Orientador: Mário Tanomaru Filho / Abstract: Tricalcium silicate cements associated with radiopacifiers are used as repair materials. Publication 1: Evaluation of tricalcium silicate-based cements (TCS) associated with zirconium oxide (ZrO2), calcium tungstate (CaWO4) or niobium oxide (Nb2O5) radiopacifiers compared to MTA Repair HP (MTA HP). Publication 2: Evaluation of tricalcium silicate-based cements (TCS) associated with zirconium oxide (ZrO2) radiopacifier with 10% or 20% of Biosilicate (TCS ZrO2 + 10% Biosilicate and TCS ZrO2 + 20% Biosilicate) compared to Biodentine. Setting Time (ST) and radiopacity were evaluated based on ISO 6876/2002 standard. Solubility was evaluated according to the method proposed by Carvalho-Júnior et al. (2007) modified. pH was measured at 3, 12 and 24 hours and 7, 14 and 21 days after immersion in distilled water. Cellular cytotoxicity and bioactivity were evaluated by methyltetrazolium (MTT), neutral red (NR), alkaline phosphatase (ALP), alizarin red (ARS) and real time PCR (qPCR) (Publication 1) assays in different periods of contact with eluates of the materials in Saos-2 cells. Antibacterial activity was evaluated by direct contact on Enterococcus faecalis in the planktonic form. For the physico-chemical and ARS tests, the data were submitted to ANOVA and Tukey tests; for MTT, NR and ALP tests the data were analyzed by the Two-Way ANOVA and Bonferroni tests; the antibacterial activity, were submitted to Kruskall-Wallis and Dunn tests (α = 0.05). Publication 1: TCS + CaWO4 presented... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Cimentos de silicato tricálcico com radiopacificadores são utilizados como materiais reparadores. Publicação 1: Avaliação de cimento à base de silicato tricálcico (STC) associado aos radiopacificadores óxido de zircônio (ZrO2), tungstato de cálcio (CaWO4) ou óxido de nióbio (Nb2O5) em comparação ao MTA Repair HP (MTA HP). Publicação 2: Avaliação de material à base de silicato tricálcico (STC) e radiopacificador óxido de zircônio (ZrO2) e 10% ou 20% de Biosilicato (STC ZrO2 + 10% de Biosilicato e STC ZrO2 + 20% de Biosilicato) em comparação ao Biodentine. Tempo de presa e a radiopacidade foram avaliados seguindo ISO 6876/2002. A solubilidade foi avaliada de acordo com o método proposto por Carvalho-Júnior et al. (2007) modificado. pH foi avaliado 3, 12 e 24 horas, 7, 14 e 21 dias após imersão em água destilada. A citotoxidade e bioatividade celular foram avaliadas pelos testes metiltetrazólio (MTT), vermelho neutro (VN), atividade de fosfatase alcalina (ALP), ensaio de vermelho de alizarina (ARS) e PCR em tempo real (qPCR) (Publicação1), em diferentes períodos de contato com eluídos dos materiais em células Saos-2. Atividade antimicrobiana dos materiais foi avaliada por meio do teste de contato direto com Enterococcus faecalis na forma planctônica. Para os testes físicoquímicos e ARS, os dados foram submetidos aos testes ANOVA e Tukey; para os ensaios do MTT, VN e ALP e qPCR os dados foram analisados aos testes Two Way ANOVA e Bonferroni; os dados da atividade antimicrobiana f... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Andreia Bufalino / Resumo: O carcinoma espinocelular (CEC) representa mais de 95% de todas as neoplasias malignas que acometem a cavidade oral e muitas vezes estes tumores são precedidos por alterações clínicas que apresentam um evidente potencial de transformação maligna, as quais são chamadas de desordens potencialmente malignas orais (DPMOs). Dentre estas, a leucoplasia oral (LO) possui taxa de transformação maligna que varia de 0,2% até 17,5%; contudo, uma outra DPMO conhecida como leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP) apresenta um comportamento persistente e progressivo para malignidade, com taxa de transformação maligna maior que 70%. Diferente da LO, fator de risco como tabaco, álcool e noz de areca não parecem estar associados com o desenvolvimento da LVP. Adicionalmente, a LVP frequentemente apresenta resposta inadequada a todas as modalidades de tratamento, sofre rápida disseminação pelos sítios orais e muitas vezes demonstra recorrência. Estudos recentes sugerem que o infiltrado inflamatório associado às lesões leucoplásicas de paciente com LVP pode estar relacionado a etiologia e/ou comportamento clínico agressivo desta DPMO. Assim, foi realizada uma análise comparativa entre amostras de LO e LVP que consistiu em: (1) avaliar a porcentagem e identificar os subtipos de linfócitos T auxiliares e estado de ativação de linfócitos T citotóxicos, (2) avaliar a densidade e estado de ativação das células dendríticas, e (3) determinar o efeito de produtos solúveis de células displásicas na modul... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

No / BACKGROUND: Alopecia causes widespread psychological distress, but is relatively poorly controlled. The development of new treatments is hampered by the lack of suitable human hair follicle models. Although intermediate and vellus hair follicles are the main clinical targets for pharmacological therapy, terminal hair follicles are more frequently studied as smaller hair follicles are more difficult to obtain. OBJECTIVES: This investigation was designed to quantify in vivo morphological and in vitro behavioural differences in organ culture between matched intermediate and terminal hair follicles, in order to develop a new clinically relevant model system. METHODS: Microdissected terminal and intermediate hair follicles, from the same individuals, were analysed morphometrically (250 follicles; five individuals), or observed and measured over 9 days of organ culture (210 follicles; six individuals). RESULTS: Intermediate hair follicles were less pigmented and smaller, penetrating less below the skin surface (mean +/- SEM) (2.59 +/- 0.07 vs. 3.52 +/- 0.10 mm; P = 0.02), with smaller fibre (0.03 +/- 0.002 vs. 0.07 +/- 0.002 mm), connective tissue sheath (0.24 +/- 0.01 mm vs. 0.33 +/- 0.01 mm), bulb (0.19 +/- 0.01 vs. 0.31 +/- 0.01 mm) and dermal papilla (0.06 +/- 0.002 vs. 0.12 +/- 0.01 mm) diameters (P < 0.001). Intermediate hair follicle bulbs appeared 'tubular', unlike their 'bulbous' terminal follicle counterparts. In organ culture they also grew more slowly (0.044 +/- 0.002 vs. 0.067 +/- 0.003 mm per day; P < 0.001), remained in anagen longer (84 +/- 0.03% vs. 74 +/- 0.03% at day 9; P = 0.012) and produced less hair fibre (0.36 +/- 0.02 vs. 0.50 +/- 0.03 mm; P < 0.001) than terminal follicles. CONCLUSIONS: Smaller intermediate hair follicles showed major morphological differences from terminal follicles in vivo and retained significant, biologically relevant differences in vitro in organ culture. Therefore, intermediate hair follicles offer a novel, exciting, more clinically relevant, albeit technically difficult, model for future investigations into hair growth. This should be particularly important for developing new therapies.

O efeito de fármacos pode ser potencializado através do desenvolvimento de novos sistemas de liberação como os sistemas mucoadesivos. Estes sistemas permanecem em contato íntimo com o tecido de absorção, às mucosas, liberando o fármaco no local de ação, com o consequente aumento da biodisponibilidade, podendo promover efeitos locais e sistêmicos. Através do desenvolvimento da bandagem bucal antimicrobiana e testadas sua eficiência sobre a cultura de algumas bactérias bucais (S. mutans e C. albicans) se fez necessário continuar os estudos desse material. O objetivo deste trabalho foi analisar as propriedades bioquímicas e funcionais da bandagem bucal antimicrobiana no que tange a: degradação no meio salivar; adequação da composição para a melhoria da aderência à mucosa bucal; desempenho quanto à liberação controlada de fármacos; absorção de água, perda de massa; medida do pH do líquido residual em diferentes períodos de tempo; citotoxicidade da bandagem em cultura de fibroblastos. As bandagens avaliadas tinham diferentes composições quitosana, quitosana com glicerol, quitosana e alginato com/sem glicerol, e todas com/sem fármaco. Através das análises realizadas foi possível observar que as bandagens que absorveram mais água em tampão foi a membrana híbrida (203%) e em saliva foi a híbrida com glicerol (30%). A membrana que perdeu mais massa em tampão e em saliva foi a híbrida com glicerol (40% e 30%), isso quer dizer que elas se decompõe e liberam suas propriedades no meio. A liberação controlada do fármaco pode avaliar que a membrana híbrida liberou de forma crescente o fármaco (0,075%), facilitando sua liberação. No teste de citotoxicidade todas as bandagens com fármaco foram citotóxicas, já as bandagens de quitosana e quitosana com glicerol promoveram o crescimento celular. / The effect of drugs may be enhanced through the development of new delivery systems as mucoadhesive systems. These systems remain in intimate contact with the tissue absorption, in this case the mucosa, releasing the drug at the site of action, with the consequent increase in bioavailability and may promote local and systemic effects. Mucoadhesion is currently explained by six theories: electronics, adsorption, wetting, diffusion, fracture and mechanics (Carvalho et al., 2010). In 2011, Kloster et al. developed an oral bandage and tested antimicrobial efficiency in the culture of some oral bacteria (S. mutans e C. albicans), the results were promising. The aim of this study was to analyze the biochemical and functional properties of oral antimicrobial bandage with respect to: the salivary environment degradation; the composition adjustment for improving the adherence to the buccal mucous membrane; the performance as to the controlled releasing of drugs; water absorption while analyzing the mass loss; pH measurements of the residual liquid in different periods of time; the plaster cytotoxicity in cell and fibroblast culture. Through the analyzes it was observed that the bandages absorb water and lose mass, it means that they decompose and release their property in the middle. The bandages with drug in viability analysis were cytotoxic cell and different concentrations of drug should be study.

Orientador: Janaína Habib Jorge / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do envelhecimento de materiais comumente usados como pilares de próteses implanto-suportadas (abutments) sobre suas características físicas de superfície (rugosidade, energia livre de superfície e molhabilidade) e propriedades biológicas (metabolismo de fibroblastos orais e formação de biofilme fúngico). Para isso, discos (N=62) com rugosidade inferior a 0,2 µm foram confeccionados em zircônia (ZrO2) do tipo Y-TZP (yttriumstabilized tetragonal zirconia polycrystalline) e em titânio (Ti) comercialmente puro, e foram submetidos a um processo de envelhecimento simulado em autoclave a 134ᵒC (pressão de 2 bar) por 20 horas. ZrO2 e Ti envelhecidos foram comparados aos seus homólogos não envelhecidos. Os materiais também foram comparados entre si, nas condições envelhecida e não envelhecida. Para os testes biológicos, os grupos também foram comparados a um controle positivo de poliestireno. Todos os testes, exceto o de rugosidade, foram realizados após a formação de película salivar sobre os discos. Os testes biológicos utilizados foram de Alamar Blue (n=9) para avaliar o metabolismo de fibroblastos da gengiva humana (FGH) e de contagem de colônias viáveis (n=9) para verificar a formação de biofilme de uma cepa padrão de Candida albicans (ATCC90028) sobre os materiais. Além disso, microscopia eletrônica de varredura (MEV) (n=2) foi realizada para avaliação da morfologia dos fibroblastos e dos microrganismos. Para a análise estatística, fo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effect of aging of commonly used abutments on their surface physical characteristics (roughness, surface free energy and wettability) and biological properties (oral fibroblasts metabolism and formation of fungal biofilm). For this purpose, discs (N=62) with roughness less than 0.2 μm were made in yttrium-stabilized tetragonal zirconia polycrystalline (Y-TZP) zirconia (ZrO2) and in commercially pure titanium (Ti), and underwent a simulated aging process in autoclave at 134 °C (pressure of 2 bar) for 20 hours. ZrO2 and Ti were compared to their unaged counterparts. The materials were also compared to each other in the aged and unaged conditions. For the biological tests, the groups were also compared to a positive control of polystyrene. All tests, except roughness, were performed after the formation of salivary film on the discs. The biological tests used were Alamar Blue (n=9) to evaluate the metabolism of human gingival fibroblasts (HGF) and colony counting test (n=9) to verify the biofilm formation of a reference strain of Candida albicans (ATCC90028) on the materials. In addition, scanning electron microscopy (SEM) (n=2) was performed to evaluate the morphology of fibroblasts and microorganisms. For statistical analysis, the t-test for paired samples was used for roughness, t-test for independent samples was used for surface free energy, wettability and fibroblasts metabolism, and one-way ANOVA with Welch correction and Games-Howe... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A eficácia de protetores solares é determinada por métodos in vivo, que utilizam humanos, tais como: Fator de Proteção Solar (FPS), Immediate Pigment Darkening (IPD), Persistent Pigment Darkening (PPD) e Fator de Proteção UVA (FP-UVA). No entanto, esses parâmetros não refletem os efeitos danosos reais induzidos pela radiação solar sobre as estruturas e componentes celulares, como o DNA, lipídeos e proteínas. O objetivo deste estudo foi desenvolver ensaios in vitro com culturas de células para avaliar o potencial fotoprotetor de protetores solares empregando parâmetros biológicos que são alterados pela radiação UV. A primeira etapa deste estudo consistiu em selecionar a linhagem de células da pele (L929 ou HaCaT) que fornecesse a melhor relação entre dose de UVA ou UVB e o efeito danoso induzido. Este efeito foi quantificado pela medida da viabilidade celular, peroxidação lipídica e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). O melhor modelo de cultura celular foi tratado com protetores solares de duas marcas diferentes com FPSs de 15 a 60, obtidos no mercado local. Amostras dos fotoprotetores foram aplicadas em uma placa de quartzo colocada no topo de uma microplaca preenchida por células. A viabilidade celular e a peroxidação lipídica, medidas em fibroblastos L929, foram os parâmetros mais promissores para avaliar a eficácia de protetores solares expostos à UVB e permitiram discriminar o potencial fotoprotetor de formulações com diferentes FPSs. Por outro lado, a formação de EROs, expressa em queratinócitos HaCaT, provou ser um parametro biológico promissor para discriminar a eficácia de protetores solares com diferentes FPSs ou FPSs/PPDs, expostos à UVA. Atualmente, as empresas estão adicionando aos protetores solares filtros orgânicos que absorvem na região do UVA, principalmente na faixa do UVA-1. Alguns pesquisadores têm demonstrado que o proteoma é o alvo para as EROs induzidas por UVA. Essas EROs diminuem a atividade da calcineurina (Cn), enzima conhecida pelo seu papel no recrutamento de células T. A liberação do ânion fosfato do substrato, pela ação da enzima, reduz com o aumento da exposição da Cn à radiação UVA-1. Desta forma, um método foi desenvolvido com células primárias HDFn para a avaliação da eficácia fotoprotetora de protetores solares na faixa de UVA-1, empregando a medida da atividade da Cn. Os resultados mostraram que a redução da atividade da Cn só foi proporcional a dose de UVA-1 quando o homogeneizado de células HDFn, contendo 417,55 ± 8,79 ?g/mL de proteínas, foi exposto a diferentes doses de UVA-1. Quando as culturas de células foram irradiadas por diferentes doses de UVA-1, não foi observado diminuição da atividade da enzima. Em adição, para maior precisão na medida da atividade enzimática, os homogeneizados, expostos ou não à luz UVA-1 e protegidos ou não por diferentes protetores solares, tiveram que ser diluídos na proporção de 1:2 em tampão ensaio 2x (1:1, v/v), antes da quantificação do fosfato por verde de malaquita. A medida da atividade da Cn mostrou ser um ensaio eficiente para diferenciar fotoprotetores adicionados de filtros orgânicos específicos para faixa de UVA-1 (marca B) daqueles não adicionados desses filtros (marca A). Como também, o ensaio foi capaz de diferenciar os protetores solares da marca B, com diferentes valores de PPD: fotoprotetor com PPD-15 não foi capaz de evitar a redução da atividade enzimática, semelhante ao homogeneizado exposto à luz UVA-1 sem proteção, mas diferenciou dos demais PPDs; PPDs 25 e 41 protegeram a atividade da Cn em 34,53 ± 4,15% e 38,19 ± 5,50%, respectivamente. Assim, os parâmetros biológicos testados neste estudo podem atuar como alternativas complementares para avaliação da eficácia de fotoprotetores. / The effectiveness of sunscreens is usually determined by in vivo methods, which use humans, such as Sun Protection Factor (SPF), Immediate Pigment Darkening (IPD), Persistent Pigment Darkening (PPD) and UVA Protection Factor (UVA-PF). However, these parameters do not reflect the real damaging effects induced by solar radiation on the structures and cellular components as the DNA, lipids and proteins. The aim of this study was to develop in vitro methods with cell culture to assess the photoprotective potential of sunscreens using biological parameters that are changed by UV radiation. The first stage of this study to select the skin cells strain (L929 or HaCaT) that would provide the best relationship between dose of UVA or UVB radiation and induced deleterious effect. This effect was quantified by measuring cell viability, lipid peroxidation and generation of reactive oxygen species (ROS). The best cell culture model was treated with commercial sunscreens two brands with SPF 15- 60, obtained from a local market. Sunscreens samples were applied in a quartz plate placed on top of a microplate filled with cells. The cell viability and lipid peroxidation measured in L929 fibroblasts were the most promising for evaluating the efficacy of sunscreens exposed to UVB radiation and allowed to discriminate the photoprotective potential of formulations with different SPFs. On the other hand, ROS generation expressed in keratinocyte of the HaCaT proved to be a promising biological test for discriminating the effectiveness of sunscreens with different SPFs or SPFs/PPDs exposed to UVA radiation. Currently, companies are adding organic filters in sunscreens that absorb in the UVA region, especially in the UVA-1 range. Some researchers have shown that proteomics is the target for ROS induced by UVA. These ROS decrease the activity of calcineurin (Cn), an enzyme known for its role in T cell recruitment. The release of phosphate anion from substrate by enzyme action, it reduces with increasing exposure of Cn to UVA-1 radiation. Thus, a method was developed with HDFn primary cells for evaluation of photoprotective efficacy of sunscreens in the UVA-1 range, using the measure of Cn activity. The results showed that the reduction of Cn activity was only proportional to the dose of UVA-1 when the HDFn cell homogenate, containing 417.55 ± 8.79 mg/mL protein, was exposed to different doses of UVA-1. When cell cultures were irradiated with different doses of UVA-1, there was no reduction in enzyme activity. In addition, for greater precision in the measurement of enzymatic activity, the homogenates, exposed or not to UVA-1 radiation and protected or not with different sunscreens, they had to be diluted at a ratio of 1:2 in buffer before of phosphate quantification for malachite green. The measure of Cn activity proved to be an efficient test to differentiate photoprotectors added specific organic filters for UVA range (brand B) of those not added these filters (brand A). As well, the assay was able to differentiate the sunscreens of brand B, but with different values of PPD: photoprotector with PPD-15 was not able to prevent the reduction of enzyme activity, similar to the homogenate exposed to UVA light without protection, but differentiated from other PPDs; PPDs 25 and 41 protected the activity of Cn to 34.53 ± 4.15% and 38.19 ± 5.50%, respectively. Thus, the biological parameters tested in this study can serve as additional alternatives for assessing the effectiveness of sunscreens.

Pacientes imunocomprometidos estão vulneráveis a infecções oportunistas. O gênero Fusarium é um fungo que causa infecções importantes especialmente em pacientes com neutropenia grave. O ambiente pode ser a fonte de Fusarium, em especial a água. A detecção de Fusarium na água é realizada normalmente pela cultura que é difícil e demorada, mas necessária para a prevenção da exposição de pacientes susceptíveis. Um método mais rápido é necessário. O objetivo do estudo foi desenvolver uma técnica molecular para a detecção de Fusarium direta em água. Um método de extração de DNA direto a partir da água foi desenvolvido para 3 espécies de Fusarium (moniliforme, oxysporum e solani). O método de extração desenvolvido foi reprodutível e acoplado a uma reação de polimerase em cadeia gênero-específica para a detecção do Fusarium em água. Os limites de detecção foram 10 células/litro e 1 célula/litro para os métodos molecular e cultura, respectivamente / Immunosuppressed patients are vulnerable to opportunistic infections. The genus Fusarium is a fungus that causes severe infections especially in patients with prolonged neutropenia. The environment may be a source of Fusarium, in particular, water. The detection of Fusarium in water is carried out by culturing which is difficult because it is time consuming, but is necessary to prevent exposure of susceptible patients. A faster method is necessary. The objective of this study was to develop a molecular technique for direct detection of Fusarium in water. A direct DNA extraction method from water was developed for 3 species of Fusarium (moniliforme, oxysporum and solani). We developed a reproducible efficient extraction method and coupled it to a genus-specific PCR in order to detect Fusarium in water. The detection limits were 10 cells/L and 1 cell/L for the molecular and cultures method, respectively

Orientador: Janaina Habib Jorge / Resumo: A desinfecção química associada ao método mecânico tem sido recomendada para a higienização de próteses removíveis parciais ou totais. Levando-se em consideração as desvantagens dos agentes químicos de limpeza utilizados para a desinfecção ou redução do biofilme das próteses, como o manchamento, branqueamento e corrosão das partes metálicas, novos estudos são necessários. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades biológicas, físicas e mecânicas de uma resina acrílica para base de próteses após imersão em sabonetes líquidos desinfetantes, nas suas concentrações inibitórias minímas (CIM) para Candida albicans, após diferentes períodos de tempo. Primeiramente, a CIM de cada sabonete foi determinada. Amostras de resina acrílica (Vipi Wave®) foram confeccionadas e divididas em grupos para avaliação da capacidade de formação de biofilme (n=6), citotoxicidade (n=9), rugosidade (n=15), dureza (n=15) e alteração de cor (n=15), após imersão por 0, 7, 14, 21 e 28 dias, nas seguintes soluções: AD: imersão em água destilada a 37°C (grupo controle); SD: ciclos de imersão diária em sabonete Dettol®® a 0,39%, por 8 horas a temperatura ambiente, seguido de imersão em água destilada por 16 horas a 37°C, simulando a desinfecção noturna das próteses; SP: ciclos de imersão diária em sabonete Protex® a 3,12%, conforme descrito para o grupo anterior. SL: ciclos de imersão diária em sabonete Lifebuoy® a 0,78%, conforme descrito para o grupo SD. Além disso, a redução do biofilme de C... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Chemical disinfection associated with the mechanical method has been recommended for the cleaning of partial or full dentures. Taking into consideration the drawbacks of the cleaning chemicals used for disinfection or reduction of biofilm of prostheses, such as staining, bleaching and corrosion of metal parts, further studies are needed. The objective of this study was to evaluate the biological, physical and mechanical properties of an acrylic resin for denture base (Vipi Wave®) after immersion in liquid disinfectant soaps in their minimum inhibitory concentrations (MIC) for Candida albicans, after different periods of time. Samples of acrylic resin (Vipi Wave®) were made. Samples from acrylic resin (Vipi Wave®) were made and shared in groups for the assessment of the biofilm formation capacity (n=6), cytotoxicity (n=9), roughness (n=15), hardness (n=15) and color change (n=15) after immersion in the following solutions for 0, 7, 14, 21 and 28 days: AD: immersion in distilled water at 37 ° C (control group); SD: daily immersion cycles in soap Dettol® 0.39% for 8 hours at room temperature, followed by soaking in distilled water for 16 hours at 37 ° C, simulating the night disinfection of prostheses; SP: daily immersion cycles in soap Protex® to 3.12%, as described for the previous group. SL: daily immersion cycles in Lifebuoy® in soap to 0.78%, as described for the SD group. In soap Dettol® was found the MIC of 0.39% of the soap concentration; in Protex® 3.12% and in Lifebuoy® the MIC was 0.78%. In addition, capacity of reduction of the biofilm of Candida albicans formed on the surface of samples (n = 9) immersed for 8 hours (overnight) in the solutions was also evaluated. To know the biofilm-forming capacity, there were the forming unit count tests of colonies and alamarBlue® ...(Complete abstract electronic access below) / Mestre

Pacientes imunocomprometidos estão vulneráveis a infecções oportunistas. O gênero Fusarium é um fungo que causa infecções importantes especialmente em pacientes com neutropenia grave. O ambiente pode ser a fonte de Fusarium, em especial a água. A detecção de Fusarium na água é realizada normalmente pela cultura que é difícil e demorada, mas necessária para a prevenção da exposição de pacientes susceptíveis. Um método mais rápido é necessário. O objetivo do estudo foi desenvolver uma técnica molecular para a detecção de Fusarium direta em água. Um método de extração de DNA direto a partir da água foi desenvolvido para 3 espécies de Fusarium (moniliforme, oxysporum e solani). O método de extração desenvolvido foi reprodutível e acoplado a uma reação de polimerase em cadeia gênero-específica para a detecção do Fusarium em água. Os limites de detecção foram 10 células/litro e 1 célula/litro para os métodos molecular e cultura, respectivamente / Immunosuppressed patients are vulnerable to opportunistic infections. The genus Fusarium is a fungus that causes severe infections especially in patients with prolonged neutropenia. The environment may be a source of Fusarium, in particular, water. The detection of Fusarium in water is carried out by culturing which is difficult because it is time consuming, but is necessary to prevent exposure of susceptible patients. A faster method is necessary. The objective of this study was to develop a molecular technique for direct detection of Fusarium in water. A direct DNA extraction method from water was developed for 3 species of Fusarium (moniliforme, oxysporum and solani). We developed a reproducible efficient extraction method and coupled it to a genus-specific PCR in order to detect Fusarium in water. The detection limits were 10 cells/L and 1 cell/L for the molecular and cultures method, respectively

A eficácia de protetores solares é determinada por métodos in vivo, que utilizam humanos, tais como: Fator de Proteção Solar (FPS), Immediate Pigment Darkening (IPD), Persistent Pigment Darkening (PPD) e Fator de Proteção UVA (FP-UVA). No entanto, esses parâmetros não refletem os efeitos danosos reais induzidos pela radiação solar sobre as estruturas e componentes celulares, como o DNA, lipídeos e proteínas. O objetivo deste estudo foi desenvolver ensaios in vitro com culturas de células para avaliar o potencial fotoprotetor de protetores solares empregando parâmetros biológicos que são alterados pela radiação UV. A primeira etapa deste estudo consistiu em selecionar a linhagem de células da pele (L929 ou HaCaT) que fornecesse a melhor relação entre dose de UVA ou UVB e o efeito danoso induzido. Este efeito foi quantificado pela medida da viabilidade celular, peroxidação lipídica e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). O melhor modelo de cultura celular foi tratado com protetores solares de duas marcas diferentes com FPSs de 15 a 60, obtidos no mercado local. Amostras dos fotoprotetores foram aplicadas em uma placa de quartzo colocada no topo de uma microplaca preenchida por células. A viabilidade celular e a peroxidação lipídica, medidas em fibroblastos L929, foram os parâmetros mais promissores para avaliar a eficácia de protetores solares expostos à UVB e permitiram discriminar o potencial fotoprotetor de formulações com diferentes FPSs. Por outro lado, a formação de EROs, expressa em queratinócitos HaCaT, provou ser um parametro biológico promissor para discriminar a eficácia de protetores solares com diferentes FPSs ou FPSs/PPDs, expostos à UVA. Atualmente, as empresas estão adicionando aos protetores solares filtros orgânicos que absorvem na região do UVA, principalmente na faixa do UVA-1. Alguns pesquisadores têm demonstrado que o proteoma é o alvo para as EROs induzidas por UVA. Essas EROs diminuem a atividade da calcineurina (Cn), enzima conhecida pelo seu papel no recrutamento de células T. A liberação do ânion fosfato do substrato, pela ação da enzima, reduz com o aumento da exposição da Cn à radiação UVA-1. Desta forma, um método foi desenvolvido com células primárias HDFn para a avaliação da eficácia fotoprotetora de protetores solares na faixa de UVA-1, empregando a medida da atividade da Cn. Os resultados mostraram que a redução da atividade da Cn só foi proporcional a dose de UVA-1 quando o homogeneizado de células HDFn, contendo 417,55 ± 8,79 ?g/mL de proteínas, foi exposto a diferentes doses de UVA-1. Quando as culturas de células foram irradiadas por diferentes doses de UVA-1, não foi observado diminuição da atividade da enzima. Em adição, para maior precisão na medida da atividade enzimática, os homogeneizados, expostos ou não à luz UVA-1 e protegidos ou não por diferentes protetores solares, tiveram que ser diluídos na proporção de 1:2 em tampão ensaio 2x (1:1, v/v), antes da quantificação do fosfato por verde de malaquita. A medida da atividade da Cn mostrou ser um ensaio eficiente para diferenciar fotoprotetores adicionados de filtros orgânicos específicos para faixa de UVA-1 (marca B) daqueles não adicionados desses filtros (marca A). Como também, o ensaio foi capaz de diferenciar os protetores solares da marca B, com diferentes valores de PPD: fotoprotetor com PPD-15 não foi capaz de evitar a redução da atividade enzimática, semelhante ao homogeneizado exposto à luz UVA-1 sem proteção, mas diferenciou dos demais PPDs; PPDs 25 e 41 protegeram a atividade da Cn em 34,53 ± 4,15% e 38,19 ± 5,50%, respectivamente. Assim, os parâmetros biológicos testados neste estudo podem atuar como alternativas complementares para avaliação da eficácia de fotoprotetores. / The effectiveness of sunscreens is usually determined by in vivo methods, which use humans, such as Sun Protection Factor (SPF), Immediate Pigment Darkening (IPD), Persistent Pigment Darkening (PPD) and UVA Protection Factor (UVA-PF). However, these parameters do not reflect the real damaging effects induced by solar radiation on the structures and cellular components as the DNA, lipids and proteins. The aim of this study was to develop in vitro methods with cell culture to assess the photoprotective potential of sunscreens using biological parameters that are changed by UV radiation. The first stage of this study to select the skin cells strain (L929 or HaCaT) that would provide the best relationship between dose of UVA or UVB radiation and induced deleterious effect. This effect was quantified by measuring cell viability, lipid peroxidation and generation of reactive oxygen species (ROS). The best cell culture model was treated with commercial sunscreens two brands with SPF 15- 60, obtained from a local market. Sunscreens samples were applied in a quartz plate placed on top of a microplate filled with cells. The cell viability and lipid peroxidation measured in L929 fibroblasts were the most promising for evaluating the efficacy of sunscreens exposed to UVB radiation and allowed to discriminate the photoprotective potential of formulations with different SPFs. On the other hand, ROS generation expressed in keratinocyte of the HaCaT proved to be a promising biological test for discriminating the effectiveness of sunscreens with different SPFs or SPFs/PPDs exposed to UVA radiation. Currently, companies are adding organic filters in sunscreens that absorb in the UVA region, especially in the UVA-1 range. Some researchers have shown that proteomics is the target for ROS induced by UVA. These ROS decrease the activity of calcineurin (Cn), an enzyme known for its role in T cell recruitment. The release of phosphate anion from substrate by enzyme action, it reduces with increasing exposure of Cn to UVA-1 radiation. Thus, a method was developed with HDFn primary cells for evaluation of photoprotective efficacy of sunscreens in the UVA-1 range, using the measure of Cn activity. The results showed that the reduction of Cn activity was only proportional to the dose of UVA-1 when the HDFn cell homogenate, containing 417.55 ± 8.79 mg/mL protein, was exposed to different doses of UVA-1. When cell cultures were irradiated with different doses of UVA-1, there was no reduction in enzyme activity. In addition, for greater precision in the measurement of enzymatic activity, the homogenates, exposed or not to UVA-1 radiation and protected or not with different sunscreens, they had to be diluted at a ratio of 1:2 in buffer before of phosphate quantification for malachite green. The measure of Cn activity proved to be an efficient test to differentiate photoprotectors added specific organic filters for UVA range (brand B) of those not added these filters (brand A). As well, the assay was able to differentiate the sunscreens of brand B, but with different values of PPD: photoprotector with PPD-15 was not able to prevent the reduction of enzyme activity, similar to the homogenate exposed to UVA light without protection, but differentiated from other PPDs; PPDs 25 and 41 protected the activity of Cn to 34.53 ± 4.15% and 38.19 ± 5.50%, respectively. Thus, the biological parameters tested in this study can serve as additional alternatives for assessing the effectiveness of sunscreens.