La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris. Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt. Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement. Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire. / Nature has developed strategies to ensure the beginning of life in conditions of homoplasmy, i.e. cells harboring the same mitochondrial DNA (mtDNA). However, novel mtDNA haplotypes can arise by many means during life, leading to heteroplasmy. For instance, mtDNA heteroplasmy can originate artificially through assisted reproductive technologies and naturally by the process of aging. Therefore, this doctoral thesis was divided into two general objectives: Firstly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) during development from embryos, to fetuses and adult tissues, in cattle. Secondly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy caused by aging in adult germinal and somatic tissues, during oogenesis and early embryogenesis, and in in vitro culture procedures in mice. In the first series of experiments in cattle, fetal fibroblasts carrying an mtDNA mutation (insertion of 66 bp) were fused to host oocytes carrying wild type mtDNA. The presence of mtDNA from the donor cell was analyzed in 30 SCNT clones at different stages of development: 17-day-old embryos (n=17); 40-day-old fetuses (n=3); 60-day-old fetuses (n=3); one 240 day-old fetus; and 3 post-natal clones (18-24 months). Every individual clone proved to be heteroplasmic and 99% (103/104) of the analyzed tissue samples were heteroplasmic as well. Only the ovary coming from a 240 day old fetus was homoplasmic for the mtDNA of the recipient oocyte. In most (95.2%) of the analyzed tissue samples (99/104) the mean of heteroplasmy was 1.46%. In contrast, one 40-day-old fetus presented high levels of heteroplasmy (20.9%) indicating rare events of donor mtDNA increases. Since most SCNT clones showed heteroplasmy at proportions comparable to the donor mtDNA at the moment of embryo reconstruction, we concluded that heteroplasmy produced by nuclear transfer techniques using somatic cells is due to the neutral segregation of the mtDNA. In the second series of experiments, performed in mice, females of different ages, i.e. young (0-8 months), middle (8-16 months) and old (16-24 months), were synchronized (gonadotropins) and sacrificed to obtain germinal vesicle oocytes, metaphase-II oocytes in vivo and in vitro. Also, 2-cell and blastocyst stage embryos were obtained from young females in vivo and in vitro. Somatic tissues from females of the three age periods were obtained: brain, granulosa, liver and muscle and the effect of aging was measured on fertility. The effects of aging, stage of development and in vitro culture on the heteroplasmy were measured in oocytes and embryos. Also, the effects of aging were measured in somatic and germinal tissues on total copies of mtDNA, percentage of mtDNA common deletion and the expression of three genes: Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. We observed that female fertility in the mouse colony decreases with age. Aging affected mtDNA in somatic tissues but no effect was observed in granulosa, oocytes and embryos. MtDNA deletions increased during the resumption of meiosis and decreased during early embryo development; and culture in vitro did not affect the mtDNA in most germinal tissues. Because we did not find effects of age in most mitochondrial parameters analyzed in oocytes and embryos, we suggest that mtDNA common deletion in germinal tissues is more related with the cellular status of energy production than with the process of aging. Two different sources of mutations in the mtDNA generated in normal or reconstructed oocytes produced different heteroplasmy outcomes at the beginning of embryogenesis. In cattle, artificial heteroplasmy involving a small insertion (66 bp) in the non coding region (D-loop) of the mitochondrial DNA was apparently not harmful to the embryo, allowing persistence of the foreign mtDNA during the different stages of clonal development. In mice, the natural heteroplasmy of a large deletion (4974 bp, common deletion) in the coding region of the mtDNA was apparently harmful to the embryo and, therefore, may have been eliminated to ensure homoplasmy at the beginning of embryonic development.

ABP1 (Auxin Binding Protein 1), qui peut se lier à l'auxine, est essentielle pour le développement des plantes. Il a été prouvé qu’elle a la capacité de se lier à l’auxine et de conduire le signal auxine dans les cellules. ABP1 est supposé être localisée et avoir des fonctions à la surface extérieure de la membrane plasmique à travers une composante inconnue. Au cours ma thèse, nous avons essayé d’étudier l'interaction entre ABP1 et le candidat de la composante inconnue, CBP1 (chez le maïs), qui est une protéine à ancres GPI déjà identifiée comme ayant la capacité de liaison au peptide de synthèse C-terminale d’ABP1 en 2006. L'orthologue de CBP1 chez arabidopsis appartient à une famille de gènes contenant 19 membres, dont seulement trois d'entre eux ont été prédit comme était des protéines à ancres GPI. Nous avons fait les caractérisations fonctionnelles de ces trois membres. Les données suggèrent que les protéines SKS à ancres GPI sont impliquées dans l'orientation de la cellule, le développement des gamétophytes et de l'embryon. / ABP1 (Auxin Binding Protein1), who can bind auxin, is essential for the development of plants. It was proved to have the ability to bind auxin and transduce auxin signal into the cells. It is supposed to be localized and functions at the outer surface of plasma membrane through unknown component. In my thesis, we tried to invesitgate the interaction between ABP1 and the candidate of the unknown component, CBP1 (From maize), which is GPI-acnhored and already identified as the binding ability to synthesized C-terminus peptide of ABP1 in 2006. The orthologous of CBP1 in arabidopsis belongs to a gene family with 19 members, in which only three of them were prediceted to be GPI anchored. We did the functional characterisation of these three GPI-anchored members. Data suggested that GPI-anchored SKS were involved in cell orientation, gametophyte and embryo development.

La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris. Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt. Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement. Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire. / Nature has developed strategies to ensure the beginning of life in conditions of homoplasmy, i.e. cells harboring the same mitochondrial DNA (mtDNA). However, novel mtDNA haplotypes can arise by many means during life, leading to heteroplasmy. For instance, mtDNA heteroplasmy can originate artificially through assisted reproductive technologies and naturally by the process of aging. Therefore, this doctoral thesis was divided into two general objectives: Firstly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) during development from embryos, to fetuses and adult tissues, in cattle. Secondly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy caused by aging in adult germinal and somatic tissues, during oogenesis and early embryogenesis, and in in vitro culture procedures in mice. In the first series of experiments in cattle, fetal fibroblasts carrying an mtDNA mutation (insertion of 66 bp) were fused to host oocytes carrying wild type mtDNA. The presence of mtDNA from the donor cell was analyzed in 30 SCNT clones at different stages of development: 17-day-old embryos (n=17); 40-day-old fetuses (n=3); 60-day-old fetuses (n=3); one 240 day-old fetus; and 3 post-natal clones (18-24 months). Every individual clone proved to be heteroplasmic and 99% (103/104) of the analyzed tissue samples were heteroplasmic as well. Only the ovary coming from a 240 day old fetus was homoplasmic for the mtDNA of the recipient oocyte. In most (95.2%) of the analyzed tissue samples (99/104) the mean of heteroplasmy was 1.46%. In contrast, one 40-day-old fetus presented high levels of heteroplasmy (20.9%) indicating rare events of donor mtDNA increases. Since most SCNT clones showed heteroplasmy at proportions comparable to the donor mtDNA at the moment of embryo reconstruction, we concluded that heteroplasmy produced by nuclear transfer techniques using somatic cells is due to the neutral segregation of the mtDNA. In the second series of experiments, performed in mice, females of different ages, i.e. young (0-8 months), middle (8-16 months) and old (16-24 months), were synchronized (gonadotropins) and sacrificed to obtain germinal vesicle oocytes, metaphase-II oocytes in vivo and in vitro. Also, 2-cell and blastocyst stage embryos were obtained from young females in vivo and in vitro. Somatic tissues from females of the three age periods were obtained: brain, granulosa, liver and muscle and the effect of aging was measured on fertility. The effects of aging, stage of development and in vitro culture on the heteroplasmy were measured in oocytes and embryos. Also, the effects of aging were measured in somatic and germinal tissues on total copies of mtDNA, percentage of mtDNA common deletion and the expression of three genes: Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. We observed that female fertility in the mouse colony decreases with age. Aging affected mtDNA in somatic tissues but no effect was observed in granulosa, oocytes and embryos. MtDNA deletions increased during the resumption of meiosis and decreased during early embryo development; and culture in vitro did not affect the mtDNA in most germinal tissues. Because we did not find effects of age in most mitochondrial parameters analyzed in oocytes and embryos, we suggest that mtDNA common deletion in germinal tissues is more related with the cellular status of energy production than with the process of aging. Two different sources of mutations in the mtDNA generated in normal or reconstructed oocytes produced different heteroplasmy outcomes at the beginning of embryogenesis. In cattle, artificial heteroplasmy involving a small insertion (66 bp) in the non coding region (D-loop) of the mitochondrial DNA was apparently not harmful to the embryo, allowing persistence of the foreign mtDNA during the different stages of clonal development. In mice, the natural heteroplasmy of a large deletion (4974 bp, common deletion) in the coding region of the mtDNA was apparently harmful to the embryo and, therefore, may have been eliminated to ensure homoplasmy at the beginning of embryonic development.

La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est un processus incontournable dans de nombreux contextes normaux et pathologiques, tels que gastrulation, organogenèse, fibroses et cancers. Cette transformation de cellule épithéliale en cellule mésenchymateuse est indissociable de l'acquisition de propriétés migratoires et est généralement associée à un changement de destin cellulaire. Différentes voies moléculaires sont impliquées selon le contexte de l'EMT concernée. Récemment, notre laboratoire a mis en évidence que la voie Notch cytoplasmique contrôle l'EMT des cellules de la lèvre dorso-médiale du somite (DML). Les crêtes neurales exprimant DLL1 activent « en passant » le récepteur NOTCH, liberant ainsi le domaine intra-cytoplasmique de NOTCH (NICD). Dans le cytoplasme, NICD inhibe la kinase GSK3ß, conduisant à la stabilisation de SNAIL, un gène maître de la transition épithélio-mésenchymateuse. Il en résulte une libération de la βcaténine des jonctions adhérentes qui, après translocation dans le noyau, active la transcription des gènes de la myogénèse (Myf5). Ainsi, l'activation de la voie Notch cytoplasmique permet une induction concomitante de l'EMT et de la myogénèse. La fonction cytoplasmique de Notch reste controversée et le mécanisme par lequel NICD inhibe GSK3ß reste obscur. Au cours de ma thèse j'ai cherché à élucider le mécanisme par lequel NICD inhibe l'activité kinase de GSK3ß. J'ai confirmé l'interaction de GSK3ß et de NICD en démontrant leur interaction via CoIP. Après avoir démontré l'implication de la sérine-thréonie kinase AKT dans la myogenèse des cellules de la DML, j'ai mis en évidence, via CoIP et électroporation, que l'inhibition GSK3ß par NICD est très certainement médiée par AKT, connue pour être impliquée dans l'EMT et inhiber GSK3ß par phosphorylation. En comparant le NICD1 de poulet et les 4 NICD de souris, j'ai montré que l'expression exogène de ces 5 molécules induit l'EMT et la différenciation myogénique de manière similaire. J'ai aussi montré que parmi des différents domaines de NICD, le domaine RAM, connu pour se lier à l'ADN (via RBPJ), est nécessaire et suffisant à l'inhibition de GSK3ß. Un second axe de ma thèse a été de tester l'implication de la voie Notch cytoplasmique dans d'autres contextes d'EMT. Pour ce faire, j'ai mis en évidence que cette voie est impliquée dans les autres lèvres du dermomyotome mais aussi dans les crêtes neurales qui délaminent du toit du tube neural. J'ai en particulier mis en évidence une co-activation des voies Wnt et Notch, une inhibition de la kinase GSK3ß par NICD cytoplasmique ainsi qu'une inhibition de la différenciation en présence d'une ß-caténine mutée, retenue à la membrane, ou en présence d'une molécule SNAIL2 dominant-négative. Le dernier axe de ma thèse a consisté à élucider le mécanisme de régulation de l'induction de l'EMT et de la myogenèse via l'activation de NICD. Il a été mis en évidence que toutes les cellules de la DML peuvent être activées via DLL1 et que la surexpression massive de NICD dans la DML provoque une différenciation massive et une déplétion du groupe de cellules progénitrices. Afin de déterminer si la régulation de cette initiation se fait avant ou après induction de NICD, j'ai créé un plasmide permettant de répondre à cette question et afin de visualiser son expression in vivo, j'ai initié une collaboration avec une équipe de l'ILM afin de créer un microscope vertical SPIM biphoton permettant l'observation d'embryon de poulets vivants [etc...] / The epithelio-mesenchymal transition (EMT) is a well-known mechanism by which epithelial cells lose their adherent connections and gain migratory properties, associated with a gain of a mesenchymal phenotype. This EMT is required in numerous processes as gastrulation, organogenesis, fibrosis and cancers. Various molecular pathways orchestrate the EMT depending on the EMT biological context. Recently, our laboratory highlighted the implication of the cytoplasmic Notch pathway in the dorso-medial lip (DML) EMT. In the DML tissue, theEMT is synchronized with differentiation pathways, to generate cells forming the primary myotome. Our laboratory showed that neural crests cells expressing DLL1 activate NOTCH receptor of the DML cells, via a “kiss and run” model. This leads to NOTCH cleavage, releasing an activated intra-cytoplasmic NOTCH domain (NICD). In the cytoplasm, NICD inhibits the GSK3ß kinase, leading to the stabilization of SNAIL and the free cytoplasmic ßcatenin. These molecules translocate into the nucleus and lead to the activation of MRF as Myf5 (ß-catenin) and to the repression of adherent genes (SNAIL). Therefore, Notch cytoplasmic pathway allows a synergized induction of both, the EMT and myogenic programs. This pathway remains controversial and the precise mechanism how NICD inhibits GSK3ß needs to be elucidated. Therefore, the aim of my thesis project was to clarify how NICD inhibits GSK3ß activity. First, I confirmed that NICD and GSK3ß physically interact by CoIP. Moreover, I demonstrated that the serin-threonin kinase AKT, known to inhibit GSK3ß by phosphorylation and also to mediate EMT in cancer, can physically interact with NICD in the cytoplasm. I have also shown that AKT mediates the induction of the myogenic program through the inhibitory phosphorylation of GSK3ß and that SNAIL is downstream of AKT. Together, these experiments indicate that AKT mediates, through phosphorylation, the cytoplasmic NICD inhibition of GSK3ß leading to myogenesis. A comparison of the chicken NICD1 and the 4 isoforms of mouse NICD highlighted that these 5 proteins induce EMT and myogenesis similarly. The dissection of the different conserved domains in the 5 different NICD proteins demonstrated that the RAM domain, known to activate transcription by binding to RBPJ, is necessary and sufficient for GSK3ß inhibition. A second axis of the thesis has been to test the involvment of the cytoplasmic Notch pathway in other EMT contexts. First, I highlighted that this pathway induces myogenesis, showing that NICD inhibits GSK3ß activity in the ventro-lateral lip. I further demonstrated that the cytoplasmic Notch pathway is implicated in the EMT and differentiation of the neural crests cells delaminating from the dorsal neural tube. Particularly, I have shown a co-activation of the Wnt and Notch pathway in premigratory and migratory neural crests. Moreover, I demonstrated a cytoplasmic inhibition of the kinase activity of GSK3ß by NICD, as well as the induction of the differentiation by cytoplasmic ß-catenin or SNAIL2. In a third axis of my thesis, I tried to clarify the regulatory mechanism involved in Notch activation. Previously it has been demonstrated that in all the DML cells Notch can be activated by an overexpression of DLL1 and that an ectopic expression of NICD in the DML cells induce a massive differentiation and depletion of the progenitor pool. To determine if the regulation of this initiation of the myogenic program occurs before or after Notch activation, I designed a plasmid to visualize Notch activation in vivo. In order to be able to follow the DLM cells and Notch activation in vivo, I initiated a collaboration with an ILM team to create a vertical SPIM biphoton microscope. In the future, this microscope will allow us to follow cells in living chicken embryos [etc...]

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La consommation d’alcool pendant la grossesse peut entraîner des conséquences néfastes sur le développement de l’enfant et mener aux troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (TSAF). Cependant on en connaît peu sur son effet durant la période de préimplantation. Cette période est reconnue comme étant sensible à l’environnement, majoritairement dû au fait qu’elle est caractérisée par la reprogrammation dynamique des profils de méthylation de l’ADN. L’alcool est reconnu pour altérer les mécanismes impliqués dans les processus de méthylation de l’ADN (e.g., cycle du folate, actions des DNMTs). Récemment, nous avons démontré qu’une exposition prénatale à l’alcool éthylique durant la préimplantation altère les futurs profils de méthylation de l’ADN du cerveau et augmente le nombre de défauts morphologiques à la mi-gestation. Il n’y a présentement aucun traitement pour les TSAF, mais certaines études suggèrent qu’une diète enrichie en donneurs de groupement méthyles (e.g., folate, choline), nécessaires aux réactions de méthylation, pourrait atténuer les effets d’une exposition prénatale à l’alcool. C’est pourquoi nous avons voulu déterminer si une diète enrichie en donneurs de groupements méthyles pouvait apporter une protection aux embryons ayant subi une exposition prénatale à l’alcool durant la préimplantation. Pour ce faire, une diète standard ou enrichie a été donné à des souris 4 semaines avant la gestation et pendant celle-ci. Les femelles gestantes ont reçu une dose d’alcool au jour E2.5, puis nous avons récolté les embryons à E10.5 et E18.5 pour évaluer les anomalies physiques et faire l’analyse de la méthylation des cerveaux antérieurs. Nos résultats démontrent que la diète enrichie prévient ou élimine un certain nombre de défauts morphologiques à E10.5 et E18.5. Nous avons aussi observé que la diète enrichie n’affectait pas la mise en place et le maintien de la méthylation et l’expression des gènes à empreintes durant le développement. La diète enrichie en donneurs de groupements méthyles aide donc à prévenir certains effets nuisibles de l’exposition prénatale à l’alcool survenant durant la préimplantation. / Alcohol consumption during pregnancy can have a significant impact on the development of the child and lead to fetal alcohol spectrum disorders (FASD). Nonetheless, little is known about its effect during the pre-implantation period. However, we know that this period is very sensitive to the environment, mainly because of major reprogramming of DNA methylation patterns. Moreover, alcohol can alter the mechanisms involved in DNA methylation processes (e.g., folate cycle, actions of DNMTs). Recently, we have shown that prenatal alcohol exposure (PAE) during preimplantation alters future DNA methylation patterns of the young embryo brain and increases the number of morphological defects. There is currently no treatment for FASD, but studies suggest that a diet enriched in methyl donors (e.g., folate, choline), which are necessary for methylation reactions, may mitigate the effects of PAE. Therefore, we wanted to determine if a diet enriched in methyl group donors could provide protection to embryos against a PAE during preimplantation. To do so, a standard or enriched diet was given to mice 4 weeks before and during gestation. Pregnant females were exposed to alcohol at day E2.5, then we harvested embryos (E10.5, E18.5) to assess physical abnormalities and analyse forebrain methylation. Our results demonstrate that the enriched diet reduces or eliminate defects at E10.5 and E18.5. We also observed that the fortified diet did not affect the establishment and maintenance of methylation and expression of imprinted genes during development. Thus, our results show that a methyl enriched diet can prevent some of the adverse effects of prenatal alcohol exposure occurring during preimplantation.

Une exposition prénatale à l’alcool peut altérer le développement embryonnaire et causer le Trouble du Spectre de l’Alcoolisation Fœtale (TSAF). Les mécanismes moléculaires menant aux symptômes observés chez les enfants atteints sont toutefois méconnus. Plus encore, bien que les taux de consommation excessive d’alcool (binge-drinking) et de grossesses non-planifiées soient en hausse à travers le monde, les impacts d’une exposition prénatale à l’alcool pendant la préimplantation de l’embryon, sont inconnus et peu étudiés. Dans cette thèse, je souhaitais caractériser les impacts morphologiques d’une exposition à l’alcool pendant la préimplantation sur l’embryon en développement. De plus, je voulais définir les mécanismes moléculaires impliqués dans le cerveau antérieur ainsi que dans le placenta embryonnaire, en plus d’évaluer l’effet d’une exposition à l’alcool pendant la préimplantation sur certaines fonctions cognitives au stade post-natal. Notre hypothèse de recherche est qu’une exposition à l’alcool de type aigu pendant la préimplantation entrainera des erreurs dans l’établissement du programme épigénétique embryonnaire, causant des altérations dans les profils de méthylation d’ADN et d’expression des gènes chez l’embryon et son placenta qui persisteront tout au long de la gestation. Plus encore, nous croyons que ces dérégulations moléculaires altèreront les fonctions cognitives à long terme chez les souriceaux exposés. Pour répondre à ces questions, nous avons établi un modèle murin d’exposition à l’alcool de type aigu pendant la préimplantation en injectant des femelles gestantes au jour embryonnaire 2.5 (E2.5), correspondant au stade 8-cellules, avec deux doses de 2.5g/kg d’alcool séparées par 2 heures d’intervalle. Nous avons récolté des embryons à mi-gestation (E10.5), évaluer la morphologie puis nous avons isolé le cerveau antérieur pour étudier la méthylation d’ADN et l’expression génique. Nous avons aussi récolté des embryons en fin de gestation (E18.5) et leur placenta pour procéder à des analyses de méthylation d’ADN et de l’expression génique, en plus d’effectuer des analyses histologiques des placentas. Finalement, nous avons aussi laissé naître des souris issues de notre modèle d’exposition à l’alcool pendant la préimplantation pour évaluer certaines fonctions cognitives, notamment l’anxiété, la sociabilité et la mémoire, en procédant à des tests de comportement. Nous avons d’abord observé une augmentation des anomalies morphologiques chez l’embryon à mi-gestation à la suite de l’exposition prénatale à l’alcool. Nous avons aussi découvert que l’exposition prénatale, pendant la préimplantation, engendrait des différences de méthylation d’ADN dans le cerveau antérieur à mi-gestation et en fin de gestation, dans plusieurs voies biologiques reliées au développement embryonnaire et au fonctionnement du système nerveux. La plupart des régions différentiellement méthylées (DMRs) et des gènes différentiellement exprimés (DEGs) étaient spécifiques à chaque sexe, avec peu de régions partagées entre les mâles et les femelles. Nous avons aussi identifié des DMRs et DEGs spécifiques à chaque sexe ou partagés entre les deux sexes, dans les placentas en fin de gestation en plus de démontrer une baisse du poids fœtal chez les embryons mâles exposés à l’alcool. Enfin, nous avons démontré que l’exposition prénatale pendant la préimplantation causait une baisse de la sociabilité et de la mémoire à court-terme, sans avoir d’effet sur le niveau d’anxiété des souris En conclusion, nous avons démontré qu’une exposition prénatale à l’alcool en tout début de grossesse affecte le développement embryonnaire, via l’épigénome et le transcriptome du cerveau antérieur et du placenta, et entraine des conséquences à plus long terme sur les fonctions cognitives. En perspective, nous souhaitons établir les profils de méthylation d’ADN et d’expression génique précisément dans certains sous-types cellulaires du cerveau, dont les interneurones GABAergiques afin de mieux définir les mécanismes moléculaires derrière les altérations observées. / Prenatal alcohol exposure can alter embryonic development and lead to Fetal Alcohol Spectrum Disorder (FASD). However, the molecular mechanisms underlying the symptoms in affected children remain poorly understood. Furthermore, despite the increasing rates of binge drinking and unplanned pregnancies worldwide, the impacts of prenatal alcohol exposure during the preimplantation stage of embryonic development are largely unknown and understudied. In this thesis I aimed to characterize the morphological effects of alcohol exposure during preimplantation on developing embryos. Additionally, we sought to define the extent of DNA methylation defects and gene expression in the anterior brain and embryonic placenta. Furthermore, we aimed to evaluate the effects of our preimplantation alcohol exposure on certain cognitive functions in the postnatal stage. Our research hypothesis is that acute alcohol exposure during preimplantation will lead to errors in establishing the embryonic epigenetic program, causing alterations in DNA methylation profiles and gene expression in both the embryo and its placenta, persisting throughout gestation. We also believed that these molecular dysregulations would result in long-term cognitive impairments in exposed pups. To address these questions, we established a preclinical mouse model of acute alcohol exposure during preimplantation by injecting pregnant females on embryonic day 2.5 (E2.5), corresponding to the 8-cell stage, with two doses of 2.5g/kg of alcohol, separated by a 2-hour interval. We collected embryos at mid-gestation (E10.5), assessed for morphological defects and isolated the forebrain for DNA methylation and gene expression studies. We also collected embryos at late gestation (E18.5) along with their placenta for DNA methylation and gene expression analyses, as well as histological examinations of fixed placentas. Finally, we allowed mice from our preimplantation alcohol exposure model to be born and assessed specific cognitive functions such as anxiety, sociability, and memory through behavioral tests. First, we observed an increase in morphological anomalies in mid-gestation embryos following prenatal alcohol exposure and discovered that prenatal exposure during preimplantation led to DNA methylation differences in the forebrain at mid-gestation and late gestation, affecting various biological pathways related to embryonic development and nervous system function. Most of the differentially methylated regions (DMRs) and differentially expressed genes (DEGs) were sex-specific, with only few regions shared between males and females. We also identified sex-specific and shared DMRs and DEGs in late gestational placentas. Additionally, we demonstrated a decrease in fetal weight in male embryos and showed that preimplantation alcohol exposure caused reduced sociability and short-term memory without affecting the anxiety levels of the mice. In conclusion, we have shown that early preimplantation alcohol exposure affects embryonic development through the epigenome and transcriptome of the anterior brain and placenta, leading to long-term cognitive consequences. Moving forward, we intend to establish DNA methylation and gene expression profiles specifically in certain brain cell subtypes, including GABAergic interneurons, to better define the molecular mechanisms underlying the observed alterations.