Se desarrolló una técnica analítica por cromatografía liquida de alta performance (HPLC) para cuantificar los principios activos clonixinato de lisina y pargeverina clorhidrato en tabletas recubiertas, debido a que la técnica de análisis para este medicamento compuesto no se encuentra en libros oficiales. La técnica de análisis para ambos principios activos es realizada en un solo sistema (fase móvil, columna cromatográfica, longitud de onda), diferenciándose sólo en la preparación de la muestra y el volumen de inyección por lo que no pueden ser cuantificadas en un solo cromatograma, debido a la gran diferencia de sus concentraciones en la tableta y sus propiedades de solubilidad. Previamente a la validación se evaluó la aptitud del sistema. Los resultados fueron conformes a las especificaciones para un método cromatográfico recomendadas por la USP 30, comprobando que el equipo, el sistema electrónico, las operaciones analíticas y las muestras a analizar constituyen un sistema integral que puede evaluarse como tal. Para la validación se evaluaron los parámetros de desempeño de la técnica como son: Selectividad, Exactitud, Precisión, Precisión Intermedia, Linealidad y Rango. Los resultados de estos parámetros se sometieron a pruebas estadísticas demostrando que la técnica analítica propuesta para la cuantificación de los principios activos es selectiva, exacta, precisa y lineal, así mismo la confiabilidad de la nueva técnica, garantizando de esta forma la calidad, eficacia e inocuidad del medicamento. / An analytical technique by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed to quantify the active principles lysine clonixinate and pargeverine chlorhidrate in covered tablets, because the technique of analysis for this compound medicine is not in official books. The technique of analysis for both active principles is made in a single system (movable phase, chromatographic column, wavelength), being different itself only in the sample preparation and the volume of injection reason why cannot be quantified in a single chromatogram, due to the great difference of their concentrations in the tablet and its properties of solubility. Previously to the validation the aptitude of the system was evaluated. The results were in agreement to the specifications for a chromatographic method recommended by the USP 30, verifying that the equipment, the electronic system, the analytical operations and the samples to analyze constitute an integral system that can be evaluated like so. For the validation the parameters of performance of the technical were evaluated as they are: Selectivity, Accuracy, Precision, Intermediate Precision, Linearity and Range. The results of these parameters were also put to the test statistical demonstrating that the proposed analytical technical for the quantification of the active principles is selective, exact, precise and linear, to the trustworthiness of the new technical, guaranteeing of this form the quality, effectiveness and harmlessness of the medicine.

El análisis por HPLC, de productos farmacéuticos son una necesidad y de uso rutinario. Esta técnica evita errores que conllevan a situaciones de riesgo al usuario, garantizando que la dosis prescrita llegue al paciente en la cantidad apropiada. En la rutina de laboratorio reduce repeticiones analíticas y facilita mayor rapidez en los análisis que adecuadamente validadas dan confiabilidad a los resultados. Las farmacopeas vigentes contemplan en la mayoría de los casos análisis por HPLC para monofármacos o asociaciones de dos o más principios activos por separado lo cual demanda un mayor tiempo de análisis y un mayor costo. La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas y demostrativas de que un método de análisis es lo suficientemente fiable y reproducible para producir el resultado previsto dentro de los intervalos definidos. La validación de un método analítico es un requisito necesario para cumplir con las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) y así asegurar la calidad del medicamento. El presente trabajo plantea el uso de un solo método analítico por HPLC para un producto farmacéutico en presentación de Crema que contiene en su formulación dos principios activos: Clotrimazol y Dexametasona Acetato, los cuales se determinan en un solo análisis, el cual seguidamente fue validado para determinar así la aplicabilidad del método. En la validación del método analítico se evaluaron una serie de parámetros que están indicados en obras oficiales, como son: selectividad, linealidad, precisión, exactitud y robustez. Posteriormente, se elaboró el Protocolo de validación del método de análisis, para lo cual se contó con el diseño experimental y los procedimientos estadísticos, concluyéndose así que el método analítico propuesto es selectivo, lineal, preciso, reproducible y exacto; y de esta manera comprobamos la validez del método analítico desarrollado. / The analysis for HPLC of pharmaceutical products is a necessity and of routine use. This technique avoids mistakes that make risk situations to user, guaranteeing that the prescribed dose arrives at the patient in the appropriate amount. In the laboratory routine it reduces analytical repetitions and it facilitates greater rapidity in the analysis that suitably validated give trustworthiness to the results. The effective pharmacopeias contemplate in the most of the cases analysis for HPLC, for monodrugs o associations of two or more actives principles which demands a greater time of analysis and greater cost. The validation is the process established for the obtaining of documented and demonstrative tests that an analysis method is the sufficiently trustworthy and reproducible for produce the result anticipated inside the defined intervals. The validation of an analytical method is a requirement necessary to fulfill the Good Practices Manufacture (BPM) and thus to assure the quality of medicament. The present work shows the use of a single analytical method for HPLC for a pharmaceutical product in cream presentation that contains in its formulation two actives principles: Clotrimazole and Dexamethasone acetate, which are determined in a single analysis, which after was validated to determine thus the applicability of the method. In the validation of analytical method a series of parameters was evaluated that are indicated in official works, as they are: selectivity, linearity, precision, exactitude and robustness. Later, the Protocol of Validation of analysis method was elaborated, for which it counted on the experimental design and the statistical procedures, concluding so the proposed analytical method is selective, linear, precise, reproducible and exact; and this way we verified the validity of developed analytical method.

Desarrolla un método rápido y confiable para la cuantificación de medroxiprogesterona acetato suspensión inyectable. Con la intención de cuantificar el principio activo (medroxiprogesterona acetato) mediante un sistema cromatográfico por UHPLC el cual reducirá el tiempo en respuesta de control de calidad, a fin de obtener los resultados adecuados para diseñar la metodología analítica correcta. Una vez establecidas las condiciones cromatográficas finales con los parámetros definidos para el trabajo, se efectúa la validación del método desarrollado y su posterior comparación de beneficios del nuevo método (horas análisis y costo). Después de evaluar varios sistemas cromatográficos el más adecuado resulta ser el que utilizaba como fase móvil: Buffer acetato 20mM pH 5,0: metanol (40:60), empleando la columna Kinetex 2,6 μm XB-C18 100A 50 x 2,1 mm a flujo 0,5 mL/min; temperatura 35 °C; volumen de inyección de 1 μL empleando un detector UV a 245 nm el cual es finalmente validado de acuerdo a guías internacionales como la ICH Q2 (R1), Farmacopea USP y procedimientos internos del laboratorio. El método resulto ser específico para medroxiprogesterona acetato lineal, preciso y exacto en el intervalo de 0,096 mg/mL a 0,144 mg/mL con un coeficiente de determinación de 0,9995; al comparar resultados de dos lotes evaluados con el método tradicional (USP), el método por UHPLC no se encuentra variación significativa. Existe una reducción del 60% de horas hombre; 80% de horas máquina y de 22% del costo de reactivos y mano de obra en relación al método tradicional (USP) empleado en la cuantificación de medroxiprogesterona acetato suspensión inyectable. / Tesis de Segunda Especialidad

El principal coste en la industria biotecnológica se produce en I+D, alcanzando un 53% de los ingresos en USA y 63% en Europa (1997-1999). Esto se explica por la complejidad de las técnicas utilizadas, como en algunos procesos de separación y purificación de proteínas. Para disminuir los costes en I+D, se puede reducir el tiempo de diseño de éstas utilizando modelos. Dos técnicas utilizadas extensamente para la separación de proteínas son la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y los sistemas de dos fases acuosas (ATPS), para las cuales existen diversos modelos predictivos que se basan en una o más propiedades del sistema y/o la molécula a separar. Las principales limitantes de estos modelos son la capacidad predictiva, y la cantidad y coste de la información requerida. En los modelos que utilizan hidrofobicidad, una limitante adicional es la escala de hidrofobicidad utilizada. Por esto, el presente trabajo tiene como objetivo generar nuevas escalas de hidrofobicidad que mejoren el poder predictivo de modelos reportados para el tiempo de retención adimensional (DRT) de proteínas en HIC, y el coeficiente de partición (K) de proteínas en cuatro tipos de sistemas ATPS. Se analizó un grupo reportado de 74 escalas de propiedades aminoacídicas (APVs), mediante los siguientes algoritmos de clustering: Growing Neuronal Gas (GNG), Growing Grid (GG), Hierarchical Clustering, Bisection Algorithm, Restricted Neigbouhood Search Algorithm, y Markov Clustering Algorithm. Se utilizó también el algoritmo de optimización Genetic Algorithm (GA). Para la predicción de DRT y K, en cada caso se utilizó un modelo que requiere la estructura tridimensional de las proteínas y tres modelos que solo requieren la composición aminoacídica, los que calculan o predicen la hidrofobicidad superficial media (ASH). El poder predictivo de los modelos se calculó mediante validación cruzada de Jacknife. A través de la metodología empleada se obtuvo 308.000 nuevas escalas, de las cuales un 93% se generó con GNG, GG y GA, incluyendo las escalas más exitosas. En general, la utilización de las nuevas escalas permitió desarrollar modelos con un mejor poder predictivo que los basados en escalas reportadas en literatura. Estas mejoras se reflejaron en un aumento del poder predictivo entre un 11% y un 99,6% en un 81% de los casos con respecto al caso base. De forma simultánea, dentro de los modelos con aumento del poder predictivo se obtuvo mejoras en el nivel de ajuste, medido a través del Coeficiente de Pearson, de un 4% a un 300% en 28 de 42 casos (67%). A partir del estudio de las mejores escalas obtenidas y los APVs, se concluyó que existe transferencia de propiedades desde estos últimos a las escalas generadas con GNG y GG. Por otro lado, se descartó transferencia de propiedades a las escalas generadas con GA, sin embargo, se validó su uso. Se determinó que las mejores escalas contienen información de APVs asociados a estudios de: hidrofobicidad en sistemas físicoquímicos (HIC y ATPS), hidrofobicidad de aminoácidos en proteínas, y propensión conformacional de aminoácidos en proteínas. Los resultados obtenidos sugieren que incluir APVs del tipo conformacional permite mejorar las escalas obtenidas, disminuyendo el sesgo introducido por el uso de la ASH. Lo anterior sugiere que una escala que refleje la probabilidad de ocurrencia de cada aminoácido en distintos tipos de estructurasconfiguraciones existentes en la superficie de las proteínas, y que incorpore el potencial hidrofóbico de cada de éstas, podría ser útil para mejorar el poder predictivo de los modelos. En conclusión, a través del uso de algoritmos de clustering y optimización se logró un aumento significativo del poder predictivo de los modelos para HIC y ATPS, el que incluso es mayor al que se obtiene con otros modelos que incorporan directamente más información experimental, lo que permite reducir costes en I+D. La contribución realizada postula nuevas interrogantes y sugiere caminos que amplían y perfeccionan la búsqueda de metodologías para generar mejores modelos predictivos del comportamiento de proteínas en sistemas de separación, que requieren sólo la composición aminoacídica de las proteínas.

Memoria para optar al Título Profesional de: Ingeniero Agrónomo / La calidad de los vinos está determinada por numerosos factores, dentro de los cuales destaca la fracción aromática. Ésta juega un rol fundamental pues en algunos casos puede llegar a determinar la elección del consumidor. Un compuesto aromático de importancia en enología es la Isobutilmetoxipirazina (IBMP), ya que su presencia puede ser considerada positiva o negativa según el tipo de vino donde se encuentre. En el caso de la mayoría de los vinos tintos, es considerada un defecto por su bajo umbral de percepción olfativo y por los descriptores sensoriales que imprime al vino. Debido a lo anterior, se ha planteado el siguiente trabajo, donde se evaluó el efecto de los compuestos fenólicos sobre la volatilidad de compuestos de la familia de las pirazinas, en este caso, de la isobutilmetoxipirazina. El estudio constó de dos ensayos independientes entre sí. El primero consideró la evaluación del efecto de dos compuestos fenólicos monoméricos (ácido gálico y (+)-catequina) de diferente polaridad y a diferentes concentraciones. El segundo ensayo utilizó fracciones de proantocianidinas de distinta masa molecular (FI: Monómeros, FII: Oligómeros, FIII: Polímeros). En ambos ensayos, se determinó el efecto de los compuestos fenólicos sobre la volatilidad de la IBMP. La investigación se basó en la interacción existente entre los compuestos fenólicos del vino y la IBMP. Los análisis químicos se realizaron a partir de una solución vínica modelo simplificada sobre la cual se adicionaron diferentes dosis de compuestos fenólicos (según lo dispuesto para cada ensayo) junto a una concentración de IBMP conocida, los cuales reaccionaron durante 30 minutos, para luego medir la variación de concentración entre el control (solución vínica sin el compuesto fenólico) y la muestra antes mencionada mediante cromatografía gaseosa acoplada a un detector de masas GC-MS. Los resultados obtenidos demuestran que existe no sólo una interacción entre los polifenoles y el compuesto aromáticos, sino que también en algunos casos, existe disminución de la concentración de la IBMP y por ende de su volatilidad. Como resultado del primer ensayo, fue posible observar que ambos compuestos tuvieron un efecto en la reducción de la concentración del compuesto aromático, siendo más efectiva en bajas dosis la acción de la (+)-catequina, mientras que en las dosis más altas, tuvo un mayor impacto la utilización de ácido gálico. Para el segundo ensayo, donde se midió el efecto de las diferentes fracciones de taninos, los resultados indican que las fracciones FII y FIII son las que tuvieron efecto sobre la disminución de la concentración de la IBMP. Si bien aún no existe una respuesta concreta a cuál es la reacción responsable de dicho efecto, la evidencia apunta a que se trataría de un efecto de retención debido a la interacción entre fenoles y el compuesto aromático; o bien, como resultado de un proceso oxidativo, derivado de la interacción de estos compuestos, la cual terminaría en la ruptura del anillo aromático y por ende la eliminación de una parte de la pirazina del medio vínico. / The quality of wine is determined by many factors, among which the aromatic fraction stands out. This fraction plays a fundamental role, because in some cases can determine consumer choice. An aromatic compound that generates controversy is the Isobutylmetoxypyrazine (IBMP), as its presence can be considered positive or negative depending on its concentration and the type of wine. In the case of red wines, it is considered a defect because of their low threshold of olfactory perception and its contribution to vegetal aromas in wine. Due to the prior, and considering, that the chemical matrix of wine, especially their phenolic compounds, may affect the volatility of compounds of the family of pyrazines, is that the following work has been developed. The study comprised two independent trials. The first assay considered the use of two phenolic compounds (gallic acid and (+)-catechin) with different polarity and different concentrations. The second trial used tannin fractions with different molecular weight (FI: Monomers, FII: Oligomers, FIII: Polymers). In both trials, the effect of phenolic compounds on the volatility of the IBMP was determined. The research was based on the interaction between the phenolic compounds of wine and IBMP. The Chemical analyzes were performed on a simplified model of wine solution with different doses of phenolic compounds as provided for each test and a known concentration of IBMP, which reacted for 30 minutes. Later, the concentration change between the control (wine solution without the phenolic compound) and the sample was analyzed by gas chromatography coupled to a mass detector GC-MS. The results demonstrate that not only there is an interaction between polyphenols and aromatic compounds, but also, that in some cases, the IBMP concentration decreased. As a result of the first assay, it was observed that both compounds had an effect in reducing the concentration of the aromatic compound. The action of (+)-catechin was more effective at low doses and the gallic acid had a greater impact at higer doses. For the second assay, the results indicate the FII and FIII tannin fractions had an effect on the decrease of the concentration of the IBMP. While there is still no concrete answer to what kind of reaction is responsible for this effect, the evidence suggests that it would be a retention effect due to an interaction between phenols and aromatic compound or due to an oxidative process (derivative interaction of these compounds) which end in the breaking of the aromatic ring and then removing a part of the pyrazine of the wine medium.

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La separación y purificación de una proteína desde una fermentación a gran escala es un elemento crítico en los procesos modernos biotecnológicos, puesto que representa el mayor costo industrial. Es por esto que numerosos estudios se enfocan en mejorar y/o disminuir las etapas de purificación, de manera de aumentar la pureza de la proteína de interés, y al mismo tiempo disminuir los costos de producción. El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico a una celulasa del tipo endoglucanasa, en su producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para este estudio se seleccionaron 4 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P), de a lo más 6 aminoácidos, para formar la secuencia del extremo que fue adicionado en el extremo carboxilo terminal de la enzima nativa, mediante la técnica Polymerase Chain Reaction (PCR). Se obtuvieron exitosamente las endoglucanasas mutadas Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3. Los cultivos productores de las endoglucanasas modificadas con los extremos hidrofóbicos se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas; luego las proteínas fueron recuperadas de la fracción extracelular para la posterior medición de actividad enzimática, proteína total y cálculo de la actividad específica. La adición de extremos hidrofóbicos no afectó la distribución de la actividad enzimática en las fracciones subcelulares, puesto que la endoglucanasa nativa y las mutadas presentaron comportamiento similar: más del 90% de actividad en el medio extracelular y en el periplasma un 6% aproximadamente. Los valores de proteína total demostraron que la endoglucanasa nativa y las mutadas tienen una igual distribución de proteínas, aproximadamente de un 87% en el medio extracelular y 8% en la fracción periplasmática. Con esto, fue posible concluir que la actividad y recuperación de la endoglucanasa no se vio afectada por la adición de los extremos hidrofóbicos. Adicionalmente, las endoglucanasas nativa y modificadas se purificaron por HIC, utilizando como matriz hidrofóbica Butil Sefarosa Fast Flow 6FF. De los cromatogramas obtenidos se midieron los tiempos de retención adimensionales (DRT), de acuerdo a la fracción en la cual eluyó cada una de las endoglucanasas. En todos los cromatogramas se observó una tendencia similar, presentándose dos peaks de actividad tanto para la endoglucanasa nativa como para las modificadas. Esto se atribuye a la presencia de proteasas en el medio que posiblemente fragmentaron a la proteína en un sitio previo al extremo hidrofóbico. Se recomienda para futuros estudios, agregar inhibidores de proteasas para evitar estos sucesos. Por otra parte, se calculó la hidrofobicidad superficial de la endoglucanasa nativa y el aporte de cada extremo polipeptídico, para esto se usó como modelo una endoglucanasa de código pdb 1TVN, que tenía un 88,4 % de identidad a nivel de aminoácidos con la enzima utilizada en este estudio. Las proteínas mutadas presentaron en los valores de DRT un aumento porcentual promedio respecto de la endoglucanasa nativa de 19,7 %, 15,0 %, 14,3 % y 10,9 % para el caso de Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3 respectivamente, los cuales se relacionan con el porcentaje de aumento de la hidrofobicidad superficial total de la proteína (φ), según la recta: DRT = 2,41φ – 19,36 con un R2 = 0,96. Finalmente, se estableció como criterio cualitativo para seleccionar el extremo que reporte mayores mejoras en el proceso de purificación, que no es necesario que el extremo hidrofóbico incluya prolina para que esta proteína extracelular mantenga su actividad. Y como criterios cuantitativos, se estableció que el extremo a adicionar debe tener una hidrofobicidad menor a 500 y que existe una relación lineal entre el aumento de DRT y el aumento de hidrofobicidad.

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Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En esta Memoria se desarrolló una metodología por HPLC, para ser empleada en el estudio de estabilidad hidrolítica del fármaco hipocolesterolémico pravastatina. Las condiciones óptimas fueron alcanzadas luego de llevar a cabo el ensayo de aptitud del sistema (system suitability test, USP XXVII), y consistieron en una fase móvil isocrática: acetonitrilo/tampón fosfato 30 mM, pH 2.0 (28/72), flujo 1 mL/min a 40 ºC. Las condiciones óptimas se seleccionaron en base a la combinación adecuada entre los valores de resolución (R), factor de capacidad (k’), selectividad (α),tiempos de retención de cada señal y el tiempo de corrida del cromatograma. En estas condiciones pravastatina exhibió un tiempo de retención (tr) promedio de 8.95 min (n=10), R= 2.1, k’= 5.5 y =1.16. La metodología exhibió características analíticas de repetibilidad (CV=0.11 %) y reproducibilidad (CV=0.49 %) adecuadas para ser empleada en estudios de estabilidad. Para la cuantificación se empleó el método de la curva de calibración, que estuvo descrita por la ecuación: ABC = 2.74×1010 [c] + 72267 (r= 0.99992; n= 7). Los límites de detección y cuantificación calculados fueron 3.4×10-7 M y 3.7×10-6 M, respectivamente. El estudio de estabilidad se realizó a cuatro concentraciones iniciales, tres temperaturas y cinco pH en tampón fosfato 30 mM, con el fin de lograr interpretar la influencia de estas variables sobre la velocidad de degradación de pravastatina. En todas las condiciones de pH y temperatura ensayadas se obtuvo una cinética mixta, en las cuales se ajustó a una cinética de seudo primer orden hasta aproximadamente el 50 % de degradación del fármaco. Para evaluar la influencia del pH en la degradación, se ensayaron los pH 3, 5, 7, 9 y 12. A pH < 7 los cromatogramas presentan cinco nuevas señales correspondientes a los productos de degradación, a tr de 10.21 min; 11.83 min; 15.91 min; 17.60 min y 19.47 min. A pH > 7 sólo se observa la aparición de una nueva señal, a tr de 1.90 min. En todos los casos estudiados, las nuevas señales presentan un espectro UV análogo al de pravastatina, lo cual indica que la hidrólisis no afecta la estructura cromófora del fármaco. Con el objeto de evaluar la influencia de la temperatura sobre la degradación de pravastatina, se llevaron a cabo experimentos a 40, 60 y 80 ºC, obteniéndose que la constante de velocidad de degradación (k) aumenta en forma concomitante con el incremento de la temperatura. Además se reportan los valores de energías de activación, vidas medias y t90 calculadas para la degradación de pravastatina. Adicionalmente se estudió la reactividad de pravastatina frente a radicales libres y peroxinitrito, como modelos predictivos de su estabilidad oxidativa tanto en preformulaciones como in vivo. Se empleó como técnica analítica la espectrofotometría UV-Visible y como generadores de radicales alquilo ABAP+ N2, radicales alquilperoxilo ABAP + O2, y ABTS (radicales ABTS+). Para evaluar la reactividad frente a peroxinitrito se empleó SIN-1. La reactividad frente a ABAP y SIN-1 se llevó a cabo siguiendo la señal del fármaco a 240 nm, empleando el método de la curva de calibración (A = 2.04×10-8 [c] + 4.55×10-9). Para ABTS+ se siguió el decaimiento de su señal a 734 nm. Pravastatina (40 M a 100 M) fue reactiva frente a todos los compuestos ensayados, encontrándose que el orden de reactividad fue: peroxilo (k=1.13×10-2 min-1)  alquilo (k=7.07×10-3 min-1) > peroxinitrito (k=2.68×10-3 min-1)  ABTS.+ (k=1.20×10-3 min-1). Además, se informa la reactividad de estos compuestos frente otros análogos estructurales de la pravastatina: los profármacos lovastatina y simvastatina, y sus análogos de cadena abierta obtenidos experimentalmente por hidrólisis alcalina exhaustiva. / In this Thesis a methodology by high HPLC was developed, with aim to be used in the stability study in front of hydrolysis of the hypocholesterolemic drug pravastatin. The optimal conditions were reached after carried out the system suitability test according to USP XXVII, which consisted of an isocratic mobile phase of 30 mM acetonitrile/phosphate buffer, pH 2.0 (28/72), flow rate of 1 mL/min at 40 ºC. The optimal conditions were selected on the basis of the combination between the values of resolution (R), capacity factor (k'), selectivity (α), the retention times of each signal and the run time of the chromatogram. In these conditions pravastatin exhibited a retention time (Rt) average of 8.955 min (n =10), R = 2.1, k' = 5.5 and α = 1.16. The methodology exhibited analytical characteristics of repeatability (CV=0.11 %) and reproducibility (CV=0.49%) adequate to be used in stability studies. For the quantification the calibration curve method was used, and was described by the equation: ABC=2.74×1010 [c] + 72267 (r =0.99992; n=7). The detection and quantification limits were 3.4×10-7 M and 3.7×10-6 M, respectively. The stability study were carried out at four initial concentrations, three temperatures and five pH in 30 mM phosphate buffer, with the aim of evaluate the influence of these variables on the pravastatin degradation. In all the tested conditions of pH and temperature a mixed kinetic was obtained, in which it adjusted to a pseudo-first order kinetic until approximately 50% of degradation of the drug. In order to evaluate the effect of pH on the degradation, pH 3, 5, 7, 9 and 12 were assayed. At pH<7, five new signals corresponding to degradation products appears in the chromatograms, with Rt of 10.21 min; 11.83 min; 15.91 min; 17.60 min and 19.47 min. At pH>7 only a new signal in the chromatograms was observed, at the same Rt of 1.90 min. In all the studied cases, the new signals display an UV spectrum similar to that of pravastatin, which indicates that the hydrolysis process does not affect the chromophore structure of the drug. With the aim to evaluate the influence of temperature on the hydrolytic degradation; experiments at 40, 60 and 80 ºC were carried out. From these experiments was obtained that the degradation rate constant (k) increases concomitantly as the temperature increase. Also, activation energies values, half lives and t90 values for the degradation of pravastatin are reported. Additionally, the reactivity of pravastatin in front of free radicals and peroxinitrite, as predictive models of its oxidative stability in both preformulations and in vivo, were studied. For this study UV/Vis spectrophotometry was used as analytical technique and ABAP + N2 as alkyl radical’s generator, ABAP + O2 as alkylperoxyl radical’s generator, and ABTS (ABTS+). The reactivity with peroxynitrite was evaluated by using SIN-1. The reactivity of pravastatin in front of ABAP and SIN-1 was assess following the spectrophotometric signal of the drug at 240nm, using the calibration curve method (A = 2.04×10-8[c] + 4.55×10-9). For ABTS+ the decay of its signal at 734 nm was used. Concentrations of pravastatin in the range of 40 μM to 100 μM were studied. The drug was reactive in front to all the compounds assayed, and the reactivity ranking was: ABAP+O2 (k=1.13×10-2 min-1) ≥ ABAP+ N2 (k=7.07×10-3 min-1) > SIN-1 (k=2.68×10-3 min-1) ≥ ABTS (k=1.2×10-3 min-1), that means: alkylperoxyl ≥ alky > peroxynitrite ≥ ABTS•+. In addition, the reactivity of these compounds in front other structural analogous of pravastatin: the prodrugs lovastatin and simvastatin, and their analogous of open chain experimentally obtained by exhaustive alkaline hydrolysis are reported.

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo y tesis para optar al grado de Magíster en Enología y Vitivinicultura / En este estudio, se evaluó la evolución de los compuestos fenólicos de vinos de los cultivares Cabernet Sauvignon y Carménère durante la crianza en barricas de roble de origen francés y americano de primer uso y tostado medio. Los análisis químicos generales (acidez total, pH, grado alcohólico, azúcares reductores, anhídrido sulfuroso y acidez volátil), espectrofotométricos (fenoles, taninos y antocianos totales, índice de gelatina, intensidad colorante, matiz y fraccionamiento de taninos) y de cromatografía líquida de alta resolución (perfil antociánico, compuestos fenólicos de bajo peso molecular y floroglucinólisis) fueron aplicados periódicamente durante 7 meses. Los resultados demostraron que el contenido total de compuestos fenólicos disminuyó hacia el final del período de crianza en ambos ensayos estudiados. Asimismo, en todos los vinos analizados se pudo observar un aumento del tirosol y una disminución de ácido trans-cafeico durante la crianza. Sin embargo, el comportamiento del resto de los compuestos no flavonoides varió en función del tipo de barrica y/o vino utilizado. Por el contrario, variaciones en el contenido de antocianinas glucosiladas, acetiladas y cumariladas resultaron en una disminución del contenido de antocianos totales en todos los vinos criados tanto en barricas de origen francés como americano. Finalmente, el contenido de flavanoles no mostró variaciones de concentración durante el estudio, salvo algunos muestreos puntuales. En relación a estos últimos compuestos, se observaron en el vino del cultivar Cabernet Sauvignon los máximos valores de grado medio de polimerización, peso molecular promedio y oligómeros entre el segundo y cuarto muestreo. Al comparar los resultados obtenidos entre vinos criados en barricas de origen americano y francés, fue posible observar en el cultivar Cabernet Sauvignon que los primeros presentaron una mayor concentración de flavonoles totales al final del estudio, mientras que los criados en barricas de origen francés mayores concentraciones de antocianinas totales y glucosiladas en la mayoría de los muestreos. Así también, se advirtió en ambos cultivares mayores concentraciones de ácido elágico durante la crianza en barrica de origen francés. / In this study, the evolution of phenolic compounds in wines from Cabernet Sauvignon and Carménère cultivars during aging in French and American oak barrels first used and medium toasted was evaluated. General chemical analyses (total acidity, pH, alcohol content, reducing sugars, sulfur dioxide and volatile acidity), spectrophotometric analyses (total phenols, tannins and anthocyanins, gelatin index, color intensity, hue and fractionation of tannins) and high performance liquid chromatography analyses (anthocyanin profile, low molecular weight phenolic compounds and mean degree of polymerization using phloroglucinol) were applied regularly for 7 months. The results showed that total phenolic content decreased towards the end of the aging period in both studied trials. Also, during aging in every analyzed wines, a tyrosol increase and a trans-caffeic acid decrease was observed. However, the behavior of the other non-flavonoid compounds varied depending on the type of barrel and/or wine used. On the other hand, glycosylated, acetylated and cumarilated anthocyanin variations resulted in a decrease of the total anthocyanin content in all wines aged in barrels of both French and American oak. Finally, the flavanol contents didn’t show concentration changes during the study, except in some specific samples. Regarding the latest compounds, in Cabernet Sauvignon cultivar wines the highest values of average degree of polymerization, mean molecular weight and oligomers were observed between the second and fourth sampling times. By comparing the results between aged wines in barrels of American and French oak in Cabernet Sauvignon cultivar, it was observed that the first had higher concentration of total flavonols at the end of the study, while those wines aged in French oak barrels presented higher concentrations of total and glycosylated anthocyanins in most samplings. Also, in both cultivars increasing concentrations of ellagic acid during aging in French oak barrels were observed.