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Bien que la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) soit maintenant une technique mature et très largement popularisée pour des peptides simples, certaines séquences restent encore compliquées à produire, comme les peptides riches en ponts disulfure (DRPs). Ces produits naturels, ligands sélectifs d’un grand nombre de cibles thérapeutiques, sont des outils pharmacologiques de premier ordre et sont considérés comme de bons candidats médicaments. La proportion importante de cystéines dans leur séquence (plus de 10%) leur confère des propriétés remarquables, mais limite aussi leur synthèse,conduisant à des purifications HPLC délicates, associées à des rendements faibles et une pureté médiocre.Dans l’optique de simplifier la production de DRPs par voie chimique, notre but est de proposer une méthode de purification non-chromatographique. Pour cela, nous avons développé un bras N-terminal conçu pour être complètement compatible avec les peptides riches en cystéines: Boc-Cys(Trt)-1-{6-[1,3-diméthyl-2,4,6(1H,3H,5H)trioxopyrimidine-5-ylidène]hexyle}. A la fin de l’élongation sur support solide, ce bras est introduit sélectivement à l'extrémité N-terminale du peptide cible, sans réagir avec les peptides tronqués acétylés qui constituent les principales impuretés de la SPPS. Après coupure de la résine SPPS, le peptide cible est immobilisé sur un second support solide par le biais d’une réaction de ligation chimique native(NCL). Les peptides tronqués sont alors éliminés par simple filtration, puis le peptide cible est relargué en solution par coupure du bras N-terminal. Ayant comme objectif d’élargir par la suite notre stratégie à la synthèse de très longs DRPs via l’assemblage de multiples segments peptidiques par NCLs successives enphase solide, nous avons étudié en détail la stabilité et les conditions de coupure du bras.La méthode a été appliquée à la purification de deux séquences naturelles riches en cystéines et biologiquement pertinentes : AvBD2 (36 AA), un peptide antimicrobien appartenant à la famille des β défensines aviaires et Bv8 (77 AA) un peptide d’amphibien de la famille des prokinéticines. / Although solid phase peptide synthesis (SPPS) is a mature and widely popularized technique for simple peptides, some sequences are still complicated to produce, such as disulfide-rich peptides (DRPs). These natural products are able to selectively bind a wide number of therapeutically relevant targets, hence they are considered as promising drug candidates and pharmacological tools. The large proportion of cysteines in their sequence (more than 10%) confers them remarkable properties, but also limits their synthesis, lead ingto delicate HPLC purifications associated with low yields and poor purity.With the aim to simplify the chemical production of DRPs, we have developed an N-terminal linker: Boc-Cys(Trt)-1-{6-[1,3-dimethyl-2,4,6(1H,3H,5H)trioxopyrimidine-5-ylidene]hexyl}, which can be used for non chromatographiccatch-and-release purifications. It has been designed to be completely compatible with unprotected cysteine-containing peptides. Following solid phase elongation, this linker is selective lyintroduced at the N-terminus of the target peptide, leaving unreacted truncated acetylated peptides which are the main co-products of SPPS. After cleavage from the SPPS resin, the target peptide is immobilized on a second solid support through native chemical ligation (NCL). The truncated peptides are then removed by simple filtration. Cleavage of the linker finally releases the purified peptide into solution.Having in mind the future extension our strategy to the synthesis of very long DRPs through successive solid-supported NCLs of multiple peptide segments, we have studied in detail the stability and cleavage conditions of the N-terminal linker.To explore the scope and limitations of the method, it has been applied to the purification of two biologically-relevant cysteine-rich peptide sequences: chicken AvBD2 (36 AA), a β defensin antimicrobial peptide, and Bv8 (77 AA), a prokineticin-like peptide from yellow-bellied toad.

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<p>Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a lethal cancer in part due to inherent resistance to chemotherapy, including the first-line drug gemcitabine. Gemcitabine is a nucleoside pyrimidine analog that has long been the backbone of chemotherapy for PDAC, both as a single agent, and more recently, in combination with nab-paclitaxel. Since gemcitabine is hydrophilic, it must be transported through the hydrophobic cell membrane by transmembrane nucleoside transporters. Human equilibrative nucleoside transporter-1 (hENT1) and human concentrative nucleoside transporter-3 (hCNT3) both have important roles in the cellular uptake of the nucleoside analog gemcitabine. While low expression of hENT1 and hCNT3 has been linked to gemcitabine resistance clinically, mechanisms regulating their expression in the PDAC tumor microenvironment are largely unknown. We identified that the matricellular protein Cysteine-Rich Angiogenic Inducer 61 (CYR61) negatively regulates expression of hENT1 and hCNT3. CRISPR/Cas9-mediated knockout of CYR61 significantly increased expression of hENT1 and hCNT3 and cellular uptake of gemcitabine. CRSIPR-mediated knockout of CYR61 sensitized PDAC cells to gemcitabine-induced apoptosis. Conversely, adenovirus-mediated overexpression of CYR61 decreased hENT1 expression and reduced gemcitabine-induced apoptosis. We demonstrate that CYR61 is expressed primarily by stromal pancreatic stellate cells (PSCs) within the PDAC tumor microenvironment, with Transforming Growth Factor- β (TGF-β) inducing the expression of CYR61 in PSCs through canonical TGF-β-ALK5-Smad signaling. Activation of TGF-β signaling or expression of CYR61 in PSCs promotes resistance to gemcitabine in an in vitro co-culture assay with PDAC cells. Our results identify CYR61 as a TGF-β induced stromal-derived factor that regulates gemcitabine sensitivity in PDAC and suggest that targeting CYR61 may improve chemotherapy response in PDAC patients.</p> / Dissertation

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Strikt anaerobe Bakterien wie Clostridium difficile und C. scatologenes verwenden GRE, um die chemisch ungünstige Decarboxylierung von 4-Hydroxyphenylacetat zu p-Cresol zu katalysieren. Das Enzymsystem besteht aus einer Decarboxylase und dem zugehörigen Aktivierungsenzym. Die 4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase (4Hpad) besitzt zusätzlich zum Protein-basierten Glycinradikal eine weitere Untereinheit mit bis zu zwei [4Fe-4S] Clustern und repräsentiert hierdurch eine neue Klasse von Fe/S-Cluster-haltigen GREs, die aromatische Verbindungen umsetzen. Das Aktivierungsenzym (4Hpad-AE) weicht vom Standardtypus ab, indem es zusätzlich zum S-Adenosylmethionin(SAM)-bindenden [4Fe-4S]-Cluster (RS-Cluster) mindestens einen weiteren [4Fe-4S]-Cluster bindet. In dieser Studie wurden heterologe Expressions- und Reinigungsprotokolle für 4Hpad und 4Hpad-AE entwickelt. Kristallstrukturen von 4Hpad cokristallisiert mit den Substraten (4-Hydroxyphenylacetat, 3,4-Dihydroxyphenylacetat) und dem Inhibitor (4-Hydroxyphenylacetamid) zeigten geringe strukturelle Änderungen im aktiven Zentrum des Proteins. Die Radikalbildung am 4Hpad-AE wurde durch die Überprüfung einer klassischen reduktiven Spaltung von SAM zu den Reaktionsprodukten 5’-Deoxyadenosin und Methionin bestätigt. EPR- und Mössbauer-Spektroskopische Analysen zeigten, dass 4Hpad-AE mindestens einen zusätzlichen [4Fe-4S] Cluster neben dem einzelnen RS-Cluster enthält. Die katalytische Notwendigkeit eines zusätzlichen Clusters wurde durch eine Mutationsanalyse untersucht, wobei eine verkürzte Version des Enzyms ohne die zusätzliche Cystein-reiche Insertion konstruiert wurde. Das verkürzte Mutante ohne die Bindungsmotive für die zusätzlichen Cluster gekennzeichnet, die Konfiguration, Stöchiometrie und die Funktion der zusätzlichen Cluster diagnostizieren. / 4-hydroxyphenylacetate decarboxylase (4Hpad) is a two [4Fe-4S] cluster containing glycyl radical enzyme proposed to use a glycyl/thiyl radical dyad to catalyze the last step of tyrosine fermentation in Clostridium difficile and C. scatologenes by a Kolbe-type decarboxylation. The decarboxylation product p-cresol is a virulence factor of the human pathogen C. difficile. The small subunit of 4Hpad may have a regulatory function with the Fe/S clusters involved in complex formation and radical dissipation in the absence of substrate. The respective activating enzyme (4Hpad-AE) has one or two [4Fe-4S] cluster(s) in addition to the SAM-binding [4Fe-4S] cluster (RS cluster). The role of these auxiliary clusters is still under debate with proposed functions including structural integrity and conduit for electron transfer to the RS cluster. This study shows the optimized expression and purification protocols for the decarboxylase and the co-crystallization experiments and binding studies with 4-hydroxy-phenylacetate and 3,4-dihydroxyphenylacetate and with the inhibitor 4-hydroxy-phenylacetamide. The purification and characterization of active site mutants of decarboxylase are also done. Concerning 4-HPAD-AE, we report on the purification of code-optimized variants, and on spectroscopic and kinetic studies to characterize the respective i) SAM binding enthalpies, ii) rates for reductive cleavage of SAM and iii) putative functions of the additional Fe/S clusters. The truncated mutant lacking the binding motifs for the auxiliary clusters is characterized to diagnose the configuration, stoichiometry and function of the auxiliary clusters.

Chez les plantes à fleurs, l’ovaire est l’organe reproducteur femelle et il interagit de façon importante avec les gamètes mâles durant la croissance, le guidage, la réception et la rupture du tube pollinique ainsi que la fusion des gamètes. Le processus débute lorsque de nombreux gènes de l’ovule sont activés à longue distance lors de la réception du pollen sur le stigmate. Afin d’explorer les signaux provenant de l’ovule ayant un impact important sur les interactions pollen–pistil, particulièrement les molécules sécrétées impliquées dans la signalisation espècespécifique, l’expression génique des ovules sous forme d’ARNm ainsi et la sécrétion protéique ont été étudiées chez Solanum chacoense, une espèce diploïde de pomme de terre sauvage. S. chacoense a subi beaucoup d’hybridation interspécifique avec d’autres espèces sympathiques de solanacées, facilitant ainsi grandement l’étude des interactions pollen–ovule de façon espècespécifique ainsi que leur évolution. Dans ce projet, des ovules provenant de trois conditions différentes ont été comparés: des ovules matures de type sauvage, des ovules légèrement immatures, récoltés deux jours avant l’anthèse et des ovules provenant du mutant frk1 pour lesquels le sac embryonnaire est absent. Un séquençage d’ARN à haut débit a d’abord été effectué sur les ovules de type sauvage de S. chacoense afin de générer un assemblage de référence comprenant 33852 séquences codantes. D’autres séquençages ont été effectués sur les trois conditions d’ovules et sur les feuilles afin de faire une analyse d’expression différentielle des gènes. En comparaison avec les ovules de type sauvage, 818 gènes sont réprimés dans les ovules du mutant frk1. Un sous-groupe de 284 gènes, étaient également sous-exprimés dans les ovules légèrement immatures, suggérant un rôle spécifique dans les stades tardifs de la maturation du sac embryonnaire (stade de développent FG6 à FG7) ainsi que du guidage du tube pollinique, puisque ni les ovules du mutant frk1 ni ceux légèrement immatures ne sont capables d’attirer les tubes polliniques lors d’essais de croissance semi in vivo. De plus, 21% de ces gènes sont des peptides riches en cystéines (CRPs). En utilisant un transcriptome assemblé de novo provenant de deux proches parents de S. chacoense, S. gandarillasii et S. tarijense, une analyse d’orthologie a été effectuée sur ces CRPs, révélant une grande variabilité et une évolution rapide chez les solanacées. De nouveaux motifs de cystéine uniques à cette famille ont également été découverts. En comparant avec des études similaires chez Arabidopsis, le sac embryonnaire de S. chacoense montre un transcriptome fortement divergent, particulièrement en en ce qui a trait à la catégorisation fonctionnelle des gènes et de la similarité entre les gènes orthologues. De plus,même si la glycosylation n’est pas requise lors du guidage mycropylaire du tube pollinique chez Arabidopsis, Torenia ou le maïs, des extraits d’ovules glycosylés de S. chacoense sont capables d’augmenter la capacité de guidage de 18%. Cette étude est donc la première à montrer une corrélation entre glycosylation et le guidage du tube pollinique par l’ovule. En complément à l’approche transcriptomique, une approche protéomique portant sur les protéine sécrétées par l’ovule (le secrétome) a été utilisée afin d’identifier des protéines impliquées dans l’interaction entre ovule et tube pollinique. Des exsudats d’ovules matures (capables d’attirer le tube pollinique) et d’ovules immatures (incapables d’attirer le tube pollinique) ont été récoltés en utilisant une nouvelle méthode d’extraction par gravité permettant de réduire efficacement les contaminants cytosoliques à moins de 1% de l’échantillon. Un total de 305 protéines sécrétées par les ovules (OSPs) ont été identifiées par spectrométrie de masse, parmi lesquelles 58% étaient spécifiques aux ovules lorsque comparées avec des données de protéines sécrétées par des tissus végétatifs. De plus, la sécrétion de 128 OSPs est augmentée dans les ovules matures par rapport aux ovules immatures. Ces 128 protéines sont donc considérées en tant que candidates potentiellement impliquées dans la maturation tardive de l’ovule et dans le guidage du tube pollinique. Cette étude a également montré que la maturation du sac embryonnaire du stade FG6 au stade FG7 influence le niveau de sécrétion de 44% du sécrétome total de l’ovule. De façon surprenante, la grande majorité (83%) de ces protéines n’est pas régulée au niveau de l’ARN, soulignant ainsi l’importance de cette approche dans l’étude du guidage du tube pollinique comme complément essentiel aux études transcriptomiques. Parmi tous les signaux sécrétés par l’ovule et reliés au guidage, obtenus à partir des approches transcriptomiques et protéomiques décrites ci-haut, nous avons spécifiquement évalué l’implication des CRPs dans le guidage du tube pollinique par l’ovule chez S. chacoense, vu l’implication de ce type de protéine dans les interactions pollen-pistil et le guidage du tube pollinique chez d’autres espèces. Au total, 28 CRPs étaient présentes dans les ovules capables d’attirer le tube pollinique tout en étant absentes dans les ovules incapables de l’attirer, et ce, soit au niveau de l’ARNm et/ou au niveau du sécrétome. De celles-ci, 17 CRPs ont été exprimées dans un système bactérien et purifiées en quantité suffisante pour tester le guidage. Alors que des exsudats d’ovules ont été utilisés avec succès pour attirer par chimiotactisme le tube pollinique, les candidats exprimés dans les bactéries n’ont quant à eux pas été capables d’attirer les tubes polliniques. Comme l’utilisation de systèmes d’expression hétérologue eucaryote peut permettre un meilleur repliement et une plus grande activité des protéines, les candidats restants seront de nouveau exprimés, cette fois dans un système de levure ainsi que dans un système végétal pour produire les peptides sécrétés. Ceux-ci seront ensuite utilisés lors d’essais fonctionnels pour évaluer leur capacité à guider les tubes polliniques et ainsi isoler les attractants chimiques responsable du guidage du tube pollinique chez les solanacées comme S. chacoense. / In flowering plants, the ovary is the female reproductive organ that interacts extensively with the male gametophyte during pollen tube (PT) growth, guidance, reception, discharge and gamete fusion. The process begins when numerous ovule-expressed genes are activated when pollen lands on the stigma. To explore the ovular signals that have a great impact on successful pollen–pistil interactions, especially the secreted molecules that mediate species-specific signalling events, ovule mRNA expression and protein secretion profiles were studied in Solanum chacoense, a wild diploid potato species. Solanum chacoense has undergone extensive interspecific hybridization with sympatric solanaceous species that greatly facilitates the study of species-specific pollen–ovule interactions and evolution. In this project, three ovule conditions were studied: wild-type mature ovules, slightly immature ovules at two days before anthesis (2DBA), and frk1 mutant ovules that lack an embryo sac (ES). RNA-seq was performed on S. chacoense ovules to provide a scaffold assembly comprising 33852 CDS-containing sequences, then to provide read counts for differential gene expression analyses on three ovule conditions as well as on leaf. Compared to wild-type ovules, 818 genes were downregulated in frk1 ovules. A subset of 284 genes was concurrently under-expressed in 2DBA ovules, suggestive of their specific involvement in late stages of ES maturation (female gametophyte (FG), FG6 to FG7 developmental stage), as well as in PT guidance processes, as neither frk1 nor 2DBA ovules attract semi in vivo-grown PTs. Of these 284, 21% encoded cysteine-rich peptides (CRPs). Using de novo assembled ovule transcriptomes of two close relatives, S. gandarillasii and S. tarijense, an orthology survey was conducted on these CRPs, revealing their highly polymorphic nature among species and rapid evolution. Interestingly, novel cysteine motifs unique to this family were also uncovered. As compared to parallel studies in Arabidopsis, S. chacoense was found to possess a highly divergent ES transcriptome, in terms of both functional categories and individual ortholog similarities. Although glycosylation is not required for micropylar guidance cues to attract PTs in Arabidopsis, Torenia or maize, glycosylated ovule extracts from S. chacoense showed enhanced PT guidance competency by 18%. This is the first time a positive regulation between glycosylation and ovular PT guidance has been observed. As a complement to the transcriptomic approach, a proteomic approach using secreted proteins from the ovule (secretome) was employed to identify proteins involved in pollen–pistil interactions. Ovule exudates were collected from mature ovules (PT attracting) and immature ovules at 2DBA (PT nonattracting), using a novel tissue free-gravity extraction method (tf-GEM), which efficiently reduced the cytosolic contamination to less than 1%. Through mass spectrometry analyses, a total of 305 ovule-secreted proteins (OSPs) were identified, of which 58% were considered ovule-specific when compared to secretome studies conducted in other plant tissues. The secretion of 128 OSPs was upregulated in mature ovules vs. immature ovules. These OSPs were considered as candidate proteins involved in late ovule maturation and PT guidance. This study demonstrated that the ES maturation from FG6 to FG7 stages influenced the secretion status of 44% of ovule secretome. Surprisingly, the majority (83%) of these proteins were not regulated at the RNA level, vindicating this novel approach in the study of PT guidance as a robust complement to transcriptomic studies. Among all identified guidance-related ovular signals from the transcriptomic and proteomic approaches described above, we focused on the evaluation of the involvement of CRPs in ovular PT guidance of S. chacoense, due to the implication of various CRPs in pollen–pistil interactions and, especially, in PT guidance. A total of 28 CRPs were present in PT attracting ovules while being low or absent in nonattracting ovules, at the mRNA and/or protein secretion levels. Of these, 17 CRPs were expressed in bacteria and purified in sufficient amount for PT guidance assays. However, while ovule exudates were shown to induce PT chemotropism in the bead assay, refolded candidates did not show guidance competency. Since the use of eukaryotic protein expression systems might lead to better refolding and higher protein activity, the remaining candidates will be expressed in both yeast and plant-based expression systems and tested for their ability to attract PTs in a semi in-vivo assay, in order to lead us toward the isolation of PT guidance chemoattractants in solanaceous species like S. chacoense.