No description available.

Plants have developed intricate mechanisms to control growth in response to a variety of environmental cues, to compensate its immobility and to survive in both normal and adverse conditions. The TCP proteins are a family of plant-specific, basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors that involve in different aspects in plant growth and developmental control. The Arabidopsis TCP20 has been shown to involve in coordinating cell growth and proliferation, and in growth arrest in response to DNA double-stranded breaks (DSB). In this thesis, the main interest is to examine the function of Arabidopsis TCP6, which shares the highest homology with TCP20, and like TCP20, contains a putative ATM phosphorylation motif that suggests potential involvement in the ATM/ATR-mediated DSB responses. Expressional analysis including transcript measurement and reporter gene tagging demonstrated that TCP6 is expressed in flowers, in particular in the first mitotic event of pollen and ovule/embryo sac development, indicating that TCP6 potentially involves in regulating the mitotic cell cycle during gametophyte development. Yet no gametophytic or fertility-affecting mutant phenotype was observed in the tcp6 single and tcp6/tcp20 double mutants, which may be due to high functional redundancy. The tcp6/tcp20 double mutant seedlings exhibited significantly higher growth performances in true leaf growth compared to wild type when treated with gamma radiation, implying that both functional TCP6 and TCP20 are involved in response to gamma radiation-generated DSBs. The work of this thesis provides the first expressional and functional characterizations of TCP6, with the results suggesting that TCP6 and other class I TCPs play a role in regulating growth under both normal and stress conditions.

Chez les angiospermes, la reproduction passe par la double fécondation. Le tube pollinique délivre deux cellules spermatiques au sein du gamétophyte femelle. Une cellule féconde la cellule œuf pour produire un zygote; l’autre féconde la cellule centrale pour produire l’endosperme. Pour assurer un succès reproductif, le développement du gamétophyte femelle au sein de l’ovule doit établir un patron cellulaire qui favorise les interactions avec le tube pollinique et les cellules spermatiques. Pour ce faire, un dialogue doit s’établir entre les différentes cellules de l’ovule lors de son développement, de même que lors de la fécondation. D’ailleurs, plusieurs types de communications intercellulaires sont supposées suite à la caractérisation de plusieurs mutants développementaux. De même, ces communications semblent persister au sein du zygote et de l’endosperme pour permettre la formation d’un embryon viable au sein de la graine. Malgré les développements récents qui ont permis de trouver des molécules de signalisation supportant les modèles d’interactions cellulaires avancés par la communauté scientifique, les voies de signalisation sont de loin très incomplètes. Dans le but de caractériser des gènes encodant des protéines de signalisation potentiellement impliqués dans la reproduction chez Solanum chacoense, l’analyse d’expression des gènes de type RALF présents dans une banque d’ESTs (Expressed Sequence Tags) spécifiques à l’ovule après fécondation a été entreprise. RALF, Rapid Alcalinization Factor, est un peptide de 5 kDa qui fait partie de la superfamille des «protéines riches en cystéines (CRPs)», dont les rôles physiologiques au sein de la plante sont multiples. Cette analyse d’expression a conduit à une analyse approfondie de ScRALF3, dont l’expression au sein de la plante se limite essentiellement à l’ovule. L’analyse de plantes transgéniques d’interférence pour le gène ScRALF3 a révélé un rôle particulier lors de la mégagamétogénèse. Les plantes transgéniques présentent des divisions mitotiques anormales qui empêchent le développement complet du sac embryonnaire. Le positionnement des noyaux, de même que la synchronisation des divisions au sein du syncytium, semblent responsables de cette perte de progression lors de la mégagamétogénèse. L’isolement du promoteur de même que l’analyse plus précise d’expression au sein de l’ovule révèle une localisation sporophytique du transcrit. La voie de signalisation de l’auxine régule également la transcription de ScRALF3. De surcroît, ScRALF3 est un peptide empruntant la voie de sécrétion médiée par le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. En somme, ScRALF3 est un important facteur facilitant la communication entre le sporophyte et le gamétophyte pour amener à maturité le sac embryonnaire. L’identification d’un orthologue potentiel chez Arabidopsis thaliana a conduit à la caractérisation de AtRALF34. L’absence de phénotype lors du développement du sac embryonnaire suggère, cependant, de la redondance génétique au sein de la grande famille des gènes de type RALF. Néanmoins, les peptides RALFs apparaissent comme d’importants régulateurs lors de la reproduction chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana. / In angiosperms, reproduction occurs through double fertilization. The pollen tube delivers two sperm cells into the female gametophyte. A first sperm cell fertilizes the egg cell to produce a zygote, while the other fertilizes the central cell to produce the endosperm. To ensure reproductive success, the development of the female gametophyte within the ovule must establish a cellular pattern allowing interaction with the pollen tube and sperm cells. To this end, a dialogue must be established amongst the various cells of the ovule during its development, as well as during fertilization. Several types of communication are suggested by the analysis of developmental mutants. These communications must persist in the zygote and endosperm to allow the formation of a viable embryo within the seed. Recent developments have helped to find signaling molecules that support cell interaction models developed by the scientific community, but the signaling pathways are far from complete. In order to characterise genes encoding signaling proteins which are potentially active during reproduction in Solanum chacoense, I undertook the expression analysis of the RALF-like genes present in a bank of ESTs (Expressed Sequence Tags) specific to the ovule after fertilization. RALF, Rapid Alcalinization Factor, is a 5 kDa peptide that is part of the superfamily of Cysteine Rich Proteins (CRPs), which play a wide variety physiological roles within the plant. This expression analysis led to a detailed analysis of ScRALF3, whose expression in the plant is largely restricted to the ovule. The analysis of ScRALF3 RNAi transgenic plants revealed a function during megagametogenesis. The transgenic plants exhibit abnormal mitotic divisions that prevent the maturity of the embryo sac. The positioning of the nuclei, as well as the timing of divisions in the syncytium, appear to be responsible for the arrest of development during megagametogenesis. Isolation of the promoter as well as more accurate analysis of transcript expression reveals localisation within the ovule sporophytic tissue. The auxin signaling pathway is also involved in the regulation of ScRALF3 expression. ScRALF3 is a secreted peptide passing via the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. In summary, ScRALF3 may be an important factor facilitating communication between the gametophyte and the sporophyte to allow maturation of the embryo sac. The identification of a potential orthologue in Arabidopsis thaliana led to the characterisation of AtRALF34. The lack of a phenotype during embryo sac development, however, suggests that genetic redundancy within the family of RALF-like genes is very complex. Nevertheless, the RALF peptides appear to be important regulators during reproduction in Solanum chacoense and Arabidopsis thaliana.

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Le gène Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) code pour une protéine de la famille des MAPKK kinases exprimée spécifiquement dans les ovules. Son transcrit s’accumule principalement dans la zone micropylaire du sac embryonnaire à l’anthèse et diminue rapidement après pollinisation. Ces résultats suggèrent un rôle possible avant ou pendant la fécondation. Bien qu'aucune expression ne soit détectée dans le pollen à maturité, la protéine est cependant présente dans les cellules mères de microspores. Des plantes transgéniques sous-exprimant ScFRK1 ne montrent aucun phénotype au niveau des tissus végétatifs, mais présentent de petits fruits dépourvus de graines. L’étude microscopique du gamétophyte femelle révèle que son développement ne progresse pas au-delà du stade de la mégaspore fonctionnelle et une grande proportion de sacs embryonnaires anormaux est corrélée avec une faible expression de ScFRK1. De plus, la production de pollen viable diminue en fonction de la baisse des niveaux d’expression du gène, ce qui pourrait s’expliquer par un problème au cours de la mitose I. Puisque l’intégrité du sac embryonnaire est essentielle au guidage des tubes polliniques, nous avons conçu un système de guidage semi-in vivo permettant d’évaluer la capacité des ovules du mutant ScFRK1 à les attirer. L’attraction est sévèrement affectée dans de telles conditions, ce qui confirme l'implication des cellules de la zone micropylaire comme source attractive. Notre système nous a également permis de démontrer que le guidage est très spécifique à l’espèce et que cette attraction constitue un mécanisme important favorisant la spéciation et la maintenance des barrières interspécifiques dans la reproduction sexuée des végétaux. / The Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) is a member of plant MAPKKK that is specifically expressed in ovules. ScFRK1 mRNA levels accumulate predominantly in the egg apparatus cells of the embryo sac at mature stage and decrease rapidly following pollination. These results suggest both pre- and post-fertilization roles in ovule development. Although no expression could be detected in mature pollen, FRK1 mRNAs could be detected in pollen mother cells. Transgenic plants expressing sense or antisense ScFRK1 showed no abnormal phenotype in vegetative tissues but produced seedless fruits upon pollination. A microscope-based examination of developing female gametophytes revealed that its formation did not progress further than the functional megaspore stage in affected transgenic plants and, as the levels of ScFRK1 mRNA decreased, the percentage of normal embryo sacs declined. Surprisingly, even in severely affected plants producing no or very few embryo sacs, pollination led to the production of parthenocarpic fruits. Similarly, viable pollen production declined with decreasing levels of ScFRK1 and this could be linked to affected mitosis I. Since embryo sac integrity is a prerequisite for pollen tube guidance, we devised a semi-in vivo pollen tube growth system to assess the ability of the ScFRK1 mutant ovules to attract pollen tubes. As expected, guidance was severely affected, confirming the involvement of the egg apparatus cells as the source of attracting molecules. Attraction was also determined to be highly species-specific and developmentally-regulated with the acquisition of attraction competence on anthesis day.

La coordination du développement par les communications intercellulaires est essentielle pour assurer la reproduction chez les plantes. Plusieurs études démontrent qu’une communication entre le sac embryonnaire et le tissu maternel, le sporophyte, est essentielle au bon développement des gamètes. Les molécules, peptides ou autres protagonistes impliqués dans ces voies de signalisation ainsi que leur mode d’action restent toutefois nébuleux. Les gènes de type RALF codent pour des petits peptides sécrétés retrouvés de manière spécifique ou ubiquitaire dans la plante. Leur structure en font de parfaits candidats pour permettre ces communications cellule-cellule entre les différents tissus. Treize gènes de type RALF ont été isolés actuellement chez la pomme de terre sauvage Solanum chacoense. Maintenant, nous montrons qu’un de ceux-ci, ScRALF3, est impliqué dans la polarisation du sac embryonnaire et dans la synchronicité des divisions mitotiques assurant la formation d’un gamétophyte femelle mature fonctionnel. Étant exprimé de manière spécifique au niveau des téguments de l’ovule, ScRALF3 est un candidat idéal pour réguler les communications cellule-cellule entre le sporophyte et le sac embryonnaire. / Development coordination through intercellular communication is essential for plant reproduction. Several studies show that communication between embryo sac and maternal tissue, the sporophyte, is essential to the development of gametes. These molecules, peptides or other actors involved in these signaling pathways and their mode of action remains unclear. Genes encoding small secreted RALF peptides specifically or ubiquitously expressed throughout the plant are good candidates to allow these cell-cell communications. Thirteen RALF-like genes have been isolated at present from the wild potato Solanum chacoense. Now, we show that one of these, ScRALF3, is involved in the polarization of the embryo sac and the synchronicity of mitotic divisions to ensure the formation of a functional mature female gametophyte. Since it is specifically expressed in the integument of the ovule, ScRALF3 is an ideal candidate to regulate cell-cell communication between the sporophyte and the gametophyte, e.g., the embryo sac.

La coordination du développement par les communications intercellulaires est essentielle pour assurer la reproduction chez les plantes. Plusieurs études démontrent qu’une communication entre le sac embryonnaire et le tissu maternel, le sporophyte, est essentielle au bon développement des gamètes. Les molécules, peptides ou autres protagonistes impliqués dans ces voies de signalisation ainsi que leur mode d’action restent toutefois nébuleux. Les gènes de type RALF codent pour des petits peptides sécrétés retrouvés de manière spécifique ou ubiquitaire dans la plante. Leur structure en font de parfaits candidats pour permettre ces communications cellule-cellule entre les différents tissus. Treize gènes de type RALF ont été isolés actuellement chez la pomme de terre sauvage Solanum chacoense. Maintenant, nous montrons qu’un de ceux-ci, ScRALF3, est impliqué dans la polarisation du sac embryonnaire et dans la synchronicité des divisions mitotiques assurant la formation d’un gamétophyte femelle mature fonctionnel. Étant exprimé de manière spécifique au niveau des téguments de l’ovule, ScRALF3 est un candidat idéal pour réguler les communications cellule-cellule entre le sporophyte et le sac embryonnaire. / Development coordination through intercellular communication is essential for plant reproduction. Several studies show that communication between embryo sac and maternal tissue, the sporophyte, is essential to the development of gametes. These molecules, peptides or other actors involved in these signaling pathways and their mode of action remains unclear. Genes encoding small secreted RALF peptides specifically or ubiquitously expressed throughout the plant are good candidates to allow these cell-cell communications. Thirteen RALF-like genes have been isolated at present from the wild potato Solanum chacoense. Now, we show that one of these, ScRALF3, is involved in the polarization of the embryo sac and the synchronicity of mitotic divisions to ensure the formation of a functional mature female gametophyte. Since it is specifically expressed in the integument of the ovule, ScRALF3 is an ideal candidate to regulate cell-cell communication between the sporophyte and the gametophyte, e.g., the embryo sac.

Le gène Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) code pour une protéine de la famille des MAPKK kinases exprimée spécifiquement dans les ovules. Son transcrit s’accumule principalement dans la zone micropylaire du sac embryonnaire à l’anthèse et diminue rapidement après pollinisation. Ces résultats suggèrent un rôle possible avant ou pendant la fécondation. Bien qu'aucune expression ne soit détectée dans le pollen à maturité, la protéine est cependant présente dans les cellules mères de microspores. Des plantes transgéniques sous-exprimant ScFRK1 ne montrent aucun phénotype au niveau des tissus végétatifs, mais présentent de petits fruits dépourvus de graines. L’étude microscopique du gamétophyte femelle révèle que son développement ne progresse pas au-delà du stade de la mégaspore fonctionnelle et une grande proportion de sacs embryonnaires anormaux est corrélée avec une faible expression de ScFRK1. De plus, la production de pollen viable diminue en fonction de la baisse des niveaux d’expression du gène, ce qui pourrait s’expliquer par un problème au cours de la mitose I. Puisque l’intégrité du sac embryonnaire est essentielle au guidage des tubes polliniques, nous avons conçu un système de guidage semi-in vivo permettant d’évaluer la capacité des ovules du mutant ScFRK1 à les attirer. L’attraction est sévèrement affectée dans de telles conditions, ce qui confirme l'implication des cellules de la zone micropylaire comme source attractive. Notre système nous a également permis de démontrer que le guidage est très spécifique à l’espèce et que cette attraction constitue un mécanisme important favorisant la spéciation et la maintenance des barrières interspécifiques dans la reproduction sexuée des végétaux. / The Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) is a member of plant MAPKKK that is specifically expressed in ovules. ScFRK1 mRNA levels accumulate predominantly in the egg apparatus cells of the embryo sac at mature stage and decrease rapidly following pollination. These results suggest both pre- and post-fertilization roles in ovule development. Although no expression could be detected in mature pollen, FRK1 mRNAs could be detected in pollen mother cells. Transgenic plants expressing sense or antisense ScFRK1 showed no abnormal phenotype in vegetative tissues but produced seedless fruits upon pollination. A microscope-based examination of developing female gametophytes revealed that its formation did not progress further than the functional megaspore stage in affected transgenic plants and, as the levels of ScFRK1 mRNA decreased, the percentage of normal embryo sacs declined. Surprisingly, even in severely affected plants producing no or very few embryo sacs, pollination led to the production of parthenocarpic fruits. Similarly, viable pollen production declined with decreasing levels of ScFRK1 and this could be linked to affected mitosis I. Since embryo sac integrity is a prerequisite for pollen tube guidance, we devised a semi-in vivo pollen tube growth system to assess the ability of the ScFRK1 mutant ovules to attract pollen tubes. As expected, guidance was severely affected, confirming the involvement of the egg apparatus cells as the source of attracting molecules. Attraction was also determined to be highly species-specific and developmentally-regulated with the acquisition of attraction competence on anthesis day.

La reproduction est un événement crucial pour la vie des plantes. Ce processus nécessite la formation du pollen et des ovules. Les cellules germinales vont subir la méiose puis une succession de mitoses, deux pour le pollen et trois pour l’ovule, ce qui va leur permettre d’acquérir leurs structures finales. Une fois formés, ces deux gamètes doivent se rencontrer. Pour cela, le grain de pollen va germer sur le stigmate puis former le tube pollinique. Le tube pollinique en croissance va traverser les différents tissus femelles et ainsi tracter les deux cellules spermatiques jusqu’à l’ovule, permettant la reproduction. Un important réseau de signalisation cellulaire est nécessaire pour permettre ces événements. Les cascades des Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) sont l’un des réseaux de signalisation les plus étudiés chez les plantes. Ces kinases sont impliquées dans de très nombreux processus développementaux tels que la formation de l’embryon ou des stomates. Pour autant, leurs rôles restent encore peu caractérisés pendant de la fécondation. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle que jouent les MAPK lors de la formation des gamètes mâles et femelles ainsi que lors de la croissance des tubes polliniques. Plusieurs membres de la superfamille des MAPKs ont été caractérisés pour leurs rôles dans la reproduction sexuée des végétaux. De précédents travaux dans le laboratoire de Daniel P. Matton, ont démontré l’implication de deux MAPK Kinases Kinases (MAP3K), la Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) et ScFRK2. Ces deux kinases sont nécessaires pour le développement de l’ovule et du pollen chez S. chacoense, une espèce de pomme de terre sauvage diploïde. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction d’une nouvelle ScFRK, la ScFRK3. Ce troisième membre de la classe des FRKs chez S. chacoense, est, elle aussi, impliquée dans le développement des gamétophytes mâles et femelles. Du patron d’expression jusqu’à l’établissement d’une voie de signalisation potentielle, en passant par la caractérisation phénotypique des mutants, plusieurs expériences ont été réalisées dans le but de comprendre le rôle de ScFRK3 lors de la formation des gamètes chez Solanum chacoense. Nous montrons que la ScFRK3 est impliquée dans la formation du pollen ainsi que celui des ovules. Nous avons ensuite poursuivi nos recherches en affinant le phénotypage du mutant de surexpression ScFRK2. En effet, les précédentes études ont permis de montré que la surexpression de ScFRK2 conduit le primordium ovulaire à la formation de structures carpéloïdes. Pour autant, les ensembles des primordius ovulaires ne sont pas devenu des strutures capéloïde. Nous montrons ici que seulement 10 % des ovules dans l'ovaire sont devenu 4 des carpéloïde. Notre étude montre qu’en plus des structures carpéloïdes, un grand nombre d'ovule n'ont pas de sac embryonnaire à l'anthèse ce qui explique le faible nombre de graines par fruit. L’analyse du développement des sacs embryonnaires monte que la surexpression de ScFRK2 entraine l’arrêt au stade mégaspore fonctionnelle. Ce phénotype est similaire à ce qui a pu être observé dans les lignées ARN interférant pour la ScFRK1 et la ScFRK3. De précédentes études faites chez Arabidopsis thaliana semblent montrer que les membres de la superfamille des MAPK ne sont pas essentiels pour la croissance du tube pollinique. Pour comprendre le rôle que jouent les MAPK dans l’élongation du tube pollinique, nous avons utilisé un inhibiteur des MAP Kinase Kinase (MKK), appelé U0126. La présence de cette drogue dans le milieu de croissance des grains de pollen provoque une diminution de la germination et de l’élongation du tube pollinique. L’utilisation de la méthode semi-in vivo montre une perte de la polarisation de la croissance des tubes polliniques causée par l’inhibition des MKK. La présence de l’inhibiteur conduit à la diminution de la quantité de filaments d’actine ainsi qu’à leur désorganisation à l’apex du tube. L’exocytose est aussi affectée par l’inhibition des MKK. Les cascades MAPK sont nécessaires à la croissance polarisée du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana. Pour finir, nous avons voulu identifier certains membres de la superfamille des MAPK impliqués dans la croissance du tube pollinique. Nous nous sommes intéressés en premier lieu aux orthologues de la famille ScFRK chez Arabidopsis thaliana. Les AtMAP3K19-20-21 sont les orthologues les plus proches de ScFRK3. Ces AtMAP3K sont exprimées lors du développement des grains de pollen et lors de l’élongation de tube pollinique. L’analyse du pollen des différentes lignées mutantes montre qu’en leur absence, le pollen ne présente aucun problème de développement contrairement à ScFRK3. Par contre, les doubles mutants et le triple mutant pour les AtMAP3K19-20-21 montrent une diminution de la capacité de germination. L’élongation du tube pollinique est affectée lors de la mutation d’au moins une des AtMAP3K. Ces deux études démontrent que les MAPK sont essentielles dans la formation et l’élongation du tube pollinique. / Reproduction is a crucial event for plant life. This process requires the formation of pollen and ovules. The germ cells will undergo meiosis and then a succession of mitosis, two for the pollen and three for the ovule, which will allow them to acquire their final structures. Once formed, these two gametes must meet each other. For this, the pollen grain will germinate on the stigmas to form the pollen tube. The growth of the pollen tube will pass through the different female tissues and thus pull the two sperm cells to the ovum for reproduction. An important cellular signaling network is necessary to allow these events to occur. The Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPKs) cascades are one of the most studied signaling networks in plants. These kinases are involved in a wide range of developmental processes such as embryo formation and stomata. However, their roles remain poorly characterized during fertilization. The aim of this project is to better understand the role played by MAPKs during the formation of male and female gametes as well as during the growth of pollen tubes. Several members of the MAPK superfamily have been characterized for their role in the sexual reproduction of plants. Previous work in Daniel P. Matton's laboratory has demonstrated the involvement of two MAPK Kinases (MAP3K), Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) and ScFRK2. These two kinases are necessary for egg and pollen development in S. chacoense, a diploid wild potato species. In a first step, we studied the functionality of a new ScFRK, ScFRK3. This third member of the class of FRKs in S. chacoense, is also involved in the development of male and female gametophytes. From the expression pattern to the establishment of a potential signaling pathway, through the phenotypic characterization of mutants, several experiments have been performed in order to understand the role of ScFRK3 in the formation of gametes in S. chacoense. We show that ScFRK3 is involved in the formation of pollen as well as that of the embryonic sac. We then continued our research by refining the phenotyping of the overexpression mutant ScFRK2. Indeed, previous studies have shown that ScFRK2 overexpression leads the ovular primordium to the formation of carpeloid structures. However, the sets of ovular primordia have not become capeloid structures. We show here that only 10% of the eggs in the ovary have become carpeloid. Our study shows that in addition to the carpeloid structures, a large number of ova do not have an embryonic sac in the anthesis, which explains the low number of seeds per fruit. The analysis of the development of the embryonic sacs shows that 7 overexpression of ScFRK2 leads to the cessation of the functional megaspore stage. This phenotype is similar to what has been observed in interfering RNA lines reducing expression of ScFRK1 and ScFRK3. Previous studies in Arabidopsis thaliana suggest that members of the MAPK superfamily are not essential for pollen tube growth. To understand the role that MAPKs play in pollen tube elongation, we used a MAP Kinase Kinase (MKK) inhibitor called U0126. The presence of this drug in the growth medium of pollen grains causes a decrease in germination and elongation of the pollen tube. The use of the semi in vivo method shows a loss of polarization of the pollen tube growth caused by the inhibition of MKK. The presence of the inhibitor leads to a decrease in the number of actin filaments and their disorganization at the apex of the tube. Exocytosis is also affected by MKK inhibition. We show in this chapter that MAPK cascades are necessary for polarized pollen tube growth in Arabidopsis thaliana. Finally, we wanted to identify some members of the MAPK superfamily involved in pollen tube growth. We were first interested in the ScFRK family orthologs in Arabidopsis thaliana. AtMAP3K19-20-21 are the closest orthologs to ScFRK3. These AtMAP3K are expressed during the development of pollen grains and during the elongation of the pollen tube. Pollen analysis of the different mutant lines shows that in their absence the pollen does not present any development problems unlike ScFRK3. On the other hand, double mutants and triple mutant for AtMAP3K19-20-21 show a decrease in germination capacity. Pollen tube elongation is affected when at least one of the AtMAP3Ks is mutated. These two studies demonstrate that MAPKs are essential for the formation and elongation of the pollen tube and that AtMAP3K19-20-21 participate in these biological processes.

Chez les plantes à fleurs, l’ovaire est l’organe reproducteur femelle et il interagit de façon importante avec les gamètes mâles durant la croissance, le guidage, la réception et la rupture du tube pollinique ainsi que la fusion des gamètes. Le processus débute lorsque de nombreux gènes de l’ovule sont activés à longue distance lors de la réception du pollen sur le stigmate. Afin d’explorer les signaux provenant de l’ovule ayant un impact important sur les interactions pollen–pistil, particulièrement les molécules sécrétées impliquées dans la signalisation espècespécifique, l’expression génique des ovules sous forme d’ARNm ainsi et la sécrétion protéique ont été étudiées chez Solanum chacoense, une espèce diploïde de pomme de terre sauvage. S. chacoense a subi beaucoup d’hybridation interspécifique avec d’autres espèces sympathiques de solanacées, facilitant ainsi grandement l’étude des interactions pollen–ovule de façon espècespécifique ainsi que leur évolution. Dans ce projet, des ovules provenant de trois conditions différentes ont été comparés: des ovules matures de type sauvage, des ovules légèrement immatures, récoltés deux jours avant l’anthèse et des ovules provenant du mutant frk1 pour lesquels le sac embryonnaire est absent. Un séquençage d’ARN à haut débit a d’abord été effectué sur les ovules de type sauvage de S. chacoense afin de générer un assemblage de référence comprenant 33852 séquences codantes. D’autres séquençages ont été effectués sur les trois conditions d’ovules et sur les feuilles afin de faire une analyse d’expression différentielle des gènes. En comparaison avec les ovules de type sauvage, 818 gènes sont réprimés dans les ovules du mutant frk1. Un sous-groupe de 284 gènes, étaient également sous-exprimés dans les ovules légèrement immatures, suggérant un rôle spécifique dans les stades tardifs de la maturation du sac embryonnaire (stade de développent FG6 à FG7) ainsi que du guidage du tube pollinique, puisque ni les ovules du mutant frk1 ni ceux légèrement immatures ne sont capables d’attirer les tubes polliniques lors d’essais de croissance semi in vivo. De plus, 21% de ces gènes sont des peptides riches en cystéines (CRPs). En utilisant un transcriptome assemblé de novo provenant de deux proches parents de S. chacoense, S. gandarillasii et S. tarijense, une analyse d’orthologie a été effectuée sur ces CRPs, révélant une grande variabilité et une évolution rapide chez les solanacées. De nouveaux motifs de cystéine uniques à cette famille ont également été découverts. En comparant avec des études similaires chez Arabidopsis, le sac embryonnaire de S. chacoense montre un transcriptome fortement divergent, particulièrement en en ce qui a trait à la catégorisation fonctionnelle des gènes et de la similarité entre les gènes orthologues. De plus,même si la glycosylation n’est pas requise lors du guidage mycropylaire du tube pollinique chez Arabidopsis, Torenia ou le maïs, des extraits d’ovules glycosylés de S. chacoense sont capables d’augmenter la capacité de guidage de 18%. Cette étude est donc la première à montrer une corrélation entre glycosylation et le guidage du tube pollinique par l’ovule. En complément à l’approche transcriptomique, une approche protéomique portant sur les protéine sécrétées par l’ovule (le secrétome) a été utilisée afin d’identifier des protéines impliquées dans l’interaction entre ovule et tube pollinique. Des exsudats d’ovules matures (capables d’attirer le tube pollinique) et d’ovules immatures (incapables d’attirer le tube pollinique) ont été récoltés en utilisant une nouvelle méthode d’extraction par gravité permettant de réduire efficacement les contaminants cytosoliques à moins de 1% de l’échantillon. Un total de 305 protéines sécrétées par les ovules (OSPs) ont été identifiées par spectrométrie de masse, parmi lesquelles 58% étaient spécifiques aux ovules lorsque comparées avec des données de protéines sécrétées par des tissus végétatifs. De plus, la sécrétion de 128 OSPs est augmentée dans les ovules matures par rapport aux ovules immatures. Ces 128 protéines sont donc considérées en tant que candidates potentiellement impliquées dans la maturation tardive de l’ovule et dans le guidage du tube pollinique. Cette étude a également montré que la maturation du sac embryonnaire du stade FG6 au stade FG7 influence le niveau de sécrétion de 44% du sécrétome total de l’ovule. De façon surprenante, la grande majorité (83%) de ces protéines n’est pas régulée au niveau de l’ARN, soulignant ainsi l’importance de cette approche dans l’étude du guidage du tube pollinique comme complément essentiel aux études transcriptomiques. Parmi tous les signaux sécrétés par l’ovule et reliés au guidage, obtenus à partir des approches transcriptomiques et protéomiques décrites ci-haut, nous avons spécifiquement évalué l’implication des CRPs dans le guidage du tube pollinique par l’ovule chez S. chacoense, vu l’implication de ce type de protéine dans les interactions pollen-pistil et le guidage du tube pollinique chez d’autres espèces. Au total, 28 CRPs étaient présentes dans les ovules capables d’attirer le tube pollinique tout en étant absentes dans les ovules incapables de l’attirer, et ce, soit au niveau de l’ARNm et/ou au niveau du sécrétome. De celles-ci, 17 CRPs ont été exprimées dans un système bactérien et purifiées en quantité suffisante pour tester le guidage. Alors que des exsudats d’ovules ont été utilisés avec succès pour attirer par chimiotactisme le tube pollinique, les candidats exprimés dans les bactéries n’ont quant à eux pas été capables d’attirer les tubes polliniques. Comme l’utilisation de systèmes d’expression hétérologue eucaryote peut permettre un meilleur repliement et une plus grande activité des protéines, les candidats restants seront de nouveau exprimés, cette fois dans un système de levure ainsi que dans un système végétal pour produire les peptides sécrétés. Ceux-ci seront ensuite utilisés lors d’essais fonctionnels pour évaluer leur capacité à guider les tubes polliniques et ainsi isoler les attractants chimiques responsable du guidage du tube pollinique chez les solanacées comme S. chacoense. / In flowering plants, the ovary is the female reproductive organ that interacts extensively with the male gametophyte during pollen tube (PT) growth, guidance, reception, discharge and gamete fusion. The process begins when numerous ovule-expressed genes are activated when pollen lands on the stigma. To explore the ovular signals that have a great impact on successful pollen–pistil interactions, especially the secreted molecules that mediate species-specific signalling events, ovule mRNA expression and protein secretion profiles were studied in Solanum chacoense, a wild diploid potato species. Solanum chacoense has undergone extensive interspecific hybridization with sympatric solanaceous species that greatly facilitates the study of species-specific pollen–ovule interactions and evolution. In this project, three ovule conditions were studied: wild-type mature ovules, slightly immature ovules at two days before anthesis (2DBA), and frk1 mutant ovules that lack an embryo sac (ES). RNA-seq was performed on S. chacoense ovules to provide a scaffold assembly comprising 33852 CDS-containing sequences, then to provide read counts for differential gene expression analyses on three ovule conditions as well as on leaf. Compared to wild-type ovules, 818 genes were downregulated in frk1 ovules. A subset of 284 genes was concurrently under-expressed in 2DBA ovules, suggestive of their specific involvement in late stages of ES maturation (female gametophyte (FG), FG6 to FG7 developmental stage), as well as in PT guidance processes, as neither frk1 nor 2DBA ovules attract semi in vivo-grown PTs. Of these 284, 21% encoded cysteine-rich peptides (CRPs). Using de novo assembled ovule transcriptomes of two close relatives, S. gandarillasii and S. tarijense, an orthology survey was conducted on these CRPs, revealing their highly polymorphic nature among species and rapid evolution. Interestingly, novel cysteine motifs unique to this family were also uncovered. As compared to parallel studies in Arabidopsis, S. chacoense was found to possess a highly divergent ES transcriptome, in terms of both functional categories and individual ortholog similarities. Although glycosylation is not required for micropylar guidance cues to attract PTs in Arabidopsis, Torenia or maize, glycosylated ovule extracts from S. chacoense showed enhanced PT guidance competency by 18%. This is the first time a positive regulation between glycosylation and ovular PT guidance has been observed. As a complement to the transcriptomic approach, a proteomic approach using secreted proteins from the ovule (secretome) was employed to identify proteins involved in pollen–pistil interactions. Ovule exudates were collected from mature ovules (PT attracting) and immature ovules at 2DBA (PT nonattracting), using a novel tissue free-gravity extraction method (tf-GEM), which efficiently reduced the cytosolic contamination to less than 1%. Through mass spectrometry analyses, a total of 305 ovule-secreted proteins (OSPs) were identified, of which 58% were considered ovule-specific when compared to secretome studies conducted in other plant tissues. The secretion of 128 OSPs was upregulated in mature ovules vs. immature ovules. These OSPs were considered as candidate proteins involved in late ovule maturation and PT guidance. This study demonstrated that the ES maturation from FG6 to FG7 stages influenced the secretion status of 44% of ovule secretome. Surprisingly, the majority (83%) of these proteins were not regulated at the RNA level, vindicating this novel approach in the study of PT guidance as a robust complement to transcriptomic studies. Among all identified guidance-related ovular signals from the transcriptomic and proteomic approaches described above, we focused on the evaluation of the involvement of CRPs in ovular PT guidance of S. chacoense, due to the implication of various CRPs in pollen–pistil interactions and, especially, in PT guidance. A total of 28 CRPs were present in PT attracting ovules while being low or absent in nonattracting ovules, at the mRNA and/or protein secretion levels. Of these, 17 CRPs were expressed in bacteria and purified in sufficient amount for PT guidance assays. However, while ovule exudates were shown to induce PT chemotropism in the bead assay, refolded candidates did not show guidance competency. Since the use of eukaryotic protein expression systems might lead to better refolding and higher protein activity, the remaining candidates will be expressed in both yeast and plant-based expression systems and tested for their ability to attract PTs in a semi in-vivo assay, in order to lead us toward the isolation of PT guidance chemoattractants in solanaceous species like S. chacoense.