Nas ultimas décadas o processo de biossorção tem alcançado grande relevância no tratamento de efluentes contendo metais potencialmente tóxicos. O uso de bactérias nesse processo tem obtido destaque, uma vez que possuem inúmeras vantagens. O presente estudo pretendeu avaliar o mecanismo envolvido no processo de biossorção dos íons Pb(II) e Hg(II) por meio das linhagens Cupriavidus metallidurans (CH34) e Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3). Dentre os modelos estudados a isoterma de Langmuir foi a que melhor se ajusta ao processo de adsorção, apresentando uma capacidade máxima de adsorção (qmax) de 0,98 mg.g-1 para o Hg(II) e 86,2 mg.g-1 para o Pb(II), para a linhagem selvagem. Já para a linhagem recombinante o qmax obtido foi 3,4 mg.g-1 para o mercúrio e 172,4mg g-1 para o chumbo. Baseado nos valores referentes à energia livre de Gibbs (ΔG) o processo de retenção ocorreu de forma química e espontânea. A influencia do pH foi avaliada por meio de estudo competitivo entre os íons metálicos, em níveis equimolares. O valor que melhor contemplou a adsorção para ambos os íons foi o pH 7,0, tendo o Pb(II) demonstrado maior capacidade de retenção. Em pH 2,0 houve maior retenção do Hg (II), já em pH 10,0 o Pb(II) obteve maior retenção. Indicando que o meio influencia diretamente na competição dos íons metálicos pelos sítios ativos. Constatou-se que a retenção do metal é robusta e estável ao longo de 6 meses. Os resultados indicam que a Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3) pode ser uma boa opção para biossorção de íons metálicos por meio de biorreator. / In the last decades the biosorption process, has achieved great relevance treatment of effluents containing toxic metals. The use of bacteria in the process has several advantages. This study aimed to evaluate the mechanism involved in the biosorption process of Pb (II) and Hg (II) ions by C. metallidurans (CH34) and C. metallidurans (CH34/pCM3) genetically modified strain. The Langmuir isotherm was the best adjusts to the adsorption process. The maximum adsorption capacity (qmax) of 0.98 mg.g-1 for Hg (II) and 86.2 mg.g -1 to Pb (II), for a wild strain (pH 7,0). However, for a recombinant strain, the qmax was 3.4 mg.g-1 for mercury and 172.4 mg.g-1 for the lead (pH 7,0). Based on the Gibbs free energy (ΔG) values on the adsorption process, it occurred chemically and spontaneously. The Hg(II) presented high adsorption capacity at pH=2 in comparing with Pb(II). While Pb(II) presented high adsorption capacity at pH=10. The studies of binding process was robust and stable for 6 months. The results indicate that Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3) can be a good option for biosorption of metal in a bioreactor.

Nas ultimas décadas o processo de biossorção tem alcançado grande relevância no tratamento de efluentes contendo metais potencialmente tóxicos. O uso de bactérias nesse processo tem obtido destaque, uma vez que possuem inúmeras vantagens. O presente estudo pretendeu avaliar o mecanismo envolvido no processo de biossorção dos íons Pb(II) e Hg(II) por meio das linhagens Cupriavidus metallidurans (CH34) e Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3). Dentre os modelos estudados a isoterma de Langmuir foi a que melhor se ajusta ao processo de adsorção, apresentando uma capacidade máxima de adsorção (qmax) de 0,98 mg.g-1 para o Hg(II) e 86,2 mg.g-1 para o Pb(II), para a linhagem selvagem. Já para a linhagem recombinante o qmax obtido foi 3,4 mg.g-1 para o mercúrio e 172,4mg g-1 para o chumbo. Baseado nos valores referentes à energia livre de Gibbs (ΔG) o processo de retenção ocorreu de forma química e espontânea. A influencia do pH foi avaliada por meio de estudo competitivo entre os íons metálicos, em níveis equimolares. O valor que melhor contemplou a adsorção para ambos os íons foi o pH 7,0, tendo o Pb(II) demonstrado maior capacidade de retenção. Em pH 2,0 houve maior retenção do Hg (II), já em pH 10,0 o Pb(II) obteve maior retenção. Indicando que o meio influencia diretamente na competição dos íons metálicos pelos sítios ativos. Constatou-se que a retenção do metal é robusta e estável ao longo de 6 meses. Os resultados indicam que a Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3) pode ser uma boa opção para biossorção de íons metálicos por meio de biorreator. / In the last decades the biosorption process, has achieved great relevance treatment of effluents containing toxic metals. The use of bacteria in the process has several advantages. This study aimed to evaluate the mechanism involved in the biosorption process of Pb (II) and Hg (II) ions by C. metallidurans (CH34) and C. metallidurans (CH34/pCM3) genetically modified strain. The Langmuir isotherm was the best adjusts to the adsorption process. The maximum adsorption capacity (qmax) of 0.98 mg.g-1 for Hg (II) and 86.2 mg.g -1 to Pb (II), for a wild strain (pH 7,0). However, for a recombinant strain, the qmax was 3.4 mg.g-1 for mercury and 172.4 mg.g-1 for the lead (pH 7,0). Based on the Gibbs free energy (ΔG) values on the adsorption process, it occurred chemically and spontaneously. The Hg(II) presented high adsorption capacity at pH=2 in comparing with Pb(II). While Pb(II) presented high adsorption capacity at pH=10. The studies of binding process was robust and stable for 6 months. The results indicate that Cupriavidus metallidurans (CH34/pCM3) can be a good option for biosorption of metal in a bioreactor.

Doctor en Ciencias mención en Microbiología / El cadmio es un metal pesado altamente tóxico para los sistemas biológicos. El estudio de microorganismos para la biorremediación de metales pesados, ha destacado a Cupriavidus metallidurans CH34, β-proteobacteria aislada desde instalaciones metalúrgicas, como modelo de resistencia a estos elementos. La biorremediación ex situ de metales pesados es comúnmente llevada a cabo en biorreactores de lecho fijo, donde los metales pesados en solución se concentran en la biomasa de comunidades de microorganismos adheridos a superficies llamadas “biopelículas”. El efecto de los metales pesados sobre la formación de biopelículas en C. metallidurans CH34 no ha sido descrito. Durante las últimas décadas, la vía de señalización mediada por un dinucleótido cíclico llamado “c-di-GMP” ha sido establecida como central en la regulación del estilo de vida bacteriano. La interacción de c-di-GMP con distintos receptores macromoleculares promueve del estilo de vida comunitario. Pese al rol fundamental de las biopelículas en los procesos de biorremediación, el efecto de los metales pesados sobre esta vía de señalización en bacterias ha sido poco estudiado. El objetivo de esta tesis es determinar el efecto del cadmio sobre la vía del c-di- GMP y la formación de biopelículas en C. metallidurans CH34. El cadmio inhibió la formación de biopelículas de C. metallidurans CH34. Esto se correlaciona con la descripción de una baja en los niveles de c-di-GMP tras la exposición a este metal pesado, concomitante con un aumento en la abundancia de un transcrito del gen urf2 de los operones de resistencia a mercurio Tn4378 (urf2.1) y Tn4380 (urf2.2), que codifica una potencial fosfodiesterasa. Ensayos de complementación con el gen urf2.2 de la cepa mutante nula P. aeruginosa PAO1 ΔrocR, carente de la fosfodiesterasa RocR, restituyeron la formación de biopelículas y concentración intracelular de c-di-GMP a niveles de la cepa silvestre. Estos resultados constituyen la primera evidencia de funcionalidad catalítica de la fosfodiesterasa codificada por el gen urf2, por lo que se denominó fosfodiesterasa Mrp (metal regulated phosphodiesterase). De forma coherente con la respuesta inhibitoria de formación de biopelículas mediada por la disminución de los niveles de c-di-GMP en C. metallidurans, niveles elevados de este segundo mensajero generados por una diguanilato ciclasa activa expresada en forma heteróloga, incrementaron la formación de biopelículas y la susceptibilidad a cadmio. / Cadmium is a highly toxic heavy metal for biologic systems. Ex situ heavy metal bioremediation is commonly carried out in fixed bed bioreactors in which heavy metals in solution are removed by adhered microbial communities in biofilms. Cupriavidus metallidurans CH34 is a model strain for heavy metal resistance and bioremediation. However, the effect of heavy metals on C. metallidurans CH34 biofilm formation has not been described. The signaling pathway mediated by the cyclic dinucleotide c-di-GMP is central in bacterial lifestyle regulation. c-di-GMP promotes biofilm lifestyle through the interaction with different receptors. Despite of the central role of biofilms on the bioremediation process, the effect of heavy metals over this signaling pathway has been poorly studied. Thus, the objective of this study was to assess the effect of cadmium on the c-di-GMP pathway and biofilm formation in C. metallidurans CH34. Cadmium exerted an inhibitory effect on C. metallidurans CH34 biofilm formation concomitant with a decrease of c-di-GMP levels. After cadmium exposure an increase in the transcription of the gene urf2 that codes for a phosphodiesterase and is located in the mercury resistance operons Tn4378 (urf2.1) and Tn4380 (urf2.2) was observed. Complementation assays with the urf2.2 gene in Pseudomonas aeruginosa PAO1 ΔrocR mutant null strain that is defective in RocR phosphodiesterase, restored biofilm formation and c-di-GMP intracellular concentration at wild type levels. This is the first evidence of catalytic functionality of the urf2 gene encoded phosphodiesterase, which was named Mrp por metal regulated phosphodiesterase. In agreement with the biofilm formation inhibition mediated by a c-di-GMP drop in C. metallidurans, high levels of this second messenger generated by an active diguanylate cyclase that was heterologously expressed, increased the biofilm formation and cadmium susceptibility of this bacterium.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Química Ambiental. / Los suelos se han constituido como el principal sumidero de metales pesados y otros contaminantes producto de causas naturales y actividades antropogénicas. Ejemplo de estas actividades son las mineras que liberan metales pesados, tales como Hg+2, Pb+2, Cu+2 y Zn+2, y las plantas petroquímicas que producen hidrocarburos aromáticos como Benceno, Tolueno, Etilbenceno, y Xilenos (BTEX) a partir de la fracción volátil del petróleo. El objetivo de este seminario de título consiste en validar un método analítico para la cuantificación de benceno en microcosmos conformados por muestras de suelo co-contaminado contenidas en viales, a los cuales se le adiciona una bacteria especializada. De esta forma, se desarrolla una metodología para determinar benceno remanente en suelo, carente de solventes orgánicos, simple y costo-efectiva, mediante un sistema de extracción de espacio de cabeza acoplado a un cromatógrafo de gases junto a un detector de ionización de llama (HS-GC-FID), que permita monitorear la cinética de remoción de benceno en un suelo co-contaminado con Hg (II), durante un proceso de biorremediación bacteriana utilizando la cepa modificada genéticamente Cupriavidus metallidurans MSR33 que es altamente resistente a mercurio. De esta manera, en el presente trabajo se utilizó un suelo contaminado con benceno y mercurio como una aproximación a una situación real de co-contaminación, donde se aplicó una técnica de remediación a través de la utilización de bacterias especializadas capaces de remover benceno en presencia de mercurio. La medición de benceno con la metodología validada permitió monitorear la cinética de biorremediación utilizando la bacteria C. metallidurans MSR33 entregando información rápida y veraz al aplicar directamente en viales con microcosmos de suelo contaminados con Benceno 200 mg×Kg-1 y Hg (II) 2 mg×Kg-1. La determinación de benceno permitió demostrar que este proceso de biorremediación conforma una novedosa tecnología costo-efectiva y amigable con el medioambiente, aplicable a suelos impactados con BTEX en presencia de metales tóxicos. / Soils have been established as the main sink for heavy metals and other pollutants due to natural causes and anthropogenic activities. Examples of these are mining activities which release heavy metals, such as Hg+2, Pb+2, Cu+2 and Zn+2, and petrochemical plants which produce aromatic hydrocarbons such as Benzene, Toluene, Ethylbenzene, and Xylene (BTEX) from volatile fractions of petroleum. The aim of this seminar consists of validate an analytical method for the quantification of benzene in microcosms consisting on vials containing co-contaminated soil samples, which are inoculated with a specially adapted bacterial culture. The methodology was developed in order to measure benzene concentrations remaining in soil in an organic solvent-free, simple and cost-effective manner. This was carried by means of a headspace extraction system coupled to a gas chromatograph with flame ionization detector (HS-GC-FID), that allowed to monitor the kinetics of benzene removal in a soil co-contaminated with Hg (II), during the process of bacterial bioremediation with the genetically modified strain Cupriavidus metallidurans MSR33 that is highly resistant to mercury. Thus, soil samples polluted with benzene and mercury were used on this research as a practical approach to a real co-contamination scenario. A remediation technique was applied by means of bacteria specially adapted to remove benzene from soil in presence of mercury. The measurement of benzene with the validated methodology allowed to monitor the kinetics of bioremediation using the C. metallidurans MSR33 bacterial strain delivering fast and accurate information when applied directly in vials with soil microcosms contaminated with Benzene 200 mg×Kg-1 and Hg (II) 2 mg×Kg-1. The determination of benzene allowed to demonstrate that this process of bioremediation forms a novel, cost-effective and environmental-friendly technology, potentially useful for treatment of soils impacted with BTEX in the presence of toxic metals.

CnrX est un senseur périplasmique, ancré à la membrane, appartenant au complexe CnrYXH qui contribue à réguler l'expression des gènes impliqués dans la résistance au nickel et au cobalt chez Cupriavidus metallidurans CH34. La résistance est induite par la libération de CnrH, un facteur sigma de type ECF (Extracytoplasmic Function), par le complexe CnrYX en réponse à Ni et Co. Nous avons cherché à comprendre la manière dont CnrXs, le domaine senseur de CnrX, détecte les ions métalliques, les stratégies utilisées pour sélectionner spécifiquement Ni ou Co ainsi que la nature du signal engendré par cette interaction. Les techniques spectroscopiques et biophysiques telles que l'UV-visible, la RPE, le XAS et l'ITC ont permis d'étudier les sites métalliques en solution. Le dimère de CnrXs possède quatre sites de liaison au cobalt. Deux des sites (sites F) sont retrouvés dans la protéine entière dont nous avons maintenant un excellent modèle avec le mutant CnrXs-H32A. Les deux autres sites (sites E) ont un signal spectroscopique atypique probablement dû à la formation d'un complexe binucléaire de cobalt. Nous présentons également des structures à haute résolution de CnrXs dans ses formes apo et métallées par le nickel, cobalt ou zinc. Nous avons établi que la forme zinc est la forme inactive de la protéine et que le mécanisme de détection est engendrée par la substitution du zinc par le nickel et le cobalt dans le site F, conduisant à une modification majeure du site de liaison au métal. Tandis que le zinc est pentacoordiné dans une sphère 3N2O, Ni et Co recrutent le soufre de la seule méthionine (Met123) comme sixième ligand pour former un site octaédrique. Nous suggérons que Met123 soit l'interrupteur moléculaire dont la liaison avec le métal fait évoluer la structure de la protéine vers une conformation active. A notre connaissance, ces résultats constituent la première étude structurale et spectroscopique d'un senseur de métal périplasmique impliqué dans un système de transduction du signal dépendant d'un facteur sigma de type ECF. / CnrX is the membrane-anchored periplasmic sensor of the CnrYXH complex that contributes to regulate the expression of the genes involved in cobalt and nickel resistance in Cupriavidus metallidurans CH34. This resistance is induced by the release of the ExtraCytoplasmic Function (ECF) sigma factor CnrH from the CnrYX complex upon sensing of Ni or Co. We addressed the metal sensing mechanisms of CnrXs, the strategies used to select Ni or Co and the nature of the signal onset. Biophysical and spectroscopic techniques allowed us to study the metal binding sites in solution. The CnrXs dimer contains four cobalt binding sites. Two (F sites) are present in the full-length protein which H32A-CnrXs mutant is an excellent model of. The two other sites have an unusual spectroscopic signal that might be due to the formation of a binuclear cobalt complex. We present also high-resolution structures of CnrXs in the apo, Ni-, Co-, and Zn-bound forms. We propose that Zn-bound CnrX typifies the resting state of the complex and that the sensing mechanism is triggered by the substitution of Zn for Ni or Co in the F site. This substitution leads to dramatic changes in the metal-binding site. While the Zn ion is pentacoordinated in a 3N2O sphere, Ni or Co ions recruit the thioether sulfur of the only methionine (Met123) residue as a sixth ligand to form an octahedral site. We propose that the Met123 side chain recruitment is the qualitative change that switches on the sensing mechanism by remodeling the four-helix bundle that accommodates the metal-binding site. To our knowledge these results represent the first structural and spectroscopic study of a periplasmic metal sensor involved in transmembrane signal transduction for the activation of an ECF-type sigma factor.

Le sélénium est un élément trace essentiel pour les organismes vivants mais à forte concentration, il est très toxique. Les oxyanions sélénite et séléniate sont les formes les plus toxiques et prédominantes dans l'environnement. Certains micro-organismes jouent un rôle prépondérant en contribuant au cycle naturel du sélénium. Notre modèle d'étude Cupriavidus (anciennement Ralstonia) metallidurans CH34, bactérie tellurique issue de biotopes contaminés en métaux, est connu pour résister au sélénite (forme soluble du sélénium, très toxique et bio-assimilable) en le réduisant en sélénium élémentaire (forme précipitée insoluble et peu toxique). Afin de mieux comprendre les mécanismes de réduction du sélénium par les bactéries, trois méthodes de spéciation ont été combinées (SAX (XANES et EXAFS), HPLC-ICP-MS et SDS-PAGE-PIXE) et normalisées par la quantification du sélénium accumulé dans les bactéries. Les analyses de spéciation ont mis en évidence l'existence de deux voies de réduction du sélénium chez C. metallidurans CH34 : une voie d'assimilation transforme le sélénite et le séléniate en sélénium organique, identifié comme de la sélénométhionine et conduit à son incorporation dans des protéines bactériennes. L'espèce organique sélénométhionine semble être incorporée dans les protéines de façon non spécifique (présence de protéines séléniées). Une voie de détoxication précipite le sélénite en nanoparticules de sélénium élémentaire. Cette voie de détoxication ne se met pas en place après une exposition au séléniate malgré sa présence comme espèce minoritaire par rapport à l'exposition sélénite. Du sélénodiglutathion est détecté dans des bactéries stressées par une exposition au séléniate en milieu limité en sulfate. Les bactéries exposées à du sélénite accumulent 25 fois plus de sélénium que lorsqu'elles sont exposées à du séléniate. L'étude de mutants résistants au sélénite, n'exprimant pas la protéine membranaire DedA, a montré que l'accumulation du sélénium après exposition au sélénite est diminuée comparé à la souche sauvage signifiant un probable lien entre la prise en charge du sélénite et la protéine DedA. Enfin, le séléniate semble emprunter la sulfate perméase de C. metallidurans CH34.

Le gène copH est l'un des 19 gènes constituant le cluster cop, impliqué dans la détoxication du cuivre dans le cytoplasme et le périplasme, chez Cupriavidus metallidurans CH34, souche modèle pour l'étude de la résistance aux métaux lourds chez les bactéries. La protéine CopH, localisée dans le périplasme, possède une structure et une fonction inconnues mais son expression est stimulée par la présence de cuivre. Nous avons analysé les propriétés de liaison CopH-Cu : les données montrent la présence d'un centre Cu(II) de type 2 dans un champ de ligands azotés. Les 2 seuls résidus histidine, a priori ligands du cuivre, n'interagiraient pas directement avec les ions Cu(II). Le site cuivre serait constitué d'atomes d'azote appartenant à la chaîne principale de la protéine.<br />L'étude des transporteurs CusA et CzcA a nécessité une purification optimisée en détergents et l'analyse de leur comportement en solution.

CnrX est un senseur périplasmique, ancré à la membrane, appartenant au complexe CnrYXH qui contribue à réguler l'expression des gènes impliqués dans la résistance au nickel et au cobalt chez Cupriavidus metallidurans CH34. La résistance est induite par la libération de CnrH, un facteur sigma de type ECF (Extracytoplasmic Function), par le complexe CnrYX en réponse à Ni et Co. Nous avons cherché à comprendre la manière dont CnrXs, le domaine senseur de CnrX, détecte les ions métalliques, les stratégies utilisées pour sélectionner spécifiquement Ni ou Co ainsi que la nature du signal engendré par cette interaction. Les techniques spectroscopiques et biophysiques telles que l'UV-visible, la RPE, le XAS et l'ITC ont permis d'étudier les sites métalliques en solution. Le dimère de CnrXs possède quatre sites de liaison au cobalt. Deux des sites (sites F) sont retrouvés dans la protéine entière dont nous avons maintenant un excellent modèle avec le mutant CnrXs-H32A. Les deux autres sites (sites E) ont un signal spectroscopique atypique probablement dû à la formation d'un complexe binucléaire de cobalt. Nous présentons également des structures à haute résolution de CnrXs dans ses formes apo et métallées par le nickel, cobalt ou zinc. Nous avons établi que la forme zinc est la forme inactive de la protéine et que le mécanisme de détection est engendrée par la substitution du zinc par le nickel et le cobalt dans le site F, conduisant à une modification majeure du site de liaison au métal. Tandis que le zinc est pentacoordiné dans une sphère 3N2O, Ni et Co recrutent le soufre de la seule méthionine (Met123) comme sixième ligand pour former un site octaédrique. Nous suggérons que Met123 soit l'interrupteur moléculaire dont la liaison avec le métal fait évoluer la structure de la protéine vers une conformation active. A notre connaissance, ces résultats constituent la première étude structurale et spectroscopique d'un senseur de métal périplasmique impliqué dans un système de transduction du signal dépendant d'un facteur sigma de type ECF.

Cupriavidus metallidurans CH34 is a Gram-negative & / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished