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La liaison de CXCL12 à ses récepteurs CXCR4 et CXCR7 peut-être bloquée par un neutraligand de CXCL12, la chalcone 4, qui présente une activité anti-inflammatoire dans un modèle d’asthme chez la souris. Notre travail a consisté à proposer des stratégies permettant le développement de molécules biodisponibles et actives localement, et d’étudier le mécanisme d'action in vivo des neutraligands de CXCL12. Nous avons développé un modèle court et reproductible d'asthme allergique chez la souris, adapté à une évaluation rapide de l’activité anti-inflammatoire des nouveaux composés et un développement raisonné des stratégies envisagées. Nous avons synthétisé trois prodrogues solubles, adaptées à une administration locale, inactives et rapidement clivées en chalcone 4 active. In vivo, les prodrogues sont anti-inflammatoires à des doses susceptibles de limiter les effets indésirables. Pour favoriser davantage l'action anti-inflammatoire locale du neutraligand de CXCL12, nous avons synthétisé une ante-drogue, la carbonitrile-chalcone 4, active in vivo par administration locale et rapidement dégradée en deux composés inactifs avant sa distribution dans l'organisme. Enfin, l'étude de la chalcone 4 a mis en évidence une activité antiasthmatique significative, liée à l'élimination rapide de la chimiokine CXCL12 du poumon. La capture de CXCL12 par le neutraligand réduit la différenciation des macrophages M1 et leur libération de cytokines pro-inflammatoires, ainsi que le recrutement des éosinophiles et des lymphocytes CXCR4+. En conclusion, nos travaux ont permis de conforter les rôles de la chimiokine CXCL12 dans l'asthme et présenter deux stratégies aptes à limiter les effets indésirables. / The binding of the chemokine CXCL12 to its receptors CXCR4 and CXCR7 may be prevent by a CXCL12 neutraligand, chalcone 4, having an anti -inflammatory activity in a mouse model of allergic asthma. Our work consisted in proposing strategies for the development of active and bioavailable molecules, able to promote local action, and to study the in vivo mechanism of action of the CXCL12 neutraligands. We initially developed a short and reproducible mouse model of allergic asthma, suitable for a rapid assessment of the anti -inflammatory activity of new compounds, in order to ensure rational development of the proposed strategies. We developped three soluble prodrugs, adapted to local administration, inactive but rapidly cleaved in active chalcone 4. In vivo, the prodrugs have an anti-inflammatory activity at suitable doses to minimize side effects. To promote the benefit of local anti-inflammatory action of CXCL12 neutraligand, we synthesized an antedrug, carbonitrile-chalcone 4, active locally in vivo after local administration and rapidly degraded before its distribution in the body.Finally, the study of chalcone 4 allowed us to highlight a significant asthma activity. An activity related to the rapid elimination of the CXCL12 chemokine from the lung. The trapping of CXCL12 by the neutraligand reduced M1 macrophage activation and their release of pro inflammatory cytokines, as decreases the recruitment of CXCR4+ eosinophils and lymphocytes. In conclusion, our work provided mechanistic elements related to the roles of the chemokine CXCL12 in asthma, and present two interesting strategies adapted to local administration to limit adverse effects.

Ce travail de thèse PhD concerne l'application d'une approche intégrée pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes d'action de Akt et CXCR4, surexprimées dans différents cancers humains. Efforts récents dans le développement et l'évaluation biologique (activité antiproliférative) de petites entités moléculaires inhibitrices d’Akt, une sérine/thréonine protéine-kinase, ont conduit à l'identification de nouveaux inhibiteurs pyrrolo[1,2-a]quinoxaline, conçus et préparés via une stratégie multi-étapes. Certains des composés synthétisés ont montré une activité contre les lignées cellulaires leucémiques testées (Jurkat, U266, K562, U937 et HL60) supérieure à celle de composé de référence A6730. En outre, des résultats préliminaires menés sur Akt puis sur le domaine de PH isolé d’Akt, ont montré que ils peuvent être considérés comme des inhibiteurs allostériques potentiels. La seconde partie des travaux concerne la conception et la synthèse de deux nouvelles séquences peptidiques contenant quelques acides aminés "disorder promoting" et une unité CPC. Les études CD, RMN et MD ont fait ressortir leur flexibilité et ont démontré leurs capacités à assumer des ensembles de conformations stabilisées par un réseau de liaisons hydrogène. Ensuite, nous avons étudié l'effet de la chaîne alkyle reliée sur la conformation des peptides. Des études de fluorescence et DLS ont été réalisées pour évaluer les CMC et la dimension des agrégats supramoléculaires. Les tests biologiques ont souligné que ces édifices moléculaires (peptides amphiphiles nommés, PAs) montrent ainsi des activités prometteuses, voire plus que la molécule de référence (AMD3100). / This PhD thesis work has been covered in the application of an integrated approach to get a better understanding about the mechanism of action of two systems: Akt and CXCR4, proteins overexpressed in different human cancers. On the basis of previous results obtained on the antiproliferative activities of small molecule inhibitors of Akt, a serine/threonine protein kinase, a novel series of pyrrolo[1,2-a]quinoxaline derivatives have been designed and synthesized via multistep heterocyclization process. Some compounds showed promising activities against all leukemia cell lines tested (Jurkat, U266, K562, U937 and HL60), even better than the reference compound (A6730) one. In addition, docking results, conducted on the isolated PH domain, showed that these new compounds could be considered as allosteric inhibitors. The second workpackage reports on the design and the synthesis of two new peptidic sequences containing a few amino acids “disorder promoting” and a CPC unit, the CXCL12 binding motif towards CXCR4. The peptide structural preferences were analysed by CD, NMR and MD techniques that highlighted their flexibility and demonstrated the ability of these peptides to assume conformational ensembles stabilized by a network of transient and dynamic H-bonds. Afterwards we studied the alkyl chain effect on the conformation of the peptide portion. Solution fluorescence and DLS studies have been performed to evaluate CMC and the dimension of supramolecular aggregates (named peptide amphiphiles, PAs). Biological tests pointed out that these molecular buildings show promising activities, even higher than the reference molecule (AMD3100) one.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Tumores sÃo populaÃÃes celulares heterogÃneas hierarquicamente organizadas, cujas cÃlulas-tronco possuem importÃncia relevante desde que sÃo cÃlulas com a capacidade de se renovarem e de gerarem linhagens em fases diferentes. Dada a sua importÃncia, a identificaÃÃo de componentes de cÃlulas-tronco à essencial para o entendimento da tumorigÃnese. Apesar de marcadores de linhagem neural terem sido identificados, a associaÃÃo destes marcadores com os tumores cerebrais ainda à escassa e nos astrocitomas sÃo relacionados principalmente aos glioblastomas. Entre esses marcadores de cÃlulas-tronco,CD133, CXCR4 e CD44 sÃo relacionados à formaÃÃo do glioma, migraÃÃo e crescimento; por outro lado, OLIG2 à envolvido no destino celular. NÃo existem estudos, atà essa data, que avaliam todos esses marcadores juntos e sua relaÃÃo com grau tumoral. Adicionalmente, alteraÃÃes epigenÃticas especÃficas, especialmente a metilaÃÃo em promotor, tem sido identificadas nestes tumores, levando a inativaÃÃo de genes, com destaque o CDKN2A (proteÃna p16INK4A), um supressor tumoral. Apesar de esse mecanismo ser apontado como o principal inativador desse gene, em astrocitomas ainda existem questÃes controversas. Para avaliar essas questÃes, este estudo objetivou determinar a expressÃo e padrÃo de metilaÃÃo em promotor de CDKN2A e sua associaÃÃo com parÃmetros clinico-patolÃgicos e se a presenÃa de cÃlulas-tronco/progenitoras, considerando a expressÃo de CD133, CXCR4, CD44 e OLIG2 poderia definir subpopulaÃÃes de cÃlulas que podem ser usadas como marcadores prognÃsticos. Para isso, em uma sÃrie de 93 astrocitomas de diferentes graus de malignidade, foram estudadas a expressÃo dos marcadores CD133, CXCR4, CD44, OLIG2 e p16INK4A, detectada pela tÃcnica de imunohistoquÃmica, e o padrÃo de metilaÃÃo em promotor de CDKN2A, por PCR especÃfico para metilaÃÃo (PCR-MS). Os dados foram entÃo associados com grau tumoral, localizaÃÃo e outros parÃmetros clinico-patolÃgicos. As anÃlises estatÃsticas foram realizadas usando o teste do X2, teste exato de Fisher, correlaÃÃo de Spearman, agrupamento de k-means e anÃlise de componentes principais, com diferenÃas consideradas significantes com p<0.05. A imunomarcaÃÃo de OLIG2 mostrou a frequÃncia maior de positividade (73,1%), seguido por CXCR4 (60,2%), CD44 (55,9%) e CD133 (45,2%). AnÃlises de correlaÃÃo e agrupamento definiram dois subtipos de populaÃÃo de acordo com os marcadores estudados, um subtipo CXCR4(+)CD133(+)CD44(+) e outro OLIG2(+). Tumores CD133, CXCR4 e CD44 positivos aumentaram de acordo com malignidade. No grau IV, este subtipo de tumores [CD133(+)CXCR4(+)CD44(+)] foi significantemente mais frequente (p=0,008) e tambÃm nos tumores difusos. Adicionalmente, tumores com CXCR4(+) e CD133(+) foram preferencialmente localizados nos hemisfÃrios cerebrais e nos ventrÃculos, e a maioria nos pacientes com idade &#8805; 30 anos. Por outro lado, tumores OLIG2(+) foram associados com o cerebelo, que à a localizaÃÃo preferencial do astrocitoma pilocÃtico. Uma forte correlaÃÃo negativa entre imunomarcaÃÃo nuclear e citoplasmÃtica e metilaÃÃo em promotor de CDKN2A foi encontrada. AlÃm do mais, uma correlaÃÃo negativa significante entre metilaÃÃo em promotor de CDKN2A e idade foi observada e pacientes do sexo feminino tiveram uma maior frequÃncia significante de CDKN2A metilado em promotor que o sexo masculino. Em conclusÃo, a presenÃa de subpopulaÃÃes de cÃlulas-tronco em astrocitomas à indicativa de progressÃo tumoral, cujos marcadores CXCR4, CD133 e CD44 podem ser potencialmente usados em conjunto como marcadores prognÃsticos. A associaÃÃo com localizaÃÃo do tumor e idade tambÃm corroboram esses achados. Adicionalmente, a inativaÃÃo de CDKN2A por metilaÃÃo em promotor à um evento frequente em astrocitomas e à relacionada à idade e sexo dos pacientes. / Currently, the concept that tumors are cell populations organized in a hierarchically heterogenous way in which stem-cells are relevantly important as these cells have the capacity of self-renew and of generating cell lineages in different phases of differentiation. So that, the identification of stem-cell components is essential to tumorigenesis understanding. Althought neural cell lineage markers have been identified, the association among these markers and neurological tumors is still scarce, and taking in consideration the astrocytomas, the association assessements are verified mainly regarding the glioblastomas. Among these stem cell markers, CD133, CXCR4 and CD44 are related to the glioma formation, migration and growth; on the other hand, OLIG2 is involved in cell destination. So far there are no studies evaluating all these markers together and their relationship to tumor grades. Additionally, specific epigenetic alterations, specially promoter methylation, have been widelly identified in these tumors, leading to gene inativation, mostly involving CDKN2A (p16INK4A protein), a tumor suppressor. Althought this mechanism is pointed as this gene main inactivator, there are still controvertial questions regarding the astrocytomas. In order to evaluate these questions, the present study aimed to determine CDKN2A pattern of methylation and expression and their association to clinicalpathological parameters, and if the presence of progenitor/stem-cells, taking CD133, CXCR4, CD44 and OLIG2 expression in consideration, could define subpopulations of cells which might be used as prognostic markers. So, in a series of 93 astrocytomas of different malignity grades, the expression of CD133, CXCR4, CD44, OLIG2 and p16INK4A was analysed by the imunohistochemistry technique, and the CDKN2A methylation status was assessed by methylation specific PCR (MS-PCR). The data was then associated to tumor grades, localization and other clinicalpathological parameters. The statistic analyses were made using X 2 test, Fisher's exact test, Spearman's correlation, kmeans groupment and principal component analyses, using p<0.05 as statistically significance. The imunopositivity of OLIG2 was predominant (73.1%), followed by CXCR4 (60.2%), CD44 (55.9%) and CD133 (45.2%). The correlation and groupment analyses defined two different population subtypes, a CXCR4(+)CD133(+)CD44(+) subtype and a OLIG2(+) subtype. CXCR4(+)CD133(+)CD44(+) tumors became more frequent as malignity grew. In grade IV, this subtype was significantly more frequent (p=0.008), being also in diffuse tumors. Additionally, CXCR4(+) and CD133(+) tumors were preferentially located in brain hemisferes and in the ventricles, and mostly in aged >30 patients. On the other side, OLIG2(+) tumors were associated to the cerebellum, which is the pylocitic tumor preferential localization. A strong negative correlation between nuclear and cytoplasmatic imunopositivity and promoter methylation in CDKN2A was observed. Also, a negative significant correlation between methylated CDKN2A and patient's age was found; moreover, feminine patients presented a higher frequency of methylated CDKN2A. In conclusion, the presence of stemcell subpopulations in astrocytomas indicates tumoral progression, in which CXCR4, CD133 and CD44 may be potentially used together as prognostic markers. The association between tumor localization and patient's age also corroborates these findings. Additionally, the CDKN2A inactivation by promoter methylation is a frequent event in astrocytomas and it is associated to patient's age and gender

Die Erforschung von Mechanismen der malignen Transformation ermöglicht das Verständnis von zahlreichen Signalwegen in der Zelle. In dieser Arbeit wurden Mechanismen untersucht, in die die Proliferation und das Homing leukämischer Progenitorzellen involviert sind. Diese Ergebnisse wurden im Anschluss mit gesunden Kontrollen korreliert. Die Migration von Stammzellen ist ein wichtiger zellulärer Mechanismus in der hämatopoetischen Stammzell-Biologie und in der Leukämie-Forschung. CXCR4 und sein Ligand SDF-1 sind wichtige Regulatoren der Stammzell-Migration und des Homings. Sie beeinflussen physiologische, pathologische und zelluläre Migrationsprozesse, die unter anderem für die Vaskularisierung (Nagasawa, 2001), aber auch für die Metastasierung von Tumorzellen (Helbig et al., 2003) von zentraler Bedeutung sind. FLT3 mutierte AML-Zellen zeigen erhöhte CXCR4-Level und ein verbessertes Anwachsen den Zellen im Knochenmark nach Transplantation in NOD/SCID-Mäuse. Tierexperimentelle Daten deuten darauf hin, dass ein verstärktes Homing von leukämischen Zellen mit einer erhöhten Resistenz gegenüber Chemotherapie assoziiert ist. Möglicherweise ist dies eine der Hauptursachen für das Therapieversagen bei diesen Patienten. Das Ziel des Projektes, dem diese Arbeit zugrunde liegt, war es, Interaktionen zwischen FLT3-ITD und CXCR4 zu untersuchen und mögliche Auswirkungen dieser Interaktionen für Migration und Homing von Stammzellen zu ermitteln. Letztlich können diese Erkenntnisse sowohl zur Verbesserung der klinischen Stammzell-Transplantationen und zur Definition neuer Strategien zur Behandlung von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie beitragen. Untersuchungsgegenstände dieser Arbeit waren zum einen die Gewinnung von Erkenntnissen über die Wirkung einer FLT3-ITD-Überexpression auf die Expression verschiedener Signalmoleküle und ihr möglicher Einfluss auf CXCR4/SDF-1 vermittelte Signalwege. Des Weiteren die Rolle der CXCR4/SDF-1-Achse und der Einfluss einer Mikroumgebung auf AML-Zellen. Zum anderen die Wirkung des CXCR4 Inhibitiors AMD3100 auf AML-Blasten sowie die Blockierung der CXCR4/SDF-1-Achse als mögliche Therapie gegen AML. Interne Tandemduplikation (ITD)-Mutationen des FLT3-Rezeptors sind mit einer hohen Inzidenz von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML) verbunden. Die Expression des CXCR4-Rezeptors in FLT3-ITD-positiven AML-Blasten ist mit schlechten Prognosen für die Patienten verbunden. Die Blockierung von CXCR4 führt zu einer Sensibilisierung von AML-Blasten gegenüber einer Chemotherapie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Blasten von Patienten mit FLT3-ITD oder FLT3-wt-AML verwendet. Darüber hinaus wurden humane CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen (HSCs) bis zu 80% mit retroviralen Vektoren transduziert, die ein humanes FLT3-ITD-Transgen beinhalteten. Im Gegensatz zu früheren Daten von murinen Zellen wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass eine Überexpression des FLT3-ITD-Transgens in humanen HSCs eine signifikant reduzierte Migration zu SDF-1-in vitro aufweist. Dies spiegelte sich außerdem in einem reduzierten Knochenmark-Homing in NOD/SCID-Mäusen wider. Ko-Kultivierungsexperimente von sowohl FLT3-ITD-positiven AML-Blasten als auch von FLT3-ITD-positiven HSCs auf Stromazellen des Knochenmarks führten zu einem signifikanten Proliferationsvorteil und zu erhöhten zeitigen CAFCs im Vergleich zu FLT3-wt-AML-Blasten bzw. zu kontrolltransduzierten HSCs. Die Zugabe des CXCR4-Inhibitors AMD3100 zeigte während der Ko-Kultur eine deutliche Reduktion der Proliferation und von CAFCs bei FLT3-ITD-positiven Zellen, aber nicht bei FLT3-wt-Blasten. Zusammenfassend liefert diese Studie den Beweis für eine Stroma-vermittelte Resistenz von FLT3-ITD-positiven HSCs und Blasten. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass die Hemmung von CXCR4 die zellulären Wechselwirkungen von Stromazellen und leukämischen Zellen behindert. Somit bestätigt sich eine funktionelle Bedeutung der CXCR4/SDF-1-Achse bei AML. Um die Kontrolle über leukämische Zellen und ihre Proliferation zu bekommen, könnte die Hemmung von CXCR4 eine neue therapeutische Strategie bei Patienten mit fortgeschrittener FLT3-ITD-positiver AML sein.

Schwannzellen sind die myelinisierenden Zellen des peripheren Nervensystems, die auch eine Rolle bei Entzündungs- und Regenerationsprozessen spielen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Bedeutung der Chemokinrezeptoren CXCR4 und CXCR7 bei der SDF-1-abhängigen Signalübermittlung in der Schwannzelllinie RN22. Mittels PCR, Western-Blotting und FACS erfolgte zunächst ein Expressionsnachweis der Chemokinrezeptoren. Anschließend wurde mittels Western-Blotting festgestellt, dass eine Behandlung mit SDF-1 zu einer Aktivierung der intrazellulären Signalkinasen Erk1/2, p38 und Akt führt. Für PKC ζ/λ wurde kein Effekt beobachtet. Durch Einsatz der spezifischen Antagonisten für CXCR4 (AMD3100) und CXCR7 (CCX733) konnten diese Effekte blockiert werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass beide Rezeptoren ihren Liganden binden müssen, damit ein intrazellulärer Effekt auftritt. Ähnliches gilt auch für die SDF-1-abhängige Migration von RN22-Zellen, die ebenfalls bereits durch einen der beiden Antagonisten unterbunden werden kann.

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La sida és una malaltia causada pel VIH, que ataca a les cèl·lules del sistema immunitari. Actualment s'estima que viuen uns 33 milions de persones infectades per aquest virus. La teràpia antiretroviral actual consisteix en combinacions de dues famílies de compostos: inhibidors de la transcriptasa inversa i inhibidors de la proteasa, ambdós dirigits a enzims específics produïts pel VIH. Una de les principals dificultats en el tractament antiretroviral és la ràpida evolució del virus, que li permet fer-se resistent als fàrmacs que s'utilitzen. Per tant, hi ha una necessitat contínua d'utilitzar nous fàrmacs anti­VIH en combinació amb els actuals, i haurien d'actuar preferentment en noves dianes del cicle de replicació del VIH. El descobriment dels cofactors cel·lulars implicats en l'entrada del VIH i una millor comprensió de les proteïnes de l'envolta que controlen el procés de fusió han renovat l'interès en les primeres etapes de la replicació del VIH com a dianes per a una intervenció terapèutica. L'entrada del VIH consta de 4 etapes interrelacionades: la unió del virus a la superfície cel·lular, la unió del virus al receptor CD4, la interacció del complex CD4-glicoproteïna de l'envolta amb el coreceptors d'entrada i la fusió virus-cèl·lula. Els principals coreceptors utilitzats pel VIH per a la seva entrada a la cèl·lula són els receptors de quimiocines CCR5 i CXCR4. En aquest àmbit s'han aprovat recentment dos nous fàrmacs, Fuzeon® (Hoffman-La Roche i Trimeris), que inhibeix la fusió del virus amb la cèl·lula, i Selzentry® (Pfizer), que és un antagonista de CCR5. S'han identificat agents que bloquegen CXCR4, entre els que destaca AMD3100. Tot i això, el seu desenvolupament s'ha abandonat per una toxicitat cardíaca i falta de biodisponibilitat oral, ambdues relacionades amb la seva elevada càrrega positiva a pH fisiològic. Per tant, es necessita disposar de nous inhibidors de la unió del VIH al coreceptor CXCR4 que solucionin aquests desavantatges. L'interès d'aquesta tesi és dissenyar una quimioteca combinatòria d'anàlegs al AMD3100 amb menor basicitat, que incorporin a la seva estructura les principals característiques d'aquest compost, un linker p-fenilenbismetilènic i sistemes heterocíclics. A partir de l'estructura dels compostos de la quimioteca dissenyada es desenvolupen i validen les rutes sintètiques necessàries per a la seva obtenció. A més, s'apliquen tècniques computacionals de selecció de diversitat per a explorar l'espai químic representat pels compostos de la quimioteca. A partir de les molècules actives identificades en aquest procés i inhibidors coneguts del coreceptor CXCR4 es desenvolupen models QSAR i farmacofòrics. Aquests models s'utilitzen per a realitzar un cribatge virtual de la resta de compostos de la quimioteca dissenyada i augmentar la probabilitat de seleccionar nous compostos amb activitat antiviral. Mitjançant aquest procediment s'han identificat nous inhibidors de CXCR4, un d'ells amb elevada activitat anti-VIH. A més, aquest compost només presenta quatre àtoms de nitrogen a la seva estructura, enfront dels vuit de l'AMD3100. / El sida es una enfermedad causada por el VIH, que ataca a las células del sistema inmunitario. Actualmente se estima que viven unos 33 millones de personas infectadas por este virus. La terapia antirretroviral actual consiste en combinaciones de dos familias de compuestos: los inhibidores de la transcriptasa inversa y los inhibidores de la proteasa, ambos dirigidos a enzimas específicos producidos por el VIH. Sin embargo, una de las principales dificultades en el tratamiento antirretroviral es la rápida evolución del virus, que le permite hacerse resistente a los fármacos utilizados. Por lo tanto, hay una continua necesidad de usar nuevos fármacos anti-VIH en combinación con los actuales, que deberían actuar preferentemente en nuevas dianas del ciclo de replicación del VIH. El descubrimiento de los cofactores celulares implicados en la entrada del VIH y una mejor comprensión de las proteínas de la envoltura que controlan el proceso de fusión han renovado el interés en las primeras etapas de la replicación del VIH como dianas para una intervención terapéutica. La entrada del VIH consta de 4 etapas interrelacionadas: la unión del virus a la superficie celular, la unión del virus al receptor CD4, la interacción del complejo CD4­glicoproteína de la envoltura con los correceptores de entrada y la fusión virus-célula. Los principales correceptores utilizados por el VIH para su entrada en la célula son los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4. En este ámbito se han aprobado recientemente dos nuevos fármacos, Fuzeon® (Hoffman-La Roche y Trimeris), que inhibe la fusión del virus con la célula, y Selzentry® (Pfizer), que es un antagonista de CCR5. Se han identificado agentes que bloquean CXCR4, entre los que destaca AMD3100. Sin embargo, su desarrollo se ha abandonado por una toxicidad cardiaca y falta de biodisponibilidad oral, ambas relacionadas con su elevada carga positiva a pH fisiológico. Por lo tanto se necesita disponer de nuevos inhibidores de la unión del VIH al receptor CXCR4 que solventen estas desventajas. El interés de la presente tesis es diseñar una quimioteca combinatoria de análogos al AMD3100 con menor basicidad, que incorporen en su estructura las principales características de este compuesto, un linker p­fenilenbismetilénico y sistemas heterocíclicos. A partir de la estructura de los compuestos de la quimioteca diseñada, se desarrollan y validan las rutas sintéticas necesarias para su obtención. Además, se aplican técnicas computacionales de selección de diversidad para explorar el espacio químico representado por los compuestos de la quimioteca. A partir de los compuestos activos identificados en este proceso e inhibidores conocidos del correceptor CXCR4 se desarrollan modelos QSAR y farmacofóricos. Estos modelos se utilizan para realizar un cribado virtual del resto de compuestos de la quimioteca diseñada y aumentar así la probabilidad de seleccionar nuevos compuestos con actividad antiviral. Mediante este procedimiento, se han identificado nuevos inhibidores de CXCR4, uno de ellos con elevada actividad anti-VIH. Además, este compuesto sólo presenta cuatro átomos de nitrógeno en su estructura frente a los ocho del AMD3100. / AIDS is a disease of the immune system caused by the human immunodeficiency virus (HIV). Today, about 33 million people live with this virus. Current antiretroviral therapies consist of combinations of two compound families: reverse transcriptase inhibitors and protease inhibitors, both directed to specific enzymes produced by the HIV. One of the major drawbacks in this antiretroviral treatment is drug resistance, produced by the rapid evolution of the virus. Hence there is a need to develop new anti-HIV drugs which should preferably act on new stages in HIV's life cycle. The discovery of cellular cofactors involved in the entry of HIV to host cells and a better comprehension of envelope proteins controlling the fusion process have renewed the interest in early steps of HIV replication as targets for therapeutic intervention. HIV entry to the cell can be dissected into 4 interrelated steps: virus attachment to the cell surface, virus binding to the CD4 receptor, interaction of the CD4-envelope glycoprotein complex with entry coreceptors and virus-cell fusion. The main HIV entry coreceptors are chemokine receptors CCR5 and CXCR4. In this context, two new drugs have recently been approved, Fuzeon® (Hoffman-La Roche and Trimeris), that blocks fusion of HIV with the cell, and Selzentry® (Pfizer), a CCR5 antagonist. Agents that block CXCR4 have also been identified, with AMD3100 as lead compound. However, the development of this compound has been discontinued due to cardiac toxicity and lack of oral bioavailability related to its high positive charge at physiological pH. Therefore, there is a need to develop new CXCR4 coreceptor inhibitors that will solve these limitations. The aim of this thesis is the design of a combinatorial library of AMD3100 analogues with lower basicity while preserving the main structural features of AMD3100, a p­phenylenic linker and heterocyclic systems. Synthetic routes for these compounds have been developed and validated. Moreover, computational diversity selection techniques have been applied to explore the chemical space represented by the library. Active compounds identified by this process and known CXCR4 inhibitors have been used in QSAR and pharmacophore modelling. Then, virtual screening of the rest of compounds in the library with these models has been applied to increase the probability of selecting new active compounds. This has led to the identification of new CXCR4 inhibitors, one of them showing high anti-HIV activity. Furthermore, the structure of this compound only includes four nitrogen atoms, in contrast to the eight in AMD3100.

El virus de la immunodeficiència humana de tipus 1 (VIH-1) és l'agent que provoca la síndrome de la immunodeficiència adquirida (SIDA). Una malaltia, que va ser descoberta al principi del 80, que pateixen avui en dia entre 31.1 i 35.8 milions d'individus arreu del món i que causa 2.7 milions de nous infectats cada any. Per tot això, i pels gairebé tres milions de morts que provoca cada any de mitjana aquesta malaltia, es considera important intentar bloquejar el virus (VIH-1), un paràsit que utilitza la maquinària metabòlica de la cèl·lula per replicar-se. Actualment, el tractament més comú és el TARGA (tractament antiretroviral de gran activitat), que consisteix en la combinació d'inhibidors de la transcriptasa inversa i de la proteasa, dos enzims vírics necessaris perquè es produeixi la replicació del virus. La principal problemàtica que presenta un virus d'aquestes característiques és la gran quantitat de mutacions que pot patir i, en conseqüència, la resistència que adquireix front als fàrmacs administrats. Per això és de vital importància trobar noves molècules que puguin no només suplir-ne d'altres front a aquest problema sinó que puguin interaccionar sobre noves dianes terapèutiques. No va ser fins al segle XXI que van ser aprovats fàrmacs per altres dianes terapèutiques que no fossin la transcriptasa inversa o la proteasa. Destacant-ne Fuzeon® com a inhibidor de fusió entre les membranes del VIH i la cèl·lula hoste i Selzentry® com a inhibidor de CCR5, un dels dos coreceptors d'entrada que pot emprar el virus per infectar la cèl·lula. En canvi, encara a dia d'avui no hi ha cap estructura aprovada per inhibir CXCR4, un altre coreceptor d'entrada. D'entre els compostos estudiats contra aquesta diana terapèutica en destaca l'AMD3100, un compost format per dos macrocicles (ciclam) units per un espaiador p-fenilenbismetilènic. Durant les estudis en fases clíniques, es va observar un efecte cardiotòxic i falta de biodisponibilitat oral relacionats amb l'elevada càrrega positiva a pH fisiològic. En el Laboratori de Síntesi de l'IQS, s'ha desenvolupat una família de tetraamines anàlogues del AMD3100 amb les quals, conservant l'espaiador i substituint les unitats de ciclam per diamines, s'han aconseguit bones activitats inhibidores de CXCR4. En el present treball es desenvolupen variants d'aquestes tetraamines per modificació de l'espaiador i per substitució dels ciclams per altres sistemes heterocíclics, respectivament. D'altra banda, un dels primers ITINANs (Inhibidor de la Transcriptasa Inversa No Anàleg de Nucleòsid) descoberts va ser l'1-[(2-hidroxietoxi)metil]-6-(feniltio)timina (HEPT). En el Laboratori de Disseny Molecular de l'IQS es va seleccionar una quimioteca d'anàlegs d'aquesta estructura i es va proposar una ruta sintètica. Un dels objectius d'aquest treball és doncs, a més d'obtenir anàlegs d'HEPT, confirmar sintèticament la viabilitat de l'itinerari proposat, comprovant que sigui robust, de rendiments elevats i de condicions de reacció prou suaus per poder automatitzar-lo. / El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) es el agente que provoca el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Una enfermedad, que fue descubierta a principios de los 80, que sufren hoy en día entre 31.1 y 35.8 millones de individuos por todo el mundo y que causa 2.7 millones de nuevos infectados cada año. Por todo esto, y por los casi tres millones de muertos que provoca cada año de media esta enfermedad, se considera importante intentar bloquear el virus (VIH-1), un parásito que utiliza la maquinaria metabólica de la célula para replicarse. Actualmente, el tratamiento más común es el TARGA (tratamiento antirretroviral de gran actividad), que consiste en la combinación de inhibidores de la transcriptasa inversa y de la proteasa, dos enzimas víricas necesarias para que se produzca la replicación del virus. La principal problemática que presenta un virus de estas características es la gran cantidad de mutaciones que puede sufrir y, en consecuencia, la resistencia que adquiere frente a los fármacos administrados. Por eso es de vital importancia encontrar nuevas moléculas que puedan no sólo suplir a otras frente a este problema sino que puedan interaccionar sobre nuevas dianas terapéuticas. No fue hasta al siglo XXI que fueron aprobados fármacos para otras dianas terapéuticas que no fuesen la transcriptasa inversa o la proteasa. Destacan Fuzeon® como inhibidor de fusión entre membranas del VIH y la célula huésped y Selzentry® como inhibidor de CCR5, uno de los dos correceptores de entrada que puede usar el virus para infectar la célula. En cambio, aún a día de hoy no hay ninguna estructura aprobada para inhibir CXCR4, otro correceptor de entrada. De entre los compuestos estudiados contra esta diana terapéutica destaca el AMD3100, un compuesto formado por dos macrociclos (ciclam) unidos por un espaciador p-fenilenbismetilénico. Durante los estudios en fases clínicas, se observó un efecto cardiotóxico y falta de biodisponibilidad oral relacionados con la elevada carga positiva a pH fisiológico. En el Laboratorio de Síntesis del IQS, se ha desarrollado una familia de tetraaminas análogas al AMD3100 con las cuales, conservando el espaciador y sustituyendo las unidades de ciclamo por diaminas, se han conseguido buenas actividades inhibidoras de CXCR4. En el presente trabajo se desarrollan variantes de estas tetraaminas por modificación del espaciador y por sustitución de los ciclamos por otros sistemas heterocíclicos, respectivamente. Por otro lado, uno de los primeros ITINANs (Inhibidor de la Transcriptasa Inversa No Análogo de Nucleósido) descubiertos fue el 1-[(2-hidroxietoxi)metil]-6-(feniltio)timina (HEPT). En el Laboratorio de Diseño Molecular del IQS se seleccionó una quimioteca de análogos de esta estructura y se propuso una ruta sintética. Uno de los objetivos de este trabajo es pues, además de obtener análogos de HEPT, confirmar sintéticamente la viabilidad del itinerario propuesto, comprobando que sea robusto, de rendimientos elevados y de condiciones de reacción lo suficientemente suaves para poder automatizarlo. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is the agent which causes acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). A disease that was discovered in the early 80s, that nowadays affects between 31.1 and 35.8 million individuals around the world and causes 2.7 million new infections each year. For all this, and for the nearly three million deaths caused each year on average by this disease, it is considered important to try to block the virus (HIV-1), a parasite which uses the cell's metabolic machinery to replicate. Currently, the most common treatment is HAART (highly active antiretroviral therapy), which is a combination of reverse transcriptase and protease inhibitors, two viral enzymes necessary for virus replication. The main issues presented by this type of virus are the large number of mutations that can occur and, therefore, the resistance it acquires to administered drugs. It is therefore of vital importance to find new molecules which can not only replace others dealing with this problem, but can interact on new therapeutic targets. It was not until the 21st century that drugs interacting with other therapeutic targets, neither reverse transcriptase nor protease, were approved. Emphasizing Fuzeon® as an inhibitor of membrane fusion between HIV and the host cell and Selzentry® as an inhibitor of CCR5, one of the two coreceptor that the virus can use to infect the cell. However, even today there is not an approved structure to inhibit CXCR4, another entry coreceptor. Among the studied compounds against this therapeutic target highlights the AMD3100, a compound formed by two macrocycles (cyclam) linked by a p-phenylenbismethylenic spacer. During clinical trials, there was a cardiotoxic effect and a lack of oral bioavailability associated with its high positive charge at physiological pH. In the Synthesis Laboratory at IQS, a family of tetraamines analogs of AMD3100 which retain the spacer and replace the cyclam units by diamines, have been developed. These compounds showed good CXCR4 inhibitory activity. In this thesis we develop variants of these tetraamines by modification of the spacer and replacement of the cyclams by other heterocyclic systems, respectively. On the other hand, one of the first NNRTIs (Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors) that was discovered was 1-[(2-hydroxyethoxy)methyl]-6-(phenylthio)thymine (HEPT). In the Laboratory of Molecular Design at IQS a chemical library of analogs of this structure was selected and a synthetic route was proposed. Therefore, one objective of this work is to obtain HEPT analogs, confirm the feasibility of the proposed synthetically pathway, checking the robustness of the reactions, that the yields are high and that the reaction conditions are mild enough to automate the process.

Mieloma Múltiplo é a segunda doença com maior prevalência nas doenças malignidades hematológica, incurável com média de sobrevivência de 3-5 anos. MM é uma malignidade das células do plasma caracterizada pela destruição e reabsorção óssea e supressão da formação do osso. A quimiocina SDF-1 (CXCL12) e seu receptor CXCR4 têm um importante papel direcional na migração, homing das células do plasma em mieloma múltiplo e mobilização das células de MM para fora da medula óssea. A talidomida tem sido usada com êxito no tratamento de pacientes com mieloma múltiplo. Neste estudo verificamos o efeito da talidomida na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo e em linhagem de células de mieloma múltiplo humano (RPMI-8226) tratados e sem tratamento de talidomida. Nossos resultamos mostraram uma expressão heterogênea na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 nos pacientes com mieloma múltiplo estudado (n= 79). Entretanto, pacientes com mieloma múltiplo tratados com talidomida mostraram uma baixa expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXC4 quando comparados com pacientes recém diagnosticados para mieloma múltiplo e pacientes com mieloma múltiplo tratados com outros medicamentos. Nossos resultados sugerem que o tratamento com talidomida induz uma baixa regulação na expressão no ligante SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo / Multiple Myeloma (MM) is a second most prevalent hematological malignancy and remains incurable with a median survival of 3-5 years. MM is a plasma cell malignancy characterized by devastating bone destruction due to the enhanced bone resorption and suppressed bone formation. The chemokine stromal-derived factor-1 (SDF-1) and its receptor CXCR4 play an important role in directional migration, homing of plasma cells in multiple myeloma (MM) and mobilization of MM cells out of the bone marrow. The drug thalidomide has been successfully used in the treatment of patients with MM. In this study, we assessed the effect of thalidomide on SDF-1 and CXCR4 expression in MM patients and human myeloma-derived cell line, RPMI 8226 treated with or without thalidomide. A heterogeneous expression pattern of chemokines SDF-1 and CXCR4 receptor were observed for all MM patients studied. However, patients treated with thalidomide showed a significantly decrease in expression of SDF-1 and CXCR4 as compared to newly diagnosed MM patients and MM patients treated with other drugs. RPMI 8226 cell line treated with 10, 20 and 100µM thalidomide also demonstrated decrease in SDF-1 and CXCR4 expression as compared with cell control (RPMI-8226 without thalidomide). Ours results indicate that thalidomide therapy induces down-regulation of CXCR4 and its ligand SDF-1 in multiple myeloma