As septinas constituem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeos de guanina e formação de heterofilamentos. Em mamíferos, tais proteínas estão envolvidas em uma variedade de processos celulares tais como citocinese, exocitose e tráfego de vesículas. A SEPT4 tem sido identificada em depósitos filamentosos e inclusões citoplasmáticas em Alzheimer e doença de Parkinson, respectivamente. A SEPT4 é a única proteína em associação com proteínas aberrantes em depósitos em ambos os tipos de doenças Assim, estudos adicionais de propriedades bioquímicas estruturais e funções fisiológicas para a SEPT4 podem promover importantes insights em relação ao mecanismo das doenças neurodegenerativas citadas acima. O desenovelamento térmico do domínio GTPase do SEPT4-G revelou um intermediário que agrega rapidamente na forma de fibras tipo amilóide em condições fisiológicas. Neste estudo a análise cinética da agregação do SEPT4-G foi monitorada utilizando fluorescência extrínseca e dicroísmo circular. Com os resultados e análises realizados durante este trabalho de mestrado foi possível compreender com mais detalhes a cinética de formação de agregados tipo amilóide do domínio SEPT4-G. Este trabalho também descreve a cristalização, coleta de dados, resolução e refinamento do modelo cristalográfico para a enzima Glutationa-S-Transferase de Xylella fastidiosa. Tal enzima está associada à patogenicidade da bactéria X. fastidiosa, responsável por várias doenças em plantas economicamente importantes, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC) ou Amarelinho. Algumas análises também foram realizadas após a obtenção do modelo cristalográfico demonstrando as diferenças estruturais entre GSTs bacterianas. / The septins are a conserved family of guanine nucleotides-binding and hetero-filament forming. proteins. In mammals they are involved in a variety of cellular processes, such as cytokinesis, exocytosis, and vesicle trafficking. SEPT4 has been reported to accumulate in tau-based filamentous deposits and cytoplasmic inclusions in Alzheimers and Parkinsons diseases respectively. Sept4 is unique in its association with the aberrant protein depositions in both types of diseases. Further studies on the biochemical, structural properties and physiological functions of Sept4 may therefore provide important insights into the common mechanism underlying diverse neurodegenerative disorders. Thermal unfolding of the GTPase domain of SEPT4 (SEPT4-G) revealed an unfolding intermediary which rapidly aggregates into amyloid-like fibers under physiological conditions. In this study, the kinetic analysis of aggregation of SEPT4-G was monitored using extrinsic fluorescence and circular dichroism spectroscopy. The aggregates have the ability to bind specific dyes such as Thioflavin-T (ThT), suggesting that they are amyloid in nature. Fibrils formation was monitored by the increase in ThT emission and electron microscopy as a function of temperature, pH, metal ions and protein concentration. Glutathione S-transferases (GSTs) form a group of multifunctional isoenzymes that catalyze the glutathione-dependent conjugation and reduction reactions involved in the cellular detoxification of xenobiotic and endobiotic compounds. GST from Xylella fastidiosa (XfGST) was crystallized by the vapour-diffusion method and its crystallography structure was solved for molecular replacement and refined. Afterwards, sequential and structural analyses were carried out for XfGST and others GSTs.

Orientadores: Beatriz Gomes Guimarães, Jose Antonio Brum / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-09-27T18:06:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rinaldi_FabioCupri_D.pdf: 8466921 bytes, checksum: 8a88bf7cf4ccef10efbca8ec0412db74 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As oxidoredutases de pontes dissulfeto da família DsbA são responsáveis pela catálise da formação de pontes dissulfeto em proteínas secretadas para o periplasma, participando do processo de enovelamento de fatores de virulência de diversos organismos. É a proteína com maior potencial de oxidação atualmente caracterizada e tal propriedade é associada às interações eletrostáticas envolvendo resíduos de seu sítio ativo, que apresenta um arranjo Cys-Pro-His-Cys altamente conservado. A bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa possui dois genes adjacentes que codificam duas oxidoredutases pertencentes à família das DsbAs (XfDbsA e XfDbsA2). Embora a XfDbsA conserve o arranjo CPHC, a XfDbsA2 possui a substituição do resíduo histidina, descrito como essencial à atividade da enzima, por alanina (CPAC). Visando a caracterização estrutural e funcional destas proteínas, a estrutura cristalográfica da XfDsbA foi determinada a 1,9 Å de resolução e um modelo por homologia da XfDsbA2 foi construído. Além disso os potenciais de oxidação das enzimas foram determinados por medidas de fluorescência. A estrutura da XfDsbA revelou a presença de um peptídeo ligado próximo a região do sítio ativo em um dos monômeros mostrando, pela primeira vez em uma estrutura a alta resolução, o provável modo de interação da DsbA com um substrato. Os ensaios funcionais revelaram que as DsbAs de X. fastidiosa apresentam potenciais redox similares e ligeiramente superiores ao da homóloga de Escherichia coli. Embora trabalhos sobre a importância do arranjo CPHC têm associado o alto potencial redox das DsbAs à presença do resíduo histidina no sítio ativo, os resultados obtidos para a XfDsbA2 mostraram que a substituição do resíduo de histidina por alanina não afeta seu potencial redox. A análise das interações envolvendo resíduos do sítio ativo mostrou diferenças importantes entre XfDsbA, XfDsbA2 e suas homólogas de E. coli e Vibrio cholerae. Ensaios funcionais com mutantes foram realizados em busca da identificação dos resíduos que possam compensar a ausência da histidina em XfDsbA2. Os resultados obtidos fornecem novas informações sobre o mecanismo molecular dessa família de enzimas / Abstract: Disulfide oxidoreductase DsbA catalyzes disulfide-bond formation in proteins secreted to the periplasm and has been related to the folding process of virulence factors in many organisms. It is the most oxidizing of the thioredoxin-like proteins and DsbA redox power is understood in terms of the electrostatic interactions involving the active site motif CPHC. The plant pathogen Xylella fastidiosa has two chromosomal genes encoding two oxidoreductases belonging to the DsbA family and, in one of them, the canonical motif CPHC is replaced by CPAC. Aiming at the structural and functional characterization of X. fastidiosa DsbAs, the crystal structure of XfDsbA was solved at 1.9 Å resolution and the XfDsbA2 homology model was calculated. We also determined the redox potential of both enzymes by means of fluorescence experiments. The crystal structure of the XfDsbA revealed an electron density corresponding to an 8-mer peptide interacting with the hydrophobic groove on the surface of the monomer C next to the active site. This modeled peptide shows at first time in a high-resolution crystal structure the probable mode of interaction between DsbA and a substrate. Furthermore, the results presented in this work surprisingly show that, despite the absence of the active site histidine in XfDsbA2, both proteins have similar redox potentials. In addition, the structure of XfDsbA revealed critical differences in the interactions involving the active site residues. Biochemical assays with XfDsbA mutants were performed in order to investigate the residues which may be responsible for compensate for the lack of the conserved histidine in XfDsbA2. The results presented contribute to the understanding of DsbA molecular mechanism / Doutorado / Física da Matéria Condensada / Doutor em Ciências

As galectinas, proteínas que compartilham características como afinidade por ?-galactosídeos e a presença de um domínio de reconhecimento ao carboidrato (CRD), tem como importante papel a decodificação de mensagens moleculares. As galectinas são encontradas em uma grande variedade de células e tecidos animais e estão envolvidas em diversos processos celulares relacionados a resposta imune e inflamatória. O grupo tandem-repeat das galectinas é formado por proteínas que apresentam dois CRDs distintos (CRD1 e CRD2) conectados por um peptídeo de ligação, ao qual pertencem as galectinas-4 e -12 humanas, alvos de nosso estudo. Durante o desenvolvimento do presente projeto foram utilizadas abordagens multidisciplinares através de técnicas biofísicas, cristalográficas, computacionais e imunoquímicas. Foi iniciado o estudo de caracterização estrutural da galectina-4 humana (hGal4) e seus domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2, de forma independente, através da produção heteróloga das proteínas e ensaios de estabilidade térmica e cristalização. As estruturas cristalográficas dos domínios foram determinadas a 1,48 e 2,46 Å de resolução, respectivamente e utilizadas para a construção de um modelo para a hGal4. Com base nos estudos de dinâmica molecular e estabilidade térmica foi possível propor um modelo de interação entre os CRDs através do peptídeo de ligação. Ensaios de dinâmica da hGal4 com LacNAc sugeriram uma diferença de plasticidade dos CRDs no reconhecimento do ligante. Foram também realizadas incessantes tentativas de desenvolver um protocolo de expressão heteróloga para as isoformas e domínios da galectina-12 humana (hGal12). Como resultado, observamos uma alta tendência à formação de corpos de inclusão e agregados resistentes a desnaturação, além da susceptibilidade ao ataque proteolítico. Os modelos estruturais dos domínios da hGal12 não permitiram identificar nenhuma característica que justificasse o comportamento das proteínas. Foram realizados estudos de localização celular em células HL-60 e foi possível identificar a presença da hGal12 na superfície das gotas de lipídio, organelas responsáveis pelo armazenamento de energia e o processo de catabolismo celular. A alta insolubilidade observada para as isoformas e domínios da hGal12, a sua localização em gotas de lipídeos, a divergência evolutiva da hGal12 quando comparada com outras galectinas do mesmo grupo e incluindo o fato de um dos CRDs não apresentar os requerimentos estruturais básicos para ligar ?-galactosídeos, nos leva a especular se essa proteína estaria, na verdade, sendo expressa como parte de um heterocomplexo proteico, que estabilizaria a estrutura da hGal12 e a endereçaria para as gotas de lipídeo. Em nossa hipótese, o domínio hGal12-CRD2 poderia ter evoluído para favorecer a interação com outros parceiros macromoleculares. Devido ao importante papel desempenhado pelas galectinas em inúmeros processos celulares, os resultados aqui obtidos representam uma importante contribuição no entendimento do papel que as galectinas hGal4 e hGal12 exercem nos diferentes eventos celulares, além de fornecem ferramentas experimentais para desenvolvimento de futuros estudos funcionais. / Galectins are proteins that share characteristics such as affinity for ?-galactosides and the presence of a carbohydrate recognition domain (CRD). They belong to a family of proteins that display the important role of decoding molecular messages. Galectins are found in a variety of cell types and are involved in several biological phenomena related to immune response and inflammation. The tandem-repeat group of galectins consists of proteins with two distinct CRDs (CRD1 and CRD2) connected by a peptide linker, in which belong galectins-4 and -12, targets of our study. During the development of the present project a multidisciplinary approach was used including the use of biophysical, crystallographic, computational and immunochemical techniques. The structural characterization of human galectin-4 (hGal4) and its hGal4-CRD1 and hGal4-CRD2 independent domains was initiated by their heterologous protein production, thermal stability and crystallization assays. The crystallographic structure of domains were determined at 1.48 e 2.46 Å resolution, respectively, and used for constructing a model for hGal4. Based on molecular dynamics and thermal stability studies we propose a model of interaction between CRDs mediated by linker peptide. Dynamics simulation of hGal4 with LacNAc suggested a difference in plasticity between CRDs and ligand recognition. In addition, several attempts have been made towards the development of a protocol for expression of isoforms and independent domains from human galectin-12 (hGal12). As result, we observed a high tendency to body inclusion formation and denaturing resistant aggregates, besides high susceptibility to proteolytic attack. Structural models for the hGal12 domains did not allow the identification of any feature to justify proteins behavior. Cell location studies in HL-60 cells were performed and hGal12 was found to be located on the surface of lipid droplets, organelles responsible for energy storage and catabolism. The high insolubility displayed by isoforms and domains from hGal12, together with its location on lipid droplets, the evolutionary divergence of hGal12 compared to tandem-repeat proteins, and the fact that hGal12-CRD2 does not present the structural requirements for ?-galactosides binding, suggest that hGal12 is, in fact, expressed as part of a protein complex that could both stabilize hGal12 structure and guide it to the lipid droplets. In our hypothesis, the hGal12-CRD2 could have evolved in order to favor the interaction with other macromolecular partners. Due to crucial roles displayed by galectins in innumerous biological process, we believe that our results represent an important contribution for the understanding of hGal4 e hGal12 proteins roles within the cell, besides providing experimental tools for the development of further functional studies.

O objetivo do presente trabalho é a elucidação da estrutura cristalográfica da proteína N-acetilglicosamina 6-fosfato desacetilase (desacetilase) da bactéria Escherichia coli. A desacetilase é um tetrãmero de subunidades idênticas de 382 aminoácidos e massa molecular de 41 kDa. Esta é uma enzima da via de catabolismo de açúcares aminados e cataliza a conversão do N-acetilglicosamina 6-fosfato em glicosamina 6-fosfato. Nesta via a bactéria dedica cinco genes organizados em um regulon, o nagE-nagBACD, com propósitos de obtenção de energia e de reciclagem de componentes de parede celular. A reciclagem de componentes de parede celular é a via de maior atividade metabólica de E. coli, na qual aproximadamente 40% dos peptidoglicanos de parede celular são quebrados a cada geração, sendo o N-acetilglicosamina (GlcNAc) reutilizado para a síntese de novo de peptidoglicanos e lipopolissacarídeos de membrana externa. O GlcNAc exerce funções multi-regulatórias na via de catabolismo de aminoaçúcares e a desacetilase é o maior fator controlador da sua concentração intracelular. Foi demonstrado que a desacetilase é a enzima mais importante da via e que sem ela a E. coli não é capaz de reciclar o GlcNAc. A desacetilase é encontrada em outros organismos desempenhando funções igualmente importantes, estando relacionada à captura e o armazenamento de carboidratos em hepatócitos e células sinusiais de fígado de camundongo, à morfogênese e à diminuição da patogenicidade e da adesão da Candida albicans a tecidos endoteliais, chegando também a ser estudada para desenvolvimento de inibidores contra o parasita da malária o Plasmodzum falciparum. Neste trabalho foram descritos os procedimentos desde a subclonagem do gene codificador da desacetilase de E. coli até a interpretação da sua estrutura quaternária, incluindo a expressão, a purificação, a cristalização, a produção de cristas derivados de átomos pesados, a estimativa de fases e a construção e refinamento do modelo cristalográfico. A estrutura foi resolvida por espalhamento anômalo de iodo de baixa resolução (2,9 angstron), em comprimento de onda único, sendo refinada a resolução de 2,0 angstron. Na unidade assimétrica encontram-se dois monômeros relacionados por um eixo de ordem 2 não cristalográfico aproximadamente a 15° da direção do eixo cristalográfico c. A simetria do cristal aplicada à unidade assimétrica leva a formação de um tetrâmero cuja área da superfície de tetramerização é de 5.343 angstron2, correspondente a 18,4% da área do dímero. A área de superfície de acessibilidade da interface dimerização é de 1.053 angstron2, correspondente a 6,8 % da área do monômero. O monômero da desacetilase é constituído por dois domínios: o beta, um pequeno sanduíche beta; e o alfa, um pseudo barril (beta/alfa)8 comum aos membros da super família da Amidohidrolases. O domínio-beta é constituído por duas folhas beta mistas e uma hélice alfa. O domínio- alfa é constituído por 11 hélices alfa e por três folhas beta, uma paralela e as outras duas anti paralelas. No domínio- beta, oito das onze hélices alfa formam ligações cruzadas com as oito fitas da folha beta paralela para formar o \"barril\" onde encontra-se o sítio ativo. No sitio ativo foi observada a presença de um íon fosfato. Os resíduos do sítio ativo que participam da ligação ao fosfato são Gln59, Glu131, His195, His216 e Asp273, dos quais pelo menos uma histidina e um ácido aspártico têm se conservado em membros da super família das Amidohidrolases / The goal of the present work is to elucidate the crystallographic structure of the protein N-acetylglucosamine Bphosphate deacetylase (deacetylase) from Escherichia coli. The deacetylase is a tetramer of identical subunits with 382 aminoacids and molecular weight of 41 kDa. It is an euzyme of the amino sugar catabolism pathway and it catalyzes the conversion of the N-acetylglucosamine Gphosphate in to glucosamine 6-phosphate. In this pathway the bacteria dedicates five genes organized in the nagE-nagBACD regulon for purposes of cell wall component recycling and energy production. The cell wall component recycling is the major E. coli metabolic pathway in which aproximately 40% of the cellular wall peptidoglicans is broken in each generation. Its degradation product, the amino sugar N-acetylglucosamine (GlcNAC) is reused for the peptidoglican and for the lipopolysacharide de novo synthesis. The GlcNAC plays several regulatory roles in the amino sugar catabolism pathway and deacetylase is its major intra cellular concentration controlling factos. It was demonstrated that without the deacetylase, E. coli is uncapable of recycling the GlcNAc. The deacetylase plays important roles in the other organisms in which it has been found. It is related to the carbohydrate up-take and storage in hepatocytes and sinusoidal cells from rat liver and to the Candida albicans morphogenesis, pathogenicity and adherence to the endothelial tissues. Deacetylase has also been studied in the development of inhibitors against the malaria parasite Plasmodzum falciparum. This work describes all the approaches from the nagA subcloning to the crystallographic structure analysis, including deacetylase expression, purification, crystallization, heavy atoms derivatives production, phasing, model building and model refinement. The E. coli deacetylase structure was solved by Single Anomalous Dispersion using low resolution (2,0 angstron) iodine anomalous scattering. The structure was refined to 2,0 angstron resolution. The contends of the asymmetric unit is a dimer related by a non-crystallographic 2-fold symmetry axis about 15° from the crystallographic axis c. The crystallographic symmetry applied to the asymmetric unit produces a tetramer, whose the surface accessibility of the buried area is 5.343 angstron, corresponding to 18.4 % of the dimer total area. The dimer surface accessibility of the buried area is 1.053 angstron2, corresponding to 6.8 % of the monomer total area. The deacetylase monomer folds into two domains, a pseudo (beta/alfa)8 barrel enclosing the catalytic site of the enzyme and a small beta sandwich made up from secondary structure elements contributed by the N and C termini. The beta domain is composed of two mixt beta sheets and one alfa helice. The alfa domain is composed of 11 alfa helices and 3 beta sheets, one of them parallel and the other two anti parallel. In the alfa domain, 8 alfa helices are cross linked to 8 beta strands to form the pseudo barrel which encloses the active site. A phosphate ion was found into the catalytic site. The catalytic residues that bind the phosphate ion are Gln59, Glu131, Hisl95, His216 and Asp273, from which at least one histidine and one aspartic acid are conserved amongst the Amidrohydrolases super family members

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3782.pdf: 3163554 bytes, checksum: 0618bd2bdada0c2a03100442eff64044 (MD5) Previous issue date: 2011-07-22 / Universidade Federal de Minas Gerais / Schistosoma mansoni is the parasite responsible for schistosomiasis mansonica, a disease that affects about 207 million people worldwide, and does not have the purine de novo sinthetic pathway, depending entirely on the purine salvage pathway to supply its demands on purines. Adenosine kinase (AK) and Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) are important enzymes of the purine salvage, the AK directly phosphorylates adenosine into adenosine monophosphate (AMP) and HGPRT is responsible for the reversible phosphorybosylation of hypoxanthine or guanine into IMP or GMP. The purine salvage pathway has been reported as a potential target for developing new drugs against schistosomiasis. The nucleotide coding region of the isoform 2 of AK enzyme was amplified and cloned into pGEM vector and pET28a, the recombinant protein was expressed in E.coli BL21 (DE3), purified in a his-tag nickel-affinity resin and AMP-agarose resin, tested for its activity and crystallized. Two data sets were obtained by X-ray diffraction: a ternary complex of AK2-AMP-adenosine in the MX2 light line of the Synchrotron Light National Laboratory and a binary complex AK2-tubercidin in the rotatory anode X-ray source of the Institute of Physics at Sao Carlos - USP, both at 2.3A of resolution. The nucleotide coding region of the enzyme HGPRT was also amplified, cloned into pGEM and pET28a, which heterologous expression was done in E.coli BL21 (DE3) cells at 18°C and purified on a cobalt his-tag affinitiy resin. / Schistosoma mansoni e o parasita responsavel pela esquistossomose mansonica, doenca que afeta cerca de 207 milhoes de pessoas em todo mundo, e nao possui a via de sintese de novo de purinas, dependendo integralmente da via de salvacao para seu suprimento de purinas. A adenosina kinase (AK) e a Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) sao importantes enzimas desta via, sendo a AK responsavel pela fosforilacao direta de adenosina para adenosina monofosfato (AMP) e a HGPRT pela fosforibosilacao reversivel de hipoxantina ou guanina para IMP ou GMP respectivamente. Essa via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos farmacos contra a esquistossomose. A regiao nucleotidica codificadora da enzima AK, isoforma 2, foi amplificada e clonada em vetor pGEM e pET28a, a proteina recombinante foi expressa em E.coli BL21 (DE3), purificada em coluna de niquel e AMP-agarose, submetida a ensaios de atividade e cristalizada. Dois conjuntos de dados foram obtidos por difracao de raio-X: um complexo ternario de AK2- AMP-adenosina na linha de luz MX2 do Laboratorio Nacional de Luz Sincrotron e um complexo binario de AK2-tubercidina no raio-X do Instituto de Fisica de Sao Carlos USP anodo rotatorio, ambos a 2.3A de resolucao. A regiao nucleotidica codificadora da enzima HGPRT tambem foi amplificada, clonada em pGEM e pET28a, sendo a proteina recombinante expressa em E.coli BL21 (DE3) a 18°C e purificada em coluna de cobalto.

As septinas constituem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeos de guanina e formação de heterofilamentos. Em mamíferos, tais proteínas estão envolvidas em uma variedade de processos celulares tais como citocinese, exocitose e tráfego de vesículas. A SEPT4 tem sido identificada em depósitos filamentosos e inclusões citoplasmáticas em Alzheimer e doença de Parkinson, respectivamente. A SEPT4 é a única proteína em associação com proteínas aberrantes em depósitos em ambos os tipos de doenças Assim, estudos adicionais de propriedades bioquímicas estruturais e funções fisiológicas para a SEPT4 podem promover importantes insights em relação ao mecanismo das doenças neurodegenerativas citadas acima. O desenovelamento térmico do domínio GTPase do SEPT4-G revelou um intermediário que agrega rapidamente na forma de fibras tipo amilóide em condições fisiológicas. Neste estudo a análise cinética da agregação do SEPT4-G foi monitorada utilizando fluorescência extrínseca e dicroísmo circular. Com os resultados e análises realizados durante este trabalho de mestrado foi possível compreender com mais detalhes a cinética de formação de agregados tipo amilóide do domínio SEPT4-G. Este trabalho também descreve a cristalização, coleta de dados, resolução e refinamento do modelo cristalográfico para a enzima Glutationa-S-Transferase de Xylella fastidiosa. Tal enzima está associada à patogenicidade da bactéria X. fastidiosa, responsável por várias doenças em plantas economicamente importantes, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC) ou Amarelinho. Algumas análises também foram realizadas após a obtenção do modelo cristalográfico demonstrando as diferenças estruturais entre GSTs bacterianas. / The septins are a conserved family of guanine nucleotides-binding and hetero-filament forming. proteins. In mammals they are involved in a variety of cellular processes, such as cytokinesis, exocytosis, and vesicle trafficking. SEPT4 has been reported to accumulate in tau-based filamentous deposits and cytoplasmic inclusions in Alzheimers and Parkinsons diseases respectively. Sept4 is unique in its association with the aberrant protein depositions in both types of diseases. Further studies on the biochemical, structural properties and physiological functions of Sept4 may therefore provide important insights into the common mechanism underlying diverse neurodegenerative disorders. Thermal unfolding of the GTPase domain of SEPT4 (SEPT4-G) revealed an unfolding intermediary which rapidly aggregates into amyloid-like fibers under physiological conditions. In this study, the kinetic analysis of aggregation of SEPT4-G was monitored using extrinsic fluorescence and circular dichroism spectroscopy. The aggregates have the ability to bind specific dyes such as Thioflavin-T (ThT), suggesting that they are amyloid in nature. Fibrils formation was monitored by the increase in ThT emission and electron microscopy as a function of temperature, pH, metal ions and protein concentration. Glutathione S-transferases (GSTs) form a group of multifunctional isoenzymes that catalyze the glutathione-dependent conjugation and reduction reactions involved in the cellular detoxification of xenobiotic and endobiotic compounds. GST from Xylella fastidiosa (XfGST) was crystallized by the vapour-diffusion method and its crystallography structure was solved for molecular replacement and refined. Afterwards, sequential and structural analyses were carried out for XfGST and others GSTs.

A fosforribosilpirofosfato sintase de cana-de-açúcar [sPRS] (EC: 2.7.6.1) é uma enzima de central importância em muitas vias metabólicas envolvida na produção do 5-fosforribosil-1-pirofostato [PRPP] a partir da ribose-5-fosfato [R5F]. O gene da sPRS, seqüenciado como parte do projeto SUCEST, codifica para uma proteína com 328 aminoácidos e massa molecular 36,6 KDa. Essa proteína, após expressa heterologamente em Escherichia coli e purificada, foi cristalizada e submetida a experimentos de difração de raios X. A partir dos métodos cristalográficos e da modelagem por homologia pôde-se construir um modelo tridimensional. Cada subunidade da unidade biológica homohexamérica da sPRS correlaciona-se simetricamente com as demais através de um eixo de ordem 2 perpendicular a outro de ordem 3, formando uma simetria pontual 32. Experimentos de atividade enzimática para a sPRS indicam independência da sua atividade catalítica ao íon fosfato. Através do estudo comparativo entre a sPRS e sua homóloga fosforribosilpirofosfato sintetase de Bacillus subtillis [bPRS] (fosfato dependente) pudemos identificar similaridades estruturais na região do sítio catalítico e significativas diferenças no sítio alostérico. Os resultados revelam que essas diferenças estruturais na região do sítio alostérico são consistentes com a diferença funcional observada, sendo um importante passo rumo a compreensão da correlação estrutura-atividade para a sPRS fosfato independente. / The sugarcane phosphoribosylpyrophosphate synthase [sPRS] (EC:2.7.6.1) is an enzyme of central importance in severa1 pathways in all cells and produce the 5-phosporybosyl-1-pyrophosphate [PRPP] from the ribose-5-phosphate [R5F]. The gene of the sPRS was sequenced as part of the SUCEST project, encodes to 328 aminoacid protein with a molecular weight of 36,6 KDa. After being expressed in Escherichia coli and purified, the sPRS enzyme was crystallized and diffraction experiments were undertaken. From crystallographic methods and molecular modeling the tri-dimensional model was built. Each subunit of the sPRS homo-hexameric biological unit is symmetrically connected to the others through a 2-fold axis perpendicular to another 3-fold axis forming a 32 point symmetry. The sPRS enzyme activity assay indicates its independence of the presence of the phosphate ion. Through the comparative studies between the sPRS and the homologue from Bacillus subtillis phosphoribosyl pyrophosphate synthetase [bPRS] (phosphate dependent) we were able to identify structural similarities on the catalytic site and insightful differences on the allosteric site. These results show that structural differences in the allosteric site are consistent with functional difference observed and are an important step toward structure-activity comprehension for sPRS phosphate independent.

O atual crescimento do número de estruturas tridimensionais de proteínas está produzindo um banco de dados de estruturas que é muito útil como ponto de partida para o desenvolvimento de novas moléculas relevantes do ponto de vista médico tais como drogas e vacinas. Neste trabalho, parte do projeto de desenvolvimento de novas drogas contra a doença do sono foi feita baseada nos estudos cristalográficos de ligação de compostos e de modelagem molecular de duas enzimas glicolíticas presentes no glicossomo de T. brucei. Como o alvo para novas drogas e o ciclo de glicólise, o qual também é presente nos seres humanos, o novo ligante deve ser seletivo. Frutose-1,6-bisfosfato aldolase (ALDO) é uma das proteínas alvo para o desenho racional de drogas. A análise estrutural e estudos cristalográficos da ALDO de T. brucei foram feitos, através do uso de proteína produzida em grandes quantidades por via recombinante. Vários possíveis sítios de seletividade foram encontrados em ALDO de T. brucei quando comparada as três seqüências das isoenzimas humana, tendo como base a estrutura tridimensional da isoenzima ALDO A. O braço flexível da região C-terminal é um forte alvo para compostos seletivos devido a não-conservação das seqüências. Cristais foram crescidos e padrões de difração de raios-X foram obtidos até 3.0&#197, mas ainda os cristais são pequenos e mostram-se sensíveis a radiação. Triosefosato isomerase (TIM) é outra ptoteína alvo analisada neste trabalho. A estrutura da TIM de T. brucei é conhecida a alta resolução. Cristais de proteína expressa em bactérias foram obtidos após extensivos experimentos. Foi identificado que usar proteína recentemente preparada é essencial para obter cristais que apresentem boa qualidade de difração. Depois de obtidos cristais de proteína expressa em grades quantidades, foram feitos experimentos de difusão de novos inibidores, coleta de dados de difração e análises das estruturas dos possíveis complexos. A conhecida estrutura em volta flexível da TIM fecha quando se liga o substrato ou um inibidor análogo ao substrato no sítio ativo. Desenho racional de drogas tem sido seguido usando como padrão a conformação fechada da estrutura em volta. No entanto, com a obtenção de um novo complexo, no qual a estrutura em volta adota a conformação aberta foi feita uma busca de novos compostos em bancos de dados, que não fossem derivados de fosfatos e fosfoantos, através do programa DOCK. Com este procedimento são propostos novos compostos guia os quais serão utilizados no ciclo do desenho racional de drogas. A estrutura da triosefosfato isomerase de Bacillus stearothermophilus que apresenta estabilidade térmica em complexo com o inibidor competitivo 2PG foi determinada por cristalografia de raios-X à resolução de 2.8&#197. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o programa XPLOR. Promediação da densidade eletrônica de ordem dois e nivelamento do solvente foram aplicados para melhorar a qualidade do mapa. Ambos os sítios ativos estavam ocupados pelo inibidor e a estrutura emvolta flexível adota a conformação fechada em ambas as subunidades. O fator cristalográfico R é de 17,6% com boa geometria. Bacillus stearothermophillus é considerado um organismo de estabilidade térmica moderada. Encontram-se disponíveis cinco estruturas de triosefosfato isomerase de organismos mesofílicos. A estrutura obtida neste trabalho é a primeira TIM reportada que apresenta estabilidade térmica. Vários artigos têm listados fatores de estabilidade térmica, os quais foram analisados em todas as estruturas de TIM disponíveis. Neste trabalho foi conduzida uma comparação entre a estrutura termofílica e as mesofílicas disponíveis, da qual se concluiu que a interação hidrofóbica na formação do dímero, e o alto número de prolinas são os mais importantes fatores que contribuem para a estabilidade térmica da TIM de B.stearothermophilus. Também concluiu-se que a razão Arg/(arg+Lys) é elevada em TIM de B. stearothermophilus mais devido ao baixo número de lisinas do que a um alto número de argininas. Analisou-se as argininas na TIM de B. stearothermophilus como também as interações das argininas e lisinas em todas as outras estruturas de TIM e não foi possível relacionar o valor aumentado da razão Arg/(arg+Lys) com a estabilidade térmica, fator este indicado anteriormente como importante para a estabilidade térmica / The current growth in the number of known 3-dimensional proteins structures is producing a database of structures that is very useful as starting point for the development of new medically relevant molecules such as drugs and vaccines. In this work part of the project of developing new drugs against the sleeping sickness has been done based on crystallographic, ligand-binding and molecular modeling studies of two glycolytic glycosomal enzymes from T. brucei. As the target for new drugs is the glycolysis pathway, which is present also in the human being, the new ligand must be selective. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase (ALDO) is one of the target protein for the rational drug design. The structural analysis and crystallographic studies of ALDO from T. brucei have been done, from overexpressed protein. Several possible sites for selective inhibitor were found in T. brucei ALDO when compared with the three human isoenzyme sequences, based on the human ALDO A structure. The flexible C-terminal arm is a promising target for selective compounds, due to the non-conserved sequence. Crystals were grown, and X-ray diffraction was obtained up to 3.0&#197, but still the crystals are small and show radiation damage. Triosephosphate isomerase (TIM) is the other target protein analyzed in this work. The structure of TIM from T. brucei is already known at high resolution. Crystals from overexpressed protein were obtained after extensive experiments. It was identified that the use of fresh protein is essential to grow good diffracting crystals. After obtaining crystals from overexpressed protein, it has been done soaking of new inhibitors, diffraction data collection and analysis of the structures of the possible complexes. The well known flexible loop in TIM closes upon the binding of either the substrate or an inhibitor analogue to the substrate in the active site. Rational drug design has been followed based on the \"closed\" conformation of the flexible loop. Nevertheless, with a new complex structure, in which the flexible loop adopts the \"open\" conformation, it has been done a search for new compounds in the database, non-derived from phosphate and phosphonate, through the program DOCK. Based on this procedure it was proposed new lead compounds which will be used on the rational drug design cycle. The structure of the thermostable triosephosphate isomerase from Bacillus stearothermophilus in complex with the competitive inhibitor 2PG was determined by X-ray crystallography to a resolution of 2.8&#197. The structure was solved by molecular replacement using XPLOR. Two fold averaging and solvent flattening were applied to improve the quality of the map. Both of the active sites were occupied by the inhibitor and the flexible loop adopts the \"close\" conformation in both subunits. The crystallographic R-factor is 17.6% with good geometry. Bacillus stearothermophilus is considered a moderate thermophile organism. There are already five triosephosphate isomerase structures available from mesophilic organisms. The structure reported here is the first thermostable TIM reported. It has been conducted in this work a comparison between the thermophilic and the mesophilic protein structures available. Several reports had listed thermostable factors, which have been analyzed in all TIM structures available, from which it has been concluded that the hydrophobic interaction upon the dimmer formation and the higher number of proline residues are the most important factors that contribute to the thermostability of B. stearothermophilus TIM. Also it has been concluded that the ratio Arg/(Arg+Lys) is increased in B. stearothermophilus TIM more due to lower number of lysine instead of a higher number of arginine residues. Arginines have been analyze in B. s,tearothermophillis TIM as well as the interactions of arginines and lysines in all other TIM structures and it has not been possible to relate the increased ratio Arg/(Arg+Lys) with thermo stability, which was previously reported as important in thermostability

Um dos maiores problemas encontrados em terapias anti-retrovirais contra AIDS é a emergência de variantes virais que exibem resistência aos fármacos disponíveis e subtiposvirais naturalmente mais suscetíveis ao desenvolvimento de falha terapêutica. Neste trabalho nós resolvemos as estruturas cristalográficas de quatro proteases de HIV-1 complexadas com o inibidor universal C2 simétrico TL-3. As proteases utilizadas foram extraídas de pacientes com AIDS, uma do subtipo B selvagem (Bwt), uma do subtipo F selvagem (Fwt), e um mutante de cada um dos subtipos (Bmut e Fmut), esses dois últimos de pacientes apresentando falha terapêutica. As proteínas foram produzidas por expressão heteróloga em bactérias Escherichia coli, purificadas à partir das proteínas dos corpos de inclusão, e reenoveladas. Os dados coletados foram processados à uma resolução de 2.1 A para o complexo Bwt:TL-3, 1.75 A para Bmut:TL-3, 2.1 A para Fwt:TL-3 e 2.8 A para Fmut:TL-3. Esses dados foram inicialmente processados em P6122 e, posteriormente, reprocessados em P6i. As estruturas foram resolvidas por substituição molecular utilizando a estrutura de uma protease de HIV-1 publicada como modelo. A análise dessas quatro estruturas mostrou que o inibidor TL-3 liga-se de maneira muito próxima em todas elas. Nas proteases Bmut e Fmut a mutação V82A causa um reempacotamento do bolsão SI\', que se reflete num rearranjo da cadeia lateral do inibidor em Pl\'. Nossas análises indicaram, ainda, que algumas substituições polimórficas entre os subtipos B e F podem levar à maior estabilização de regiões naturalmente flexíveis nas proteases do subtipo F, originando uma enzima intrinsicamente menos ativa e resistente à alguns inibidores. Nas proteases Fwt e Fmut, a substituição polimorfica M36I causa um deslocamento do loop entre os resíduos 35-41, que levaria à perda de flexibilidade dos fiaps e do loop 76-83 no sítio ativo. Nossas comparações indicaram também que a substituição L89M nos subtipos não B pode ser equivalente à mutação de resistência L90M em subtipos B. Por fim, esses dados estruturais nos permitiram sugerir modificações na estrutura do inibidor TL-3 que poderiam levar à um aumento da sua potência. Nesta tese também apresentamos os dados de resolução e análise estruturais da L-asparaginase de Escherichia coli, resolvida à uma resolução de 1.95 A no grupo espacial C2. Baseados em dados estruturais e cinéticos propusemos um mecanísmo de reação geral para as amidohidrolases, que incluem as L-asparaginases, através da formação de duas tríades catalíticas Thr-Tyr-Glu e Thr-Lys-Asp, envolvendo as duas treoninas no sítio ativo. Nossas análises do volume da cavidade catalítica de três amidohidrolases também indicam que o aumento da atividade L-glutaminase em algumas enzimas é diretamente proporcional ao aumento do volume dessa cavidade. / One of the major problems faced in antiviral therapy against AIDS is the emergence of viral variants that exhibit drug resistance, as well as viral subtypes naturally more liable to development of therapeutic failure. In this work we solved the crystal structure of four HIV-1 proteases complexed with the universal C2 symmetry-based inhibitor TL-3. These proteases where obtained from patients with AIDS: one of the subtype B wild type (Bwt), one of the subtype F wild type (Fwt), and a mutant of each subtype (Bmut and Fmut), these last two out of patients showing therapeutic failure. The proteins were produced by Escherichia coli bacteria heterologous expression, purified out of the inclusion bodies, and refolded. The collected diffraction data were processed to 2.1 A resolution for the Bwt:TL-3 complex, 1.75 A for Bmut:TL-3, 2.1 A for Fwt:TL-3 and 2.8 A for Fmut:TL-3. These data were initially processed in the P6122 space group and latter reprocessed in P6i. The four structures were solved by molecular replacement using a published HIV-1 protease structure as a model. The structural analysis shown that the TL-3 inhibitor binds in a similar fashion in the active site of all four structures. On the proteases Bmut and Fmut the mutation V82A causes a repacking of the SI\' pocket which rerranges the inhibitor\'s side chain at P1\' subsite. Our analysis further indicate that some polymorphic substitutions between subtypes B and F could lead to a stabilization of naturally flexible regions on subtype F proteases, creating a intrinsically less active resistant enzyme. On the proteases Fwt and Fmut the polymorphic substitution M36I leads to the displacement of the loop between residues 35-41, which would cause a flexibility loss of the flaps and of the loop 76-83 in the active site. Our comparisons further indicate that the polymorphic substitution L89M on non-B subtypes could be equivalent to the L90M resistance mutation on subtype B proteases. Lastly, based on these structural data we were able to suggest a few structural modifications on the TL-3 inhibitor that could furnish a more potent inhibitor. On this thesis we also present the data of structural solution and analysis of the Escherichia coli L-asparaginase solved at 1.95 A resolution in C2 space group. Based on structural and kinetical data we proposed a general reaction mechanism for amidohidrolases, which include L-asparaginases, involving the formation of two catalytic triads Thr-Tyr-Glu and Thr-Lys-Asp, which acounts for the two threonines in the active site. Our cavity volume analysis of three amidohidrolases also indicate that the increasing in the L-glutaminase activity in some enzimes is directly proportional to the increase in the cavity volume.

A doença do sono é causada pelo parasita Tripanosoma brucei. Considerada uma doença negligenciada, mata milhares de pessoas todos os anos na África subsaariana. O T.brucei não apresenta resposta imune pronunciada, o que dificulta o desenvolvimento de vacinas, e os medicamentos disponíveis são escassos. Os tripanossomatídeos são comprovadamente sensíveis ao stress oxidativo causado pelo radical superóxido. Assim, as enzimas superóxido dismutases (SODs) são a primeira linha de defesa contra esse radical. As SODs são metalo enzimas (EC 1.5.1.1) capazes de catalisar a dismutação do superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. São classificadas de acordo com o metal incorporado na estrutura: cobre e zinco (CuZnSOD), ferro ou manganês (Fe/MnSOD) e níquel (NiSODs). Neste trabalho de mestrado, a enzima TbFeSODB2 de T.brucei foi, expressa, purificada, cristalizada e teve sua estrutura resolvida. A estrutura cristalográfica da enzima do parasita foi comparada com a enzima humana análoga contendo manganês (HuMnSOD), onde foram evidenciadas as principais diferenças entre as duas estruturas que podem ser exploradas para o desenho do novos inibidores seletivos. Foi realizada uma análise de acoplamento estatístico, onde com base em um alinhamento múltiplo dessas enzimas determinou-se resíduos que são capazes de interferir na seletividade do metal incorporado e estado oligomérico das SODs. / Sleeping sickness, caused by the parasite Tripanosoma brucei, is considered a neglected disease, killing thousands of people every year in subsaharian Africa. T. brucei does not generate a pronounced immune response, difficulting the development of vaccines. Furthermore, available medicines are scarce. Tripanosomatides are known to be sensitive to oxidative stress caused by the superoxide radical. Therefore, the superoxide dismutase enzymes (SODs) are a primary line of defence for the parasites against this radical. SODs are metalloenzymes (EC 1.5.1.1) capable of catalyzing superoxide dismutation into molecular oxygen and hydrogen peroxide. SODs are classified according to the incorporated metal: copper/zinc (CuZnSOD), iron/manganese (Fe or MnSOD) and nickel (NiSODs). In the work presented here, TbFeSODB2 from T. brucei was expressed, purified, crystallized and its 3D structure solved. The crystal structure of the parasite enzyme was compared to the homologous human enzyme containing manganese (HuMnSOD), revealing evidence for differences between both structures which could be exploited in the design of new selective inhibitors. In addition, a statistical coupling analysis was performed on the entire Fe/MnSOD superfamily, based on a multiple sequence alignment. It was shown that this technique was able to identify novel residue determinants of metal selectivity and oligomeric state.