20% cross-reactivity), 9 from patients with paracoccidioidomicosis (66.6% cross-reactivity), 9 from patients with candidosis (13.3% cross-reactivity) and 7 from patients with aspergilosis (14.28% cross-reactivity) were tested. To solve the cross-reactivity problem, we searched immunogenic proteins which were specific to C. neoformans var. grubii applying two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE-PAGE) followed by western blot and mass spectrometry (MALDI-TOF MS). From the 75 sample analyzed, four were identified: one as a hypothetic protein, two HSPs 70 isoforms and the protein catalase 2. These proteins showed low similarity with orthologues from other pathogenic fungi, and are potential targets to further of the standardizing cryptococosis diagnosis by ELISA.

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