Made available in DSpace on 2014-10-09T12:52:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:02:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:44:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06876.pdf: 5106275 bytes, checksum: 3184baff9cfe1a086e8e2657a1086604 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:43:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:09:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:43:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:09:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06632.pdf: 4097419 bytes, checksum: 1cde4c2787112f93fcca894974c568fd (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T02:53:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VillasBoas_MarianaBattaglin_M.pdf: 1570328 bytes, checksum: 8264ab45a2d69c56c77f60117495628a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O leite bovino contém várias proteínas que são consideradas antigênicas e capazes de induzir resposta imune, dentre elas, a ß-lactoglubulina (ß-Lg) é uma das mais antigênicas. A enzima transglutaminase (TG) é a única enzima utilizada comercialmente que catalisa reação de ligação cruzada inter ou intramolecular em diversas proteínas, formando polímeros de alta massa molar. Até o momento, pouco se conhece sobre a modificação dos epítopos antigênicos na estrutura das proteínas do soro de leite modificada ou polimerizada pela enzima TG. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da reação de polimerização induzida pela TG na atividade antigênica da ß-Lg. A modificação da ß-Lg com a TG foi realizada em dois experimentos: (1) a ß-Lg foi tratada termicamente (80 °C/60 min) em diferentes concentrações (3, 5 e 7%) e polimerizada com TG (5, 10, 25 e 50 U/g de proteína) e (2) a ß-Lg (3, 5 e 7%) foi polimerizada com TG 25 U/g de proteína na presença de agente redutor Cys nas concentrações 0,05, 0,1, 0,25 e 0,4 mol/L. A caracterização da ß-Lg polimerizada foi realizada por eletroforese (SDS-PAGE) e cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular (CLAE-EM). A antigenicidade da proteína foi avaliada por métodos imunoquímicos, utilizando soro de camundongos BALB/c e técnicas de Immunoblotting e ELISA. Quando a ß-Lg 3% foi tratada termicamente e polimerizada com TG, 40% da ß-Lg permaneceu nas formas monomérica e dimérica. Já as amostras tratadas com maior concentração de proteína (5% e 7%) apresentaram de 70% a 87% de material com massa molar (MM) > 100 kDa, sendo que ß-Lg 7% polimerizada com 25U TG/g foi a que apresentou maior grau de polimerização. Na presença de Cys, observou-se maior percentual de produtos com MM > 100 kDa que o obtido com o tratamento térmico. Nas amostras ß-Lg 5% e ß-Lg 7%, a presença da Cys possivelmente aumentou a susceptibilidade da ß-Lg à polimerização. As amostras selecionadas para avaliação da antigenicidade foram ß-Lg nativa, ß-Lg 7% tratada termicamente e polimerizada com 25U TG/g de proteína (ß-Lg 7% TT 25TG) e ß-Lg 7% polimerizada com 25 U/g de proteína na presença de Cys 0,25 mol/L (ß-Lg 7% 0,25Cys TG). Os resultados mostraram que os animais sensibilizados com ß-Lg polimerizada na presença de agente redutor Cys apresentaram níveis séricos de IgE e IgG menores, comparados aos grupos imunizados com ß-Lg nativa e ß-Lg tratada termicamente e polimerizada com TG, sugerindo que a polimerização na presença de agente redutor Cys pode reduzir o potencial antigênico da proteína ao modificar .e/ou ocultar regiões de epítopos na proteína / Abstract: The bovine milk contains several proteins that are considered antigenic and capable of inducing immune responses, among them ß-lactoglubulin (ß-Lg) is one of the most antigenic protein. The enzyme transglutaminase (TG) is the only enzyme commercially used that catalyzes reaction of crosslinking inter or intramolecular in several proteins, forming polymer of high molecular mass. Up to now, little is known about modification of epitopes of whey proteins by the TG. The present study examines the effect of the polymerization reaction induced by TG on the antigenic activity of ß-Lg. The ß-Lg was modified by TG in two experiments: (1) ß-Lg was heat treated (80 °C/60 min) at different concentrations (3, 5 and 7%) and modified with TG (5, 10 , 25 and 50U / g protein), and (2) ß-Lg (3, 5 and 7%) was modified with TG 25U / g of protein in the presence of reducing agent Cys ( 0.05, 0.1, 0.25, 0.4 mol/L). The characterization of the modified ß-Lg was performed by electrophoresis (SDSPAGE) and high performance liquid chromatography molecular exclusion (HPLCMS). The antigenicity of the protein was measured by Immunoblotting and ELISA, using serum from BALB/c mices. When ß-Lg 3% was heat treated and modified by TG, 40% of the ß-Lg remained as monomeric and dimeric forms. However, the samples treated at higher protein concentration (5% and 7%) showed 70% to 87% of material with molecular weigh > 100 kDa. ß-Lg 7% modified with 25U TG / g presented the greatest degree of polymerization. In the presence of Cys, higher percentage of products with MW > 100 kDa was obtained than with the previous heat treatment. The presence of Cys increased the susceptibility of ß-Lg for polymerization, especially those treated at protein 5 and 7% concentrations. The samples selected for evaluation of the antigenicity were native ß-Lg, 7% ß-Lg treated with 25U TG / g of protein (ß-Lg 7% TT 25TG) and 7% ß-Lg treated with 25U TG / g protein in the presence of Cys 0.25 mol / L (ß-Lg 7% 0.25 Cys TG). The results showed that animals sensitized with ß-Lg in the presence of reducing the agent Cys had lower levels of IgG and IgE, compared to the groups immunized with native ß-Lg and ß-Lg treated with high temperature and modified with TG, suggesting that the polymerization in the presence of reducing agent Cys can modify or hide epitopes and reduce the potential antigenic of the protein / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pilau_EduardoJorge_D.pdf: 5051807 bytes, checksum: 376ee3a4968e0ab254d7cda0cccd2819 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A espectrometria de massas (MS) consiste no estudo dos íons em fase gasosa, tendo como uma das suas principais aplicações a caracterização estrutural de moléculas. Desde o início da técnica, ela vem sendo empregada na elucidação estrutural de um grande número de moléculas orgânicas e é hoje uma das principais ferramentas de caracterização estrutural. Dentro os métodos baseado em MS para o estudo de estruturas superiores de proteínas desenvolvidos recentemente estão aqueles conhecidos como footprinting e ligação cruzada (cross-linking). Nesta tese, estudos foram realizados para o desenvolvimento, melhorias e otimização de técnicas de footprinting e ligação cruzada acopladas à espectrometria de massas para o estudo estrutural de proteínas. Em footprinting, foram desenvolvidas fontes alternativas de radiação UV para geração de radicais ¿OH a partir da fotólise do H2O2 para mapeamento da superfície exposta ao solvente de proteínas, bem como o desenvolvimento de uma técnica mais apropriada de quantificação de peptídeos oxidados. Os resultados obtidos demonstraram que as fontes propostas apresentaram boa eficiência no processo de fotólise do H2O2 Na técnica de ligação cruzada, foram realizados estudos fundamentais a respeito da reatividade dos Agentes de Ligação Cruzadas (ALC¿s) tanto com relação à especificidade dos ALC¿s frente às cadeias laterais dos aminoácidos quanto à cinética da reação com proteínas e reação competitiva de hidrólise. Nos experimentos realizados foi possível verificar a reatividade do ALC frente a diferentes grupos nucleofilicos presentes nas cadeias laterais dos resíduois de aminoacido bem como ser suscetivel a mudança de reatividade em virtude do pH utilizado. / Abstract: Mass spectrometry (MS) study ions in the gas phase, and one of its main applications is the structural characterization of molecules. Since the beginning of the technique, it has been used in structural study of a large number of organic molecules and is now a major tool for structural characterization. Among the MSbased methods for the study of higher structures of proteins are the newly developed methods of footprinting and cross-linking. In this thesis, studies were undertaken for the development, improvement and optimization of, footprinting and cross-linking coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins. In footprinting, we developed alternative sources of UV radiation to generate ¿OH radicals from the photolysis of H2O2 to map the solvent exposed surface of proteins as well as the development of a more appropriated technique for quantification of oxidized peptides. The results showed that the proposed sources showed good efficiency in the process of photolysis of H2O2. For cross-linking, fundamental studies were carried out concerning the reactivity of the cross-linkers regarding both the specificity of ALC in respect to amino acid side chains and the kinetics of reaction with proteins as well as hydrolysis reaction. In the experiments it was possible to verify the reactivity of ALC against different nucleophilic groups present in side chains of amino acid residues as well as being susceptible to change in reactivity due to the pH used. / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T09:14:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_LuizFernandoArruda_D.pdf: 7340905 bytes, checksum: 51f81b49c01047e52881271fa910fada (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A função de uma proteína está diretamente relacionada com sua estrutura e conhecendo a estrutura de uma proteína é possível verificar onde estão localizados e como agem seus sítios ativos e de interação. Dentre os métodos empregados para análise estrutural de proteínas por espectrometria de massas (MS), experimentos de ligação cruzada vêm recebendo grande destaque. Nestes experimentos, após digestão enzimática três tipos de peptídeos contendo agentes de ligação cruzada (ALCs) podem ser formados: espécies intramoleculares, quando o ALC está ligado entre dois resíduos do mesmo peptídeo; espécies intermoleculares, quando o ALC une dois peptídeos distintos e dead-end, quando o ALC liga-se apenas a um resíduo, sendo que o outro lado de sua cadeia normalmente sofre hidrólise. A etapa crucial em experimento de ligação cruzada consiste na correta atribuição e identificação dos peptídeos modificados por ALC, etapa que pode ser facilitada conhecendo a fragmentação destes peptídeos. Desse modo, o foco principal deste trabalho foi realizar experimentos de fragmentação das diferentes espécies de peptídeos modificados por ALCs utilizando metodologias baseadas na técnica de espectrometria de massas, como dissociação induzida por colisão (CID), dissociação multifotônica por infravermelho (IRMPD) e dissociação por captura de elétrons (ECD). Os estudos realizados proporcionaram a visualização de um padrão de fragmentação de espécies inter e intramoleculares, bem como a presença de íons diagnósticos, capazes de auxiliar na identificação de peptídeos modificados por ACLs. Além disso, a técnica de mobilidade iônica, que consiste na separação de íons baseado em suas seções de choque, acoplada à espectrometria de massas (IMMS), foi emprega para realizar estudos para caracterização de peptídeos modificados por ALCs. Utilizando IMMS foi possível realizar a separação de espécies isoméricas do tipo dead-end, bem como verificar que peptídeos lineares e modificados por ALC, com m/z próximos possuem seções de choque semelhantes / Abstract: There are several advantages associated with the use of mass spectrometry (MS) applied to structural studies of proteins, such as unlimited mass of target protein or protein complex, very low time and sample consumption, ease of manipulation and interpretation of the data obtained. In chemical cross-linking coupled to MS, bifunctional reagents (cross-linkers, XL) are used to generate covalent bonds between the side chains of specific residues (usually lysine) and the distance constraints obtained are then used to model the structure of the protein and reveal interacting regions in the case of protein complexes. After enzymatic digestion, three types of peptides modified by the XL can be generated: intramolecular cross-linked, in which the cross-linker is linked to two residues of the same peptide; intermolecular cross-linked, when the reagent connects two peptides; and ¿dead-end¿, that occurs when the cross-linker is bound to only one residue and the other side is usually hydrolyzed. The critical step in a cross-linking experiment is the correct attribution and identification of the modified peptides, which is in turn based on the fragmentation of such species. So, the main focus of this work is to perform fragmentation studies of cross-linked peptides and rationalize fragmentation models to aid in the correct identification and attribution of modified peptides. In our studies we verified a fragmentation pattern of modified peptides, as well as diagnostic fragment ions, able to help in the identification of cross-linked peptides. Studies of ion mobility (IMS) coupled to mass spectrometry (IMMS) to analyze cross-linked peptides were also performed. It was possible to separate dead-end isomers and it was verified that linear and modified peptides, of similar m/z have similar collision cross-section / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 10448.pdf: 3069198 bytes, checksum: 9d44970985c5146c199d7cc5f998e71e (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:52:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:02:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Os plásticos biodegradáveis e os plásticos \"verdes\" são uma nova tendência mundial. Neste trabalho foi estudado o efeito da radiação por feixe de elétrons mediante a resistência à tração e alongamento na ruptura, Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Espectroscopia Vibracional de Absorção no Infravermelho por Transformada de Fourrier (FT-IR), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), grau de reticulação e biodegradabilidade de filmes produzidos com copoliéster alifático aromático e sua blenda com amido de milho (Ecoflex® e Ecobras®). Foram realizadas medidas em ambas as direções de orientação molecular (direção da máquina e direção transversal) para os testes mecânicos. Observou-se que a radiação causou um aumento na resistência à tração na ruptura dos filmes da blenda com amido de milho quando doses de 10kGy e 40kGy foram aplicadas. Uma diminuição significativa do alongamento na ruptura dos filmes produzidos com a blenda de amido de milho foi observada em doses de 10kGy e 40kGy. Não foram encontradas mudanças importantes nas propriedades de tensão dos filmes de copoliéster alifático aromático. Não foram observadas alterações estruturais visíveis das amostras (reticulação ou degradação) por meio de microscopia eletrônica de varredura. O FT-IR identificou os picos característicos de cada grupo funcional envolvido, em particular, copoliéster e amido de milho, contudo, não foram encontradas bandas de oxidação das amostras. No ensaio de DSC, não foram identificadas mudanças na temperatura de fusão das amostras irradiadas de Ecoflex® e Ecobras® quando comparadas às amostras de referência, entretanto, foi verificada uma diminuição na entalpia de fusão das amostras de Ecobras® após irradiação. O material Ecobras® apresentou reticulação quando submetido às doses de 10kGy e 40kGy. O material Ecoflex® não apresentou reticulação quando submetido a estas doses. A biodegradabilidade dos materiais foi avaliada partindo de dois métodos de 6 ensaio: solo simulado e enzimático. Em ambos os métodos, as amostras irradiadas apresentaram biodegradação mais rápida do que as de referência não irradiadas. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:44:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06876.pdf: 5106275 bytes, checksum: 3184baff9cfe1a086e8e2657a1086604 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP