Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Neurociências, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T13:07:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 268685.pdf: 4350948 bytes, checksum: 0bebd031289ca97e0599cddd75196d85 (MD5) / A crista neural (CN) representa um grupo de celulas transientes durante o desenvolvimento dos craniatas. Essas celulas estao localizadas nas bordas dorsais do tubo neural, ao longo de todo eixo antero-posterior do embriao. A CN sofre transicao epitelio-mesenquimal, suas celulas tornam-se altamente migratorias e seguem rotas distintas por todo o embriao. A CN e postulada pela maioria dos pesquisadores como o grande passo evolutivo que permitiu aos vertebrados desenvolverem a cabeca, porem os mecanismos moleculares que envolveram esse processo sao obscuros e instigantes. Esse trabalho tem por objetivo estudar as relacoes entre os fatores de transcricao Hoxa2 e Six2 no desenvolvimento da cabeca e os efeitos dos fatores de crescimento epidermal (EGF) e de fibroblasto (FGF2) na diferenciacao dos derivados da CN truncal. Nossos resultados demonstram que o fator de transcricao Six2, expresso normalmente na CN cefalica, mostrou-se capaz de controlar a expressao de antagonistas de BMPs, como Noggin e DAN e tambem do antagonista da via TGFÀ, Cerberus. Quando expresso ectopicamente na CN cefalica, o gene Hoxa2 suprime a expressao de Six2, levando a uma reducao na expressao de Noggin e DAN. Isso acarretara num aumento da biodisponibilidade de BMP4, promovendo reducao na expressao de FGF8 na regiao neural anterior. Alem disso, a reducao na expressao de Six2 promove um ganho de expressao de Cerberus pelas celulas da CN periocular e maxilar. Esse cenario molecular inviabilizara o desenvolvimento dos derivados condro-osteogenicos da CN e, surpreendentemente do sistema nervoso central. Com base nesses resultados, pode ser sugerido que o surgimento de uma CN que nao expressa genes Hox e que expressa o gene Six2 permitiu a formacao de um cenario molecular fundamental para a formacao da cabeca. Alem disso, analisamos os efeitos de fatores do microambiente na diferenciacao da CN truncal de codorna, em cultura. Demonstramos pela primeira vez que EGF induz a diferenciacao da CN para o fenotipo neuronal e melanocitico enquanto que FGF2 promove a diferenciacao da CN para o fenotipo glial. Nossos resultados sugerem que FGF2 favorece a gliogenese enquanto que EGF promove a neurogenese e melanogenese, e assim podemos propor que estes fatores apresentam um importante envolvimento no desenvolvimento do sistema nervoso periferico.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-07T03:25:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347991.pdf: 3464947 bytes, checksum: 4b9adce4d95c51c30b0828be864fb06e (MD5) Previous issue date: 2017 / A crista neural (CN) é composta por células heterogêneas e multipotentes, e pode ser dividida em CN cefálica (CNC) e truncal (CNT). As células da CNC originam, in vivo, células neurais e mesenquimais, neste último caso, formando parte do esqueleto craniofacial (condrócitos, osteócitos e odontoblastos) e tecido conjuntivo da face (adipócitos e fibroblastos dermais). As células da CN truncal (CNT), por sua vez, originam in vivo, células gliais e neurônios do sistema nervoso periférico, além de células cromafins do sistema endócrino. Melanócitos são formados por células da CNC e CNT. In vivo, as células da CNT não apresentam a capacidade de se diferenciarem em fenótipos mesenquimais. Entretanto, in vitro, sob estímulo com fatores químicos e físicos, estas células podem se diferenciar em condrócitos, osteócitos e adipócitos. Frente a estas capacidades que as células da CNT apresentam in vitro, avaliamos a utilização de uma matriz sintética e pura chamada PuraMatrix , para cultivo e diferenciação de células da CNT. Inicialmente, testamos e padronizamos anticorpos para marcação de osteócitos (SB-1, SB-2, SB-3 e SB-5) em membros posteriores de embriões de codornas. Em seguida, realizamos culturas de células da CNT com embriões de 18-22 pares de somitos, com meio básico de cultivo e com adição de Fatores de Diferenciação Mesenquimais (FDM) para estimular as células a se diferenciarem em adipócitos e osteócitos. Foram testadas as concentrações de PuraMatrix 0,15%; 0,25%, 0,5% e 1%. Análises fenotípicas de frequência e quantitativas através da técnica de imunocitoquímica e colorações específicas foram realizadas nos 14º e 21º dias de cultivos para todos os fenótipos da CN. As quatro concentrações de PuraMatrix suportaram o cultivo de células da CNT. Entretanto, pelo baixo número de células observado, a concentração de PuraMatrix 1% foi descartada de nossas análises. As concentrações de PuraMatrix 0,15%; 0,25% e 0,5% possibilitaram a diferenciação de células da CNT para células gliais, neurônios, melanócitos, células musculares lisas e condrócitos, tanto em culturas controles quanto estimuladas com FDM. Adipócitos estiveram presentes nas três concentrações quando estimuladas com FDM, e também nas concentrações de PuraMatrix 0,15% e 0,25% na condição controle. Osteócitos foram analisados nas duas concentrações mais baixas de PuraMatrix , onde marcações para SB-3 ocorreram, mas em co-localização com cartilagem, assim como observado in vivo. SB-5 mostrou-se muito específico para osteoblastos/osteócitos e apresentou marcação tanto em cultivos controles quanto tratados. Apenas no 21º dia, houve marcação de alcalina fosfatase e de matriz mineralizada. PuraMatrix abre novas perspectivas para o desenvolvimento de estudos clonais de progenitores da CN e poderá permitir a identificação de novos progenitores com as potencialidades neurais-mesenquimais para CNT. / Abstract : The neural crest (NC) is composed of heterogenous and multipotent cells, and can be divided into cephalic (CNC) and trunkal (TNC) NC. CNC cells originate, in vivo, neural and mesenchymal cells, the last one forming part of the craniofacial skeleton (chondrocytes, osteocytes and odontoblasts) and connective tissue of the face (adipocytes and dermal fibroblasts). The TNC cells, in turn, originated in vivo, glial cells and neurons of the peripheral nervous system, in addition to chromaffin cells of the endocrine system. Melanocytes are formed by CNC and TNC cells. In vivo, TNC cells don?t have the ability to differentiate into mesenquimal phenotypes. However, in vitro, under stimulation with chemical and physical factors, these cells can differentiate into chondrocytes, osteocytes and adipocytes. Faced with these capabilities that TNC cells present in vitro, we evaluated the use of a pure synthetic matrix called PuraMatrix , for TNC cell culture and differentiation. Initially, we tested and standardized antibodies for marking osteocytes (SB-1, SB-2, SB-3 and SB-5) on hind limbs of quail embryos. Then, we performed cell cultures of TNC cells with embryos of 18-22 pairs of somites, with basic culture medium and with addition of Mesenchymal Differentiation Factors (MDF) to stimulate the cells to differentiate into adipocytes and osteocytes. The concentrations of PuraMatrix 0.15%; 0.25%, 0.5% and 1% were tested. Frequency and quantitative phenotypic analyzes using the immunocytochemistry technique and specific staining were performed on the 14th and 21st day of cultures for all NC phenotypes. The four concentrations of PuraMatrix supported the cultivation of CNT cells. However, due to the low number of cells observed, the concentration of PuraMatrix 1% was discarded from the analyzes. The concentrations of PuraMatrix 0.15%; 0.25% and 0.5% allowed the differentiation of TNC cells into glial cells, neurons, melanocytes, smooth muscle cells and chondrocytes in both control and MDF stimulated cultures. Adipocytes were present in the three concentrations when stimulated with MDF, and also in the concentrations of PuraMatrix 0.15% and 0.25% in the control condition. Osteocytes were analyzed for the two lowest concentrations of PuraMatrix , where SB-3 marker occurred with co-localization with cartilage as well as observed in vivo. SB-5 showed to be very specific for osteoblasts/osteocytes and showed labeling in both control and treated cultures. On day 21 only, there was marking of alkaline phosphatase and mineralized matrix. PuraMatrix opens new perspectives for the development of clonal studies of NC progenitors and may allow the identification of new progenitors with the neural-mesenchymal potentialities for TNC.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T13:04:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 279517.pdf: 1662490 bytes, checksum: 19e960469d98f24eb0775fe8b5efcb5d (MD5) / A crista neural (CN) constitui uma população celular pluripotente derivada das pregas neurais da placa neural que surge nos estágios iniciais da embriogênese, durante o processo de neurulação. A CN origina todo o sistema nervoso periférico, pigmentação do corpo além dos ossos e cartilagens crânio-faciais. A deficiência de ácido fólico (AF) promove um aumento nos níveis de homocisteína (HC) e tem sido associada a diversas anomalias congênitas, principalmente a defeitos no fechamento do tubo neural e neurocristopatias. No entanto, os mecanismos celulares desse processo não estão esclarecidos e se são causados pela deficiência de folato ou pelo aumento dos níveis de HC. Desse modo, esse trabalho tem por objetivo investigar o efeito da HC e AF em diversos aspectos da morfogênese da CN, como a migração, proliferação, morte e diferenciação celular. Culturas primárias de células da crista neural (CN) da região cefálica (mesencefálo) foram realizadas a partir de explantes das pregas neurais de embriões murinos de 8,5 dias de gestação. Os explantes foram cultivados sobre substrato de fibronectina (FN) (20µg/mL) em meio de cultura contendo homocisteína (HC) (0, 75, 150 ou 300 uM) e/ou ácido fólico (AF) (45 e 90uM). Após 48 horas, os explantes foram removidos e as células da CN que migraram para a placa de cultivo a partir do tubo neural foram tripisinizadas, replaqueadas e mantidas em cultura por mais 10 dias nas mesmas condições de tratamento. Os fenótipos celulares foram identificados por imunofluorescência utilizando anticorpos para proteínas marcadoras específicas de células gliais (proteína ácida fibrilar glial-GFAP), neurônios (-Tubulina III), células de músculo liso (alfa-actina de músculo liso-aSMA) e células da crista neural indiferenciada (nestina e p75). Foram analisados ainda, a área de migração das células da CN, a proliferação celular por incorporação de BrdU e a proporção de núcleos apoptóticos. Nossos resultados demonstram que a HC reduz a diferenciação da CN para o fenótipo de músculo liso de maneira dosedependente, e aumenta a proporção de células indiferenciadas, não alterando a proporção de células gliais e neurônios. A adição de AF previne esse efeito da HC. A proporção de núcleos apoptóticos manteve-se baixa em todas as condições analisadas, sugerindo que os efeitos observados não se devem a uma morte celular acentuada. Por outro lado, observamos um progressivo aumento na migração e proliferação celular das células da CN após tratamento com concentrações crescentes de HC, efeito este prevenido pela adição de AF. Os resultados sugerem que a HC influencia os processos de diferenciação, migração e proliferação das células da CN podendo assim estar relacionada com o surgimento de anomalias congênitas e que o AF previne esses efeitos. / The neural crest (NC) is a transient structure of the vertebrate embryo formed by the lateral borders of the neural primordium during neurulation. The NC originates most of neurons and glial cells of the peripheral nervous system, pigment cell of body and bones and cartilage of the head. Folic acid (FA) deficiencies lead to an increase in the levelf of homocysteine (HC) and have been associated with many adverse congenital abnormalities, particularly neural tube closure defects and neurocristopathies. However, it is not clear, whether these defects are due to a FA deficiency or to the increased levels of (HC) levels neither the involvement of the NC cells. Thus, the objective of this study was to investigate the effect of HC and AF in various aspects of morphogenesis the CN, such as migration, proliferation, death and cell differentiation. Primary cell cultures were performed by mechanical dissection of neural tubes of 8.5 days post coitum mouse embryos at the level of mesencephalon. Explants were applied on plastic dishes coated with fibronectin (FN) (20ìg/mL), being removed 48 hours later. The remaining migrated cells (NC cells) were then trypsinized, reapplied on the same culture condition and cultured for additional 10 days. Cells were cultured in the complex media containing HC (0, 75, 150 or 300 uM) and/or FA ( 45 or 90uM). The medium was changed every 3 days. The cell phenotypes were identified by immunofluorescence using the ineagespecific markers to glial cells (GFAP), neurons (-III-Tubulin), smooth muscle cells (aSMA), and indiferentiated neural crest cells (nestin and p75). It was also analyzed the NC cell migration area, the cell proliferation (by BrdU incorporation) and the proportion of apoptotic nuclei. We could observe that HC reduces in a dose-dependent manner the differentiation of NC to smooth muscle cells, and increases the proportion of undifferentiated cells, an effect that is prevented by AF. The proportion of apoptotic nuclei was insignificant in all tested condition, suggesting that massive cell death is not responsible to the observed effects. In addition, we verified that HC progressively increased the migration and proliferation of NC cells, effects prevented by FA. These results suggest an effect of the HC in the differentiation, migration and proliferation processes of the CN cells that may be involved in ongenital anomalies, and that FA prevent this effects.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. / Made available in DSpace on 2012-10-23T02:22:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 247339.pdf: 1237906 bytes, checksum: edfd0ffa7dec78bacb9b6ce833694fa3 (MD5) / A identificação de células tronco de adultos tem recebido grande atenção devido ao seu grande potencial de uso terapêutico. O objetivo do trabalho foi verificar o ligamento periodontal como nicho de células tronco, com características da crista neural. Células do ligamento periodontal humano foram isoladas de 10 dentes de 7 indivíduos (grupo PDL pool) e também, de 4 dentes de um mesmo indivíduo (grupo PDL single). Fenótipos celulares foram analisados por imunocitoquímica e RT-PCR. Foram identificados fenótipos mesodermais. Adicionalmente, foram identificadas células positivas para nestina, HNK1 e p75 e células que apresentaram marcadores de tipos celulares diferenciados como ß-tubulinaIII, NF-M, periferina e MAP-2, SMA e P0. Os resultados encontrados foram similares nos 2 grupos de estudo. O ligamento periodontal humano possui células que apresentaram marcadores de células tronco da crista neural, e células com capacidade de diferenciação em derivados mesodermais e neurais. O ligamento periodontal mostra-se como um nicho de células tronco, mais precisamente com características da crista neural.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 321859.pdf: 3090323 bytes, checksum: 3479050dc6f220ab0e161e1914293161 (MD5) Previous issue date: 2013 / A crista neural (CN) corresponde a umapopulação de células que se origina na região dorsaldo tubo neural de embriões de vertebrados durante aneurulação. Durante este processo, as células daectoderme sofrem transição do fenótipo epitelial parao mesenquimal, tornando-se migratórias, e sedestinam a povoar vários órgãos e tecidos emdesenvolvimento. As regiões que são povoadas porestas células, ao longo do eixo antero-posterior doembrião, formam subdivisões: cranial, vagal, truncale sacral e produzem uma enorme variedade dederivados, incluindo neurônios e células gliais dosistema nervoso periférico, melanócitos, célulasendócrinas e glandulares além de tecidosesqueléticos e conjuntivo da cabeça, face e pescoço,além das meninges cerebrais. Assim, a CN écomposta de populações de precursores jádeterminados e de células multipotentes. Célulascom características da CN podem também serencontradas em tecidos adultos como, no nervociático, nos gânglios da raiz dorsal, intestino, córnea,coração, medula óssea e pele. Na pele demamíferos, essas células residem em um discretomicroambiente conhecido como a saliência dofolículo piloso (bulge). O destino dos precursoresmultipotentes depende de vários fatores e omicroambiente exerce papel fundamental nesteprocesso. Fatores de crescimento, como o fator decrescimento de fibroblasto tipo 2 (FGF2) e o fator decrescimento epidermal (EGF), têm sido identificadoscomo importantes em direcionar a diferenciação deprogenitores multipotentes da CN. Nesse estudo,verificamos que o FGF2 promove a renovação eproliferação dos precursores mais indiferenciados emultipotentes da CN de embriões de codornamantendo-os indiferenciados. FGF2 promove ainda aautorrenovação do precursor bipotente de glia emúsculo liso, ao mesmo tempo em que estimulaprogramas de diferenciação celular para aslinhagens glial e neuronal em detrimento dadiferenciação melanocítica. No entanto, adiferenciação terminal só ocorre após a remoção deFGF2. Além disso, aperfeiçoamos protocolo deisolamento e cultivo de células semelhantes à CN defolículos pilosos das vibrissas de camundongos.Essas células apresentam morfologia semelhante àCN embrionária e expressam os marcadores de CNPax3, Slug, Snail, Sox10 e p75. O tratamento comFGF2/EGF estimula a proliferação e diferenciaçãodas células folículo piloso para os fenótiposadipogênico, osteogênico, melanocítico, neural emuscular liso quando em condições específicas decultivo. Em conjunto, os resultados sugerem queexistam populações celulares com característicasmultipotentes no folículo piloso murino, dentre elas células semelhante à CN.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:43:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 296293.pdf: 595442 bytes, checksum: 4a44716096b914945e724217369d1213 (MD5) / A crista neural (CN) é uma população de células originadas das margens dorsais do tubo neural durante o desenvolvimento de vertebrados. Essas células possuem um alto potencial migratório e dão origem a múltiplos fenótipos como neurônios, células gliais, melanócitos e a diversos derivados mesenquimais. Sabe-se que essa diversificação de fenótipos é espacialmente e temporalmente influenciada por fatores do microambiente. Vários fatores de crescimento, incluindo o fator de crescimento epidermal (EGF), têm sido identificados como sendo capazes de direcionar a diferenciação de progenitores multipotentes da CN para tipos celulares específicos. Segundo Garcez e colaboradores (2009), o EGF é capaz de influenciar in vitro a diferenciação melanocítica das células da CN, aumentando o número de células pigmentadas em cultura. No presente trabalho investigamos os efeitos do EGF na potencialidade e diferenciação das células da CN de codornas (Coturnix coturnix japonica). Para isso culturas de massa e clonais de CN foram tratadas com EGF (10ng/mL). Nas células da CN truncal (CNT) os tratamentos foram realizados nas primeiras 20h, fase de migração das células a partir do tubo neural. Já para as células da CN cefálica (CNC) os tratamentos foram realizados após o período de migração, durante toda a cultura secundária. As células foram então fixadas e analisadas quanto à expressão do receptor de EGF (EGFR) e dos diferentes fenótipos celulares derivados da CN. Nossos resultados demonstram a expressão do EGFR pelas células da CNT 20h após o início da migração a partir do tubo neural, na cultura primária. O possível efeito do EGF na diferenciação condrocítica foi avaliado na CNC por apresentar o potencial mesectodermal. Em nossos resultados observamos frequência, número e tamanho dos nódulos de cartilagem equivalentes entre as condições controle e após tratamento com EGF, sugerindo que o EGF não influencia a diferenciação da CN para o fenótipo condrocítico. Para avaliar um possível efeito do EGF na potencialidade dos progenitores da CN, realizamos ensaios clonais, onde as células são plaqueadas individualmente sob controle microscópico. Identificamos progenitores comprometidos com as linhagens neuronal, glial, melanocítica ou muscular lisa, assim como progenitores bi, tri e tetrapotentes para diversas combinações destes fenótipos celulares. As proporções dos progenitores assim como a eficiência clonal (cerca de 60%) foram equivalentes nas duas condições experimentais, demonstrando que o EGF não interfere na proliferação nem na potencialidade dos progenitores da CN. Em trabalho anterior verificamos que o EGF promove aumento do número de melanócitos diferenciados identificados pela presença de melanina. Investigamos, então, se EGF influencia na diferenciação final dos melanócitos, avaliando a relação entre a expressão do marcador da linhagem melanocítica (melanocyte earlier marker, MelEM), que identifica tanto melanoblastos quanto melanócitos diferenciados, e a melanina. Observamos na condição controle que cerca de 20% das células da CN positivas para MelEM também apresentavam melanina, enquanto que após o tratamento com EGF essa proporção foi de 60%, correspondendo a um aumento de 3X. Esses resultados indicam que o EGF deva estar atuando sobre a etapa final do processo de diferenciação dos melanócitos, possivelmente envolvendo o processo da síntese de melanina. Entender o papel do EGF sobre a diferenciação melanocítica certamente contribuirá para avanços nos estudos de patologias que envolvam alterações no padrão de pigmentação, e as suas consequências, em organismos vertebrados.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:44:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290783.pdf: 23573020 bytes, checksum: 869ade48f72cd79f4dd6fe58a46ff16e (MD5) / A crista neural (CN) é uma estrutura transiente presente durante o desenvolvimento embrionário de vertebrados, sendo composta por um grupo de células originadas a partir das margens dorsais das pregas neurais durante o processo de neurulação. Os processos de migração e especificação das células da CN permitem classificá-las ao longo de todo eixo ântero-posterior do embrião: cranial, cardíaca, truncal e caudal; sendo que, cada região terá seus derivados específicos. Células da CN são células progenitoras altamente multipotentes que contribuem extensivamente para o desenvolvimento dos vertebrados dando origem a vários tipos celulares. Durante a neurulação, os progenitores originais da CN irão desaparecer junto com seu habitat inicial. Porém, mais tarde, locais como o dente aparecem como nichos tardios de progenitores oligopotentes derivados da CN, para manutenção e reparo destas estruturas, em vertebrados adultos. Neste trabalho, investigou-se in vitro a possibilidade de a polpa dental (PD) humana ser um possível nicho de CT/progenitoras da CN, sua característica mesenquimal e seu potencial de diferenciação e proliferação celular através de indução e análises fenotípicas das células da PD. A caracterizacão das células da PD como células-tronco mesenquimais foi observada, pelo potencial de diferenciação para fenótipos mesodermais (osteócitos, adipócitos e células de músculo liso), pela presença dos marcadores para CD73, CD90 e CD105 e ausência de CD45, avaliado por citometria de fluxo. As células da PD apresentam-se positivas para alguns marcadores de células-tronco embrionária (OCT4)e de células-tronco da CN (Snail, nestina), e negativas para outros (nanog; e p75e SOX 10, respectivamente) avaliado por RT-PCR e imunocitoquímica. Os resultados demonstraram ainda, que as células de PD apresentam potencial de diferenciação neural pois foram positivas por RT-PCR e imunocitoquímica para marcadores precoces de neuronio (-Tubulina III e Neurofilamento M) e de células gliais (P0), porém não apresentam os marcadores neuronais e gliais mais tardios (Periferina e GFAP, respectivamente). Todos os resultados foram semelhantes quando as células eram cultivas em meio padrão e o meio da CN. Em conjunto, os resultados sugerem que as células de PD utilizadas neste trabalho são células tronco mesenquimais. As células de PD apresentam ainda características de células da CN, avaliado pela presença dos marcadores Snail e nestina e pelo potencial de diferenciação em fenótipos derivados da CN como neuronal, glial e muscular liso. / The neural crest (NC) is a transient structure of vertebrate development, originated at the dorsal margin of the neural folds during neurulation. The NC are classified along the antero-posterior axis of the embryo in cranial, cardiac, truncal and caudal. Each region has its specific derivatives. NC correspond to a collection of highly multipotent progenitors that contribute extensively to the development of vertebrates and give rise to various cell types. During neurulation, the original progenitors of the NC will disappear along with their original habitat. However, in adult vertebrates, oligopotent NC progenitors appear as clusters in tissues such as the teeth, for maintenance and repair of these structures. In this study, we investigated the human dental pulp (DP) as a possible niche of NC stem cells (SC)/ progenitor cells. We also analyze their in vitro, potential for mesenchymal and neural differentiation, and proliferation. The results shown that DP cells could be characterized as mesenchymal SC by the presence of CD73, CD90 and CD105 and absence of CD45 in addition to their potential to differentiate in adipogenic and osteogenic mesenchymal phenotypes. Moreover, DP cells show the embryonic stem cell marker such as OCT4, and NC markers such as SNAIL and nestin, although there are negative for others (nanog and p75, SOX10, respectively). Taken together, the results demonstrate that DP cells are in fact mesenquimal stem cells, and also have some properties of NC cells such as the presence of the cell markers, SNAIL and nestin, and neural and smooth muscle differentiation potendial.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:35:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320037.pdf: 1679970 bytes, checksum: ef7c5e9994dac949503795a373ca9fb2 (MD5) Previous issue date: 2013 / A Crista Neural (CN) constitui uma população de células que emergem a partir das pregas dorsais do neuroepitélio durante a neurulação. Estas células migram ao longo de todo o eixo antero-posterior embrionário dos vertebrados até encontrarem seus locais definidos onde irão diferenciar em diversos derivados neurais e mesenquimais. As células da CN cefálica (CNC) e da CN Truncal (CNT) podem dar origem a neurônios e células gliais do sistema nervoso periférico, melanócitos e células endócrinas. Diferentemente do que ocorre com a CNC, a CNT possui uma limitada capacidade de originar elementos mesenquimais in vivo. Entretanto, sob determinadas condições in vitro, a CNT pode originar fenótipos mesenquimais. Até o momento, a maior parte dos estudos com a CNT foram realizados sobre substratos bidimensionais (2D), geralmente revestidos moléculas isoladas da matriz extracelular (colágeno, laminina, fibronectina) ou sobre monocamadas de fibroblastos embrionários (3T3). Atualmente, sabe-se que este tipo de ambiente não reflete a complexa fisiologia dos tecidos in vivo. No presente estudo nós realizamos cultivos de células isoladas da CNT sobre um extrato solúvel da membrana basal, comumente denominado de Matrigel. Elaboramos uma metodologia que permitiu criar dois microambientes dentro do mesmo poço de cultivo: um ambiente bidimensional (2D) e um ambiente tridimensional (3D). Verificamos que o Matrigel permite a diferenciação dos principais fenótipos da CNT (neurais: células gliais, células musculares lisas, neurônios, melanócitos e mesenquimais: condrócitos). Embora tenham sido observadas algumas variações na obtenção dos fenótipos descritos conforme o lote de Matrigel utilizado, o uso de uma mistura destes lotes permitiu normalizar a frequência de poços de cultivo contendo cada tipo celular. Além disso, 70% dos poços de cultivo apresentavam nódulos de cartilagem, os quais frequentemente se encontravam na região 3D. Interessantemente, esta frequência de condrócitos detectada utilizando um microambiente 3D de Matrigel, resultou ser muito maior quando comparado a trabalhos anteriores realizados sobre ambientes 2D convencionais. Estes dados sugerem que o Matrigel pode ser um ótimo substrato para estudar a diferenciação e multipotencialidade das células da CN. / Abstract : The Neural Crest (NC) is a cell population that detach from dorsal neural folds during neurulation. These cells migrate along the entire vertebrate embryonic axis until they find their final destination and differentiate into both neural and mesenchymal phenotypes. Cephalic NC (CNC) and Trunk NC cells (TNCCs) give rise to neurons and glia from the peripheral nervous system, melanocytes and endocrine cells. Differently from CNC, TNC have a limited capacity to give rise to mesenchymal derivatives in vivo. Nevertheless, under special culture conditions, TNC can give rise to mesenchymal phenotypes. Until now, most of studies of TNC were conducted on 2D substrates, usually covered with extracellular matrix molecules (e.g. collagen, laminin, fibronectin) or under fibroblast feeder-layers (3T3). Nowadays, it is worth knowing that this kind of environment does not mimic the complex tissue physiology in vivo. In the present study, we conducted cell cultures isolated from TNC on a soluble extract of basal membrane, commonly named Matrigel. We performed a new methodology that permitted to create two microenvironments in the same culture well: a two-dimensional (2D) and a three-dimensional (3D) environment. We observed that Matrigel permits the differentiation of the main TNC phenotypes (glial cells, melanocytes, smooth muscle cells, neurons and chondrocytes). Even though we observed some described variations on the phenotypes obtained according to the Matrigel lot used, the use of a mixture of lots allowed normalizing the frequency of culture wells containing each cell type. Moreover, 70% of culture wells contained cartilage nodules, which were frequently on the 3D zone. Interestingly, this frequency of chondrocytes detected using a 3D microenvironment of Matrigel resulted even higher than previous reports performed on traditional 2D cultures. Together, this data suggest that Matrigel could be an excellent substrate to study NC differentiation and multipotenciality.

Apesar do grande potencial de regeneração do tecido ósseo, em algumas situações a extensão da lesão impede que o tecido se repare completamente. Como uma alternativa em relação aos tratamentos convencionais, a terapia celular tem sido considerada como promissora para o reparo de defeitos ósseos. No entanto, poucos estudos investigaram a terapia celular utilizando osteoblastos, portanto, avaliamos o efeito da injeção direta de osteoblastos na regeneração do tecido ósseo. Como os osteoblastos têm origens embrionárias diferentes, foi comparado in vitro o potencial osteogênico de osteoblastos derivados da crista neural, do mesoderma e de ambas as origens embrionárias. Considerando a necessidade de grande número de células para a terapia, foi comparado o efeito de uma subcultura, como meio de aumentar a quantidade de células, no potencial osteogênico dos osteoblastos. Para avaliação da regeneração dos defeitos, osteoblastos foram injetados diretamente nesses defeitos. Osteoblastos foram obtidos da calvária de ratos recém-nascidos (Wistar), sendo que os derivados da crista neural foram isolados dos ossos frontais (OB-CN); os do mesoderma isolados dos ossos parietais (OB-MS); e de ambas as origens embrionárias isolados de toda a calvária (OB-Cal). O efeito da subcultura no potencial osteogênico foi avaliado em OB-Cal ou na primeira passagem dessa cultura (OB-Cal P1). Após até 14 dias em cultura, foram avaliadas a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz extracelular mineralizada e a expressão dos genes marcadores osteoblásticos: fator de transcrição runt-related 2 (RUNX2), ALP, osteocalcina (OC) e sialoproteína óssea (BSP). Para avaliar a regeneração do tecido ósseo, foram criados defeitos de 5 mm de diâmetro na calvária de ratos Wistar, que após 2 semanas foram tratados com 5 x 106 osteoblastos derivados de OB-Cal P1, por meio de injeção local. Ao final de 4 semanas, a formação óssea foi avaliada por microtomografia computadorizada e análise histológica. Os dados foram comparados por ANOVA, seguido do teste de Student-Newman-Keuls, ou teste t, quando apropriado, considerando o nível de significância de 5%. A comparação do potencial osteogênico em relação à origem embrionária mostrou que, os OB-MS apresentaram maior proliferação mas não houve diferença entre as culturas no evento final da diferenciação osteoblástica, que é a formação de matriz mineralizada. No entanto, como as culturas de OB-Cal apresentaram maior expressão gênica de marcadores iniciais, intermediários e finais dessa diferenciação; e considerando que, essas culturas são aquelas nas quais é possível obter o maior número de células, optamos por utilizar essas culturas na avaliação da formação óssea induzida pela terapia celular. Além disso, os resultados mostraram que os OB-Cal P1 tem seu potencial osteogênico reduzido, mas considerando que a subcultura permite a obtenção de maior número de células, são uma boa escolha para a terapia celular. Tanto que, ao avaliar in vivo a capacidade regenerativa das OBCal P1 no reparo dos defeitos ósseos, as análises microtomográficas e histológicas mostraram que que a terapia celular com injeção local de osteoblastos obtidos de fragmentos ósseos da calvária constitui uma estratégia adequada para estimular o reparo ósseo / Despite of the great potential of regeneration of the bone tissue, in some situations the extension of the lesion prevents the tissue from repairing completely. As an alternative to conventional treatments, cell therapy has been considered a promising strategy for the repair of bone defects. However, few studies investigated cell therapy using osteoblasts, therefore, we evaluated the effect of direct injection of osteoblasts on the regeneration of bone tissue. Since osteoblasts have different embryonic origins, the osteogenic potential of osteoblasts derived from neural crest, mesoderm and both embryonic origins was compared in vitro. Considering the need for a large number of cells for the therapy, the effect of a subculture, a common way to increase the amount of cells, on the osteogenic potential was also compared. Then, osteoblasts were injected directly into bone defects to evaluate the regeneration of bone tissue. Osteoblasts were obtained from the calvaria of newborn rats (Wistar), the neural crest derivatives were isolated from the frontal bones (OB-CN); those of the mesoderm isolated from the parietal bones (OB-MS); and from both embryonic origins isolated from the entire calvaria (OB-Cal). The effect of the subculture on the osteogenic potential was evaluated in OB-Cal and in its firstpassage (OB-Cal P1). After up to 14 days, all cultures were assayed for cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized extracellular matrix formation and the expression of the osteoblastic marker genes: runtrelated transcription factor 2 (RUNX2), ALP, osteocalcin (OC) and bone sialoprotein (BSP). To evaluate the effect of cell injection on bone regeneration, defects of 5 mm diameter were created in the calvaria of Wistar rats, that after 2 weeks were injected with 5 x 106 OB-Cal P1-derived osteoblasts. Vehicle injections were used as control. At the end of 4 weeks, the bone formation was evaluated by computerized microtomography and histological analysis. Data were compared by ANOVA, followed by the Student-Newman-Keuls test, or ttest, when appropriate, and the level of significance was set at 5%. The comparison of the osteogenic potential related to the embryonic origin showed that the OB-MS presented a greater proliferation but there was no difference between the cultures in the final event of the osteoblastic differentiation, that is the formation of mineralized matrix. However, as OB-Cal cultures showed greater gene expression of initial, intermediate and final markers of this differentiation; and considering that these cultures are those in which it is possible to obtain the largest number of cells, we selected these cultures for evaluating the bone formation induced by the cell therapy. In addition, the results showed that OB-Cal P1 still holds its osteogenic potential and despite being lower than that of OB-Cal as the subculture allows obtaining more cells, it has been considered as a good choice for cell therapy. In agreement with this, OB-Cal P1-derived osteoblasts injected into the bone defects were capable of inducing more bone formation than control, as revealed by microtomographic and histological analyzes. Therefore, it supports the idea that cell therapy with local injection of osteoblasts obtained from calvarial bone fragments is an adequate strategy to stimulate bone formation