La phosphoribulokinase (PRK) et la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) sont deux enzymes-clés du cycle de Calvin-Benson. Leurs activités sont régulées par l’intermédiaire de la CP12, une protéine intrinsèquement désordonnée. Au cours de la transition lumière-obscurité, la GAPDH, la CP12 et la PRK forment un complexe supramoléculaire au sein duquel l’activité des enzymes est inhibée. Dans les travaux présentés ici, nous nous sommes intéressés à la formation de ce complexe et à la dynamique de ses composants. Nous avons montré pour la première fois que les résidus cystéine Cys243 et Cys249 de la PRK sont essentiels à la formation du complexe GAPDH-CP12-PRK et qu’ils peuvent former un pont disulfure en présence de CP12. Nous avons également étudié la dynamique de la CP12 en présence de ses partenaires, et observé que la CP12 adopte une conformation beaucoup plus compacte en présence de GAPDH et de PRK. La glutathionylation (formation d’un pont disulfure mixte entre une molécule de glutathion et un résidu cystéine appartenant à une protéine) est une modification post-traductionnelle associée au stress oxydant qui affecte dix enzymes du cycle de Calvin-Benson, y compris la GAPDH et la PRK. Nous avons étudié l’impact de la glutathionylation sur ces enzymes, et montré que l’inactivation de la PRK naît de l’encombrement du site de fixation de l’ATP.Enfin, la dernière partie de ces travaux est centrée sur l’adénylate kinase 3 de C. reinhardtii, une enzyme impliquée dans le métabolisme de l’ATP et qui possède une extension similaire à la CP12. Cette première étude montre que cette extension augmente la stabilité de l’ADK 3 et intervient dans sa glutathionylation. / Phosphoribulokinase (PRK) and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) are two key enzymes of the Calvin-Benson and their activities are redox-regulated through the intervention of CP12, a intrinsically disordered protein. During the light-to-dark transitions, GAPDH, CP12 and PRK form a supramolecular complex in which the enzymes are strongly inhibited; this complex is dissociated during the dark-to-light transition and the active enzymes are released.In the work presented here, we studied the formation of the complex and the dynamics of its components. For the first time, we showed that two cysteine residues of PRK, Cys243 and Cys249, are essential to the assembly of the GAPDH-CP12-PRK complex, and can form a disulfide bridge in presence of CP12.Glutathionylation (the formation of a mixed disulfide bridge linking one glutathione molecule and a cysteine residue from a protein) is a post-translational modification associated with oxidative stress that affects ten of the Calvin-Benson enzymes, including GAPDH and PRK, and we show that the inactivation of PRK by glutathionylation is caused by the blockage of the ATP binding site by glutathione.The last part of this work is centered around adenylate kinase 3 from C. reinhardtii, an enzyme tied to the energetic metabolism of the cells that presents a CP12-like C-terminal extension. Our results suggest that this CP12-like “tail” improve the stability of ADK 3 and participates in tis glutathionylation.

Depuis les révolutions industrielles des années 1700 et 1800, et pendant l'industrialisation des siècles les suivant, une accumulation de composés polluants a eu lieu dans l'atmosphère, principalement due à la combustion de matières fossiles comme le charbon et le pétrole. Outre les polluants directement émis comme les oxydes de souffre et d'azote, des polluants secondaires comme l'ozone se sont accumulés. Aujourd'hui, l'ozone est le troisième gaz responsable du réchauffement climatique, mais est également dangereux pour la santé humaine et responsable de dommages sur la végétation. Depuis les années cinquante, les effets de l'ozone sur les plantes et les réponses de ces dernières ont été étudiés de façon ciblée. Aujourd'hui, avec l'apparition de techniques permettant l'étude globale du transcriptome ou du protéome, il est possible d'aborder le problème d'une façon non biaisée, permettant des études plus complètes du stress. Dans le cadre de ce travail, une étude protéomique des effets de l'ozone sur les processus foliaires du peuplier a été proposée. Cette technique, complétée par des approches biochimiques, physiologiques, et des observations morphologiques, a permis de confirmer certains résultats d'études ciblées, mais également d'émettre des nouvelles hypothèses sur les mécanismes d'action de l'ozone sur le métabolisme du peuplier. En parallèle, l'étude du stress a aussi permis d'éclaircir les changements du métabolisme lors de la croissance de feuilles en conditions de stress et en conditions normales. Dans les pages de ce document, les procédures, résultats et conclusions de ce travail seront présentés en détail / After the industrial revolution of the 1700s and 1800s, and the subsequent industrialization, many pollutants have accumulated in the atmosphere, mainly due to the use of coal and fossil fuels. Besides the primary pollutants such as nitrogen oxides and sulfur oxides, secondary oxides such as ozone started to accumulate. Nowadays, ozone is the third gas involved in global climate change, but is also a major health risk for humans, and induces considerable damage to vegetation. Starting in the 50s, ozone research was based on targeted studies. Nowadays, with the advent of global techniques such as transcriptomics and proteomics, new results can be produced in an unbiased way. In the thesis presented here, a proteomic study of the effects of ozone on poplar leaf processes was carried out. With the help of this technique, complemented with biochemical and physiological approaches and with morphological observations, it was possible to confirm previous results, but also to elaborate new hypotheses concerning the effects of ozone on poplar leaf metabolism. In parallel, studying the stress also allowed to clarify some of the changes that occur in metabolism during leaf development, under stress conditions and under control conditions. In this document, the procedures, results and conclusions obtained during this study are presented in detail

Les biotechnologies sont un outil puissant permettant d’emprunter les circuits biologiques pour produire des composés aux applications multiples (médecine, alimentation, industries…). Les cyanobactéries possèdent des propriétés génétiques et trophiques précieuses pour réduire les coûts et l’empreinte environnementale de ces procédés (photosynthèse, fixation du CO₂, sources d’azote assimilables...). Elles produisent aussi naturellement certaines molécules énergétiques comme le H₂ dont pourraient émerger de nouvelles filières propres de biocarburants. Cependant, une compréhension globale et approfondie de leur physiologie est nécessaire pour concevoir un châssis biologique performant à partir de ces organismes. Elles sont aisément manipulables génétiquement mais présentent une versatilité favorisant la fixation de mutations bénéfiques mais aussi délétères pour leur exploitation à grande échelle. Au cours de ma thèse, j’ai construit et étudié des mutants d’un régulateur de l’assimilation du CO₂ dont l’activation est liée à la photosynthèse. J’ai montré que l’activité du cycle de Calvin synchronise les flux du carbone et le statut rédox de Synechocystis et que sa dérégulation se répercute de manière pléiotropique sur son métabolisme. Plus spécifiquement, je me suis intéressé au déséquilibre carbone/azote dans cette espèce et à son métabolisme de l’urée qui présente un intérêt biotechnologique considérable. J’ai démontré que ce dernier était en compétition avec l’hydrogénase pour l’insertion du nickel dans leurs centres catalytiques respectifs. L’insuffisance de ce métal a permis de sélectionner des mutants de l’uréase tolérant une exposition prolongée à l’urée et conservant une forte capacité de production de H₂ en présence de ce substrat azoté. L’ensemble de ces résultats montre que le métabolisme de Synechocystis peut être détourné au profit de certains processus cellulaires. Les approches « omiques » permettent d’identifier globalement les réponses physiologiques induites ainsi que les leviers biologiques de compensation. Ces travaux sont discutés au regard des implications biotechnologiques de l’instabilité génétique et de la nécessité de renforcer notre compréhension de la plasticité métabolique et génomique des cyanobactéries. / Biotechnology is a powerful tool allowing exploitation of biological circuits to produce compounds with multiple uses (medicine, nutrition, industrial…). Cyanobacteria have valuable genetic and trophic properties which could reduce the costs and the environmental footprint of these processes (photosynthesis, CO₂ fixation, assimilation of diverse nitrogen sources…). They also naturally produce energetic molecules such as H₂ from which new and sustainable biofuels sectors may rise. However, a global and fine understanding of their physiology is required in order to design an efficient biological chassis with these organisms. They are genetically manipulable but also exhibit a strong versatility favoring fixation of mutations that can be either beneficial or harmful to their large-scale cultivation. Over the course of my PhD, I constructed and studied mutants of a CO₂ fixation regulator whose activation is linked to photosynthesis. I showed that the Calvin cycle activity synchronizes carbon fluxes and redox status in Synechocystis and that its deregulation affects the metabolism in a pleiotropic manner. I was specifically interested into the carbon/nitrogen balance in this species and its urea metabolism which is of prime interest in biotechnology. I demonstrated that the latter was in competition with the hydrogenase for the insertion of nickel into their respective catalytic centers. Scarcity of this metal leads to selection of mutants thriving upon prolonged exposure to urea that retained a high capacity of H₂ production in presence of this nitrogenic substrate. This work shows that the metabolism of Synechocystis can be altered in favor of other cellular processes. Omics approaches allow global identification of the physiological responses induced as well as the biological compensation mechanisms. These observations are discussed with regards to biotechnological implications of genetic instability and the need to strengthen our understanding of metabolic and genetic plasticity in cyanobacteria.

A l’heure actuelle, les biocarburants renouvelables et qui ne nuit pas à l'environnement sont à l'étude intensive en raison de l'augmentation des problèmes de santé et de la diminution des combustibles fossiles. H2 est l'un des candidats les plus prometteurs en raison de ses caractéristiques uniques, telles que la densité d'énergie élevée et la génération faible ou inexistante de polluants. Une façon attrayante pour produire la H2 est par les bactéries photosynthétiques qui peuvent capter l'énergie lumineuse pour actionner la production H2 avec leur système de nitrogénase. L'objectif principal de cette étude était d'améliorer le rendement de H2 des bactéries photosynthétiques pourpres non sulfureuses utilisant une combinaison de génie métabolique et le plan des expériences. Une hypothèse est que le rendement en H2 pourrait être améliorée par la redirection de flux de cycle du Calvin-Benson-Bassham envers du système de nitrogénase qui catalyse la réduction des protons en H2. Ainsi, un PRK, phosphoribulose kinase, mutant « knock-out » de Rhodobacter capsulatus JP91 a été créé. L’analyse de la croissance sur des différentes sources de carbone a montré que ce mutant ne peut croître qu’avec l’acétate, sans toutefois produire d' H2. Un mutant spontané, YL1, a été récupéré qui a retenu l'cbbP (codant pour PRK) mutation d'origine, mais qui avait acquis la capacité de se développer sur le glucose et produire H2. Une étude de la production H2 sous différents niveaux d'éclairage a montré que le rendement d’YL1 était de 20-40% supérieure à la souche type sauvage JP91. Cependant, il n'y avait pas d'amélioration notable du taux de production de H2. Une étude cinétique a montré que la croissance et la production d'hydrogène sont fortement liées avec des électrons à partir du glucose principalement dirigés vers la production de H2 et la formation de la biomasse. Sous des intensités lumineuses faibles à intermédiaires, la production d'acides organiques est importante, ce qui suggère une nouvelle amélioration additionnel du rendement H2 pourrait être possible grâce à l'optimisation des processus. Dans une série d'expériences associées, un autre mutant spontané, YL2, qui a un phénotype similaire à YL1, a été testé pour la croissance dans un milieu contenant de l'ammonium. Les résultats ont montré que YL2 ne peut croître que avec de l'acétate comme source de carbone, encore une fois, sans produire de H2. Une incubation prolongée dans les milieux qui ne supportent pas la croissance de YL2 a permis l'isolement de deux mutants spontanés secondaires intéressants, YL3 et YL4. L'analyse par empreint du pied Western a montré que les deux souches ont, dans une gamme de concentrations d'ammonium, l'expression constitutive de la nitrogénase. Les génomes d’YL2, YL3 et YL4 ont été séquencés afin de trouver les mutations responsables de ce phénomène. Fait intéressant, les mutations de nifA1 et nifA2 ont été trouvés dans les deux YL3 et YL4. Il est probable qu'un changement conformationnel de NifA modifie l'interaction protéine-protéine entre NifA et PII protéines (telles que GlnB ou GlnK), lui permettant d'échapper à la régulation par l'ammonium, et donc d'être capable d'activer la transcription de la nitrogénase en présence d'ammonium. On ignore comment le nitrogénase synthétisé est capable de maintenir son activité parce qu’en théorie, il devrait également être soumis à une régulation post-traductionnelle par ammonium. Une autre preuve pourrait être obtenue par l'étude du transcriptome d’YL3 et YL4. Une première étude sur la production d’ H2 par YL3 et YL4 ont montré qu'ils sont capables d’une beaucoup plus grande production d'hydrogène que JP91 en milieu d'ammonium, qui ouvre la porte pour les études futures avec ces souches en utilisant des déchets contenant de l'ammonium en tant que substrats. Enfin, le reformage biologique de l'éthanol à H2 avec la bactérie photosynthétique, Rhodopseudomonas palustris CGA009 a été examiné. La production d'éthanol avec fermentation utilisant des ressources renouvelables microbiennes a été traitée comme une technique mature. Cependant, la plupart des études du reformage de l'éthanol à H2 se sont concentrés sur le reformage chimique à la vapeur, ce qui nécessite généralement une haute charge énergetique et résultats dans les émissions de gaz toxiques. Ainsi le reformage biologique de l'éthanol à H2 avec des bactéries photosynthétiques, qui peuvent capturer la lumière pour répondre aux besoins énergétiques de cette réaction, semble d’être plus prometteuse. Une étude précédente a démontré la production d'hydrogène à partir d'éthanol, toutefois, le rendement ou la durée de cette réaction n'a pas été examiné. Une analyse RSM (méthode de surface de réponse) a été réalisée dans laquelle les concentrations de trois facteurs principaux, l'intensité lumineuse, de l'éthanol et du glutamate ont été variés. Nos résultats ont montré que près de 2 moles de H2 peuvent être obtenus à partir d'une mole d'éthanol, 33% de ce qui est théoriquement possible. / Currently, renewable and environmentally friendly biofuels are under intensive study due to increasing health concerns and diminishing fossil fuels. H2 is one of the most promising candidates due to its unique characteristics, such as a high energy density and low to non-existent generation of pollutants. One attractive way to produce H2 is through photosynthetic bacteria which can capture light energy to drive H2 production with their nitrogenase system. The major aim of this study was to improve H2 yield of the purple non-sulfur photosynthetic bacteria using a combination of metabolic engineering and design of experiments. One hypothesis was that H2 yield could be improved by redirection of Calvin-Benson-Bassham cycle flux to the nitrogenase system which catalyzes the reduction of protons to H2. Thus, a PRK, phosphoribulose kinase, knock out mutant of Rhodobacter capsulatus JP91 was created. Analysis of growth with different carbon sources showed that this mutant could only grow in acetate medium without, however, producing any H2. A spontaneous mutant, YL1, was recovered which retained the original cbbP (encoding PRK) mutation, but which had gained the ability to grow on glucose and produce H2. A study of H2 production under different illumination levels showed that the yield of YL1 was 20-40% greater than the wild type JP91 strain. However, there was no appreciable improvement of the H2 production rate. A kinetic study showed that growth and hydrogen production are strongly linked with electrons from glucose being mostly directed to H2 production and biomass formation. Under low to intermediate light intensities, the production of organic acids was significant, suggesting further improvement of H2 yield is possible by process optimization. In a related series of experiments, another spontaneous mutant, YL2, which has a similar phenotype to YL1, was tested for growth in ammonium-containing media. The results showed that YL2 could only grow with acetate as carbon source, again, without producing any H2. Prolonged incubation in media not supporting growth of YL2 enabled the isolation of two interesting secondary spontaneous mutants, YL3 and YL4. Western blot analysis showed that both strains had constitutive nitrogenase expression under a range of ammonium concentrations. The genomes of YL2, YL3 and YL4 were sequenced in order to find the mutations responsible for this phenomenon. Interestingly, mutations of nifA1 and nifA2 were found in both YL3 and YL4. It is likely that a conformational change of NifA alters the protein-protein interaction between NifA and PII proteins (such as GlnB or GlnK), enabling it to escape regulation by ammonium and thus to be capable of activating nitrogenase transcription in the presence of ammonium. It is not clear how the synthesized nitrogenase is able to maintain its activity since in theory it should also be subject to posttranslational regulation by ammonium. Further evidence could be obtained by studying the transcriptome of YL3 and YL4. An initial study of H2 production by YL3 and YL4 showed that they are capable of much greater hydrogen production than JP91 in ammonium medium, which opens the door for future studies with these strains using ammonium-containing wastes as substrates. Finally, the biological reformation of ethanol to H2 with the photosynthetic bacterium, Rhodopseudomonas palustris CGA009 was examined. Ethanol production with microbial fermentation using renewable resources has been treated as a mature technique. However, most studies of the reformation of ethanol to H2 have focused on chemical steam reforming, which usually requires a high energy input and results in toxic gas emission. Thus biological reformation of ethanol to H2 with photosynthetic bacteria, which can capture light to meet the energy requirement of this reaction, seems to be more promising. A previous study had demonstrated hydrogen production from ethanol, however, the yield or the duration of this reaction were not examined. A RSM (response surface methodology) analysis was carried out in which three key factors, light intensity, ethanol and glutamate concentrations were varied. Our results showed that nearly 2 moles of H2 could be obtained from one mole of ethanol, 33% of what is theoretically possible.