Antikörper, die gegen eine klinisch relevante Gruppe von Rezeptoren innerhalb der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) gerichtet sind, darunter CD40 und CD95 (Fas/Apo-1), benötigen ebenfalls eine Bindung an Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγRs), um eine starke agonistische Wirkung zu entfalten. Diese FcγR-Abhängigkeit beruht weitgehend auf der bloßen zellulären Verankerung durch die Fc-Domäne des Antikörpers und benötigt dabei kein FcγR-Signalling. Ziel dieser Doktorarbeit war es, das agonistische Potenzial von αCD40- und αCD95-Antikörpern unabhängig von der Bindung an FcγRs durch die Verankerung an Myelomzellen zu entfalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Antikörpervarianten (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) gegen die TNFRSF-Mitglieder CD40 und CD95 genetisch mit einem einzelkettig kodierten B-Zell-aktivierenden Faktor (scBaff) Trimer als C-terminale myelom-spezifische Verankerungsdomäne fusioniert, welche die Fc-Domäne-vermittelte FcγR-Bindung ersetzt. Diese bispezifischen Antikörper-scBaff-Fusionsproteine wurden in Bindungsstudien und funktionellen Assays mit Tumorzelllinien untersucht, die einen oder mehrere der drei Baff-Rezeptoren exprimieren: BaffR, Transmembran-Aktivator und CAML-Interaktor (TACI) und B-Zell-Reifungsantigen (BCMA). Zelluläre Bindungsstudien zeigten, dass die Bindungseigenschaften der verschiedenen Domänen innerhalb der Antikörper-scBaff-Fusionen gegenüber der Zielantigene vollständig intakt blieben. In Ko-Kulturversuchen von CD40- und CD95-responsiven Zellen mit BaffR-, BCMA- oder TACI-exprimierenden Verankerungszellen zeigten die Antikörper-Fusionsproteine einen starken Agonismus, während in Ko-Kulturen mit Zellen ohne Expression von Baff-interagierenden Rezeptoren nur eine geringe Rezeptorstimulation beobachtet wurde. Die hier vorgestellten αCD40- und αCD95-Antikörper-scBaff-Fusionsproteine zeigen also Myelom-spezifische Aktivität und versprechen im Vergleich zu herkömmlichen CD40- und CD95-Agonisten geringere systemische Nebenwirkungen. / Antibodies that target a clinically relevant group of receptors within the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF), including CD40 and CD95 (Fas/Apo-1), also require binding to Fc gamma receptors (FcγRs) to elicit a strong agonistic activity. This FcγR dependency largely relies on the mere cellular anchoring through the antibody's Fc domain and does not involve the engagement of FcγR signaling. The aim of this doctoral thesis was to elicit agonistic activity from αCD40 and αCD95 antibodies in a myeloma cell anchoring-controlled FcγR-independent manner. For this purpose, various antibody variants (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) against the TNFRSF members CD40 and CD95 were genetically fused to a single-chain-encoded B-cell activating factor (scBaff) trimer as a C-terminal myeloma-specific anchoring domain substituting for Fc domain-mediated FcγR binding. These bispecific antibody-scBaff fusion proteins were evaluated in binding studies and functional assays using tumor cell lines expressing one or more of the three receptors of Baff: BaffR, transmembrane activator and CAML interactor (TACI) and B-cell maturation antigen (BCMA). Cellular binding studies showed that the binding properties of the different domains within the fusion proteins remained fully intact in the antibody-scBaff fusion proteins. In co-culture assays of CD40- and CD95-responsive cells with BaffR, BCMA or TACI expressing anchoring cells, the antibody fusion proteins displayed strong agonism while only minor receptor stimulation was observed in co-cultures with cells without expression of Baff-interacting receptors. Thus, the herein presented αCD40 and αCD95 antibody fusion proteins display myeloma cell-dependent activity and promise reduced systemic side effects compared to conventional CD40 and CD95 agonists.

Serum half-life elongation as well as the immobilization of small proteins like cytokines is still one of the key challenges for biologics. This accounts also for cytokines, which often have a molecular weight between 5 and 40 kDa and are therefore prone to elimination by renal filtration and sinusoidal lining cells. To solve this problem biologics are often conjugated to poly(ethylene glycol) (PEG), which is the gold standard for the so called PEGylation. PEG is a synthetic, non-biodegradable polymer for increasing the hydrodynamic radius of the conjugated protein to modulate their pharmacokinetic performance and prolong their therapeutic outcome. Though the benefits of PEGylation are significant, they also come with a prize, which is a loss in bioactivity due to steric hindrance and most often the usage of heterogeneous bioconjugation chemistries. While PEG is a safe excipient in most cases, an increasing number of PEG related side-effects, such as immunological responses like hypersensitivity and accelerated blood clearance upon repetitive exposure occur, which highlights the need for PEG alternative polymers, that can replace PEG in such cases. Another promising method to significantly prolong the residence time of biologics is to immobilize them at a desired location. To achieve this, the transglutaminase (TG) Factor XIIIa (FXIIIa), which is an important human enzyme during blood coagulation can be used. FXIIIa can recognize specific peptide sequences that contain a lysine as substrates and link them covalently to another peptide sequence, that contains a glutamine, forming an isopeptide bond. This mechanism can be used to link modified proteins, which have a N- or C-terminal incorporated signal peptide by mutation, to the extracellular matrix (ECM) of tissues. Additionally, both above-described methods can be combined. By artificially introducing a TG recognition sequence, it is possible to attach an azide group containing peptide site-specifically to the TG, recognition sequence. This allows the creation of a site-selective reactive site at the proteins N- or C-terminus, which can then be targeted by cyclooctyne functionalized polymers, just like amber codon functionalized proteins. This thesis has focused on the two cytokines human Interferon-α2a (IFN-α2a) and human, as well as murine Interleukin-4 (IL-4) as model proteins to investigate the above-described challenges. IFN-α2a has been chosen as a model protein because it is an approved drug since 1986 in systemic applications against some viral infections, as well as several types of cancer. Furthermore, IFN-α2 is also approved in three PEGylated forms, which have different molecular weights and use different conjugation techniques for polymer attachment. This turns it into an ideal candidate to compare new polymers against the gold standard PEG. Interleukin-4 (IL-4) has been chosen as the second model protein due to its similar size and biopotency. This allows to compare found trends from IFN-α2a with another bioconjugate platform and distinguish between IFN-α2a specific, or general trends. Furthermore, IL-4 is a promising candidate for clinical applications as it is a potent anti-inflammatory protein, which polarizes macrophages from the pro-inflammatory M1 state into the anti-inflammatory M2 state. / Die Verlängerung der Serum-Halbwertszeit sowie die Immobilisierung kleiner Proteine wie Zytokine ist nach wie vor eine der größten Herausforderungen für Biologika. Dies gilt auch für Zytokine, die häufig ein Molekulargewicht zwischen 5 und 40 kDa haben und daher leicht durch die Nierenfiltration und sinusoidale Endothelzellen eliminiert werden können. Um dieses Problem zu lösen, werden Biologika häufig an Poly(ethylenglykol) (PEG) konjugiert, das den Goldstandard für die so genannte PEGylierung darstellt. PEG ist ein synthetisches, biologisch nicht abbaubares Polymer, das den hydrodynamischen Radius des konjugierten Proteins vergrößert, um die pharmakokinetische Leistung zu modulieren und die therapeutische Wirkung zu verlängern. Obwohl die Vorteile der PEGylierung beträchtlich sind, haben sie auch ihren Preis, nämlich einen Verlust an Bioaktivität aufgrund sterischer Hindernisse und meist die Verwendung heterogener Biokonjugationstechniken. Obwohl PEG in den meisten Fällen ein sicherer Hilfsstoff ist, treten immer mehr PEG-bedingte Nebenwirkungen auf, wie z. B. immunologische Reaktionen wie Überempfindlichkeit und beschleunigter Abbau bei wiederholter Exposition, was den Bedarf an alternativen PEG-Polymeren unterstreicht, die PEG in solchen Fällen ersetzen können. Eine weitere vielversprechende Methode, um die Verweildauer von Biologika deutlich zu verlängern, besteht darin, sie an einem gewünschten Ort zu immobilisieren. Dazu kann die Transglutaminase (TG) Faktor XIIIa (FXIIIa) verwendet werden, die ein wichtiges menschliches Enzym bei der Blutgerinnung ist. FXIIIa kann bestimmte Peptidsequenzen, die ein Lysin enthalten, als Substrate erkennen und sie kovalent an eine andere Peptidsequenz, die ein Glutamin enthält, binden, wobei eine Isopeptidbindung entsteht. Dieser Mechanismus kann benutzt werden um modifizierte Proteine, welche durch Mutation ein N- oder C-terminal eingebautes Signalpeptid besitzen, mit der extrazellularen Gewebematrix (ECM) zu verknüpfen. Diese Arbeit konzentriert sich auf die beiden Zytokine humanes Interferon-α2a (IFN-α2a) und humanes sowie murines Interleukin-4 (IL-4) als Modellproteine, um die oben beschriebenen Herausforderungen zu untersuchen. IFN-α2a wurde als Modellprotein ausgewählt, weil es seit 1986 ein zugelassenes Medikament für die systemische Anwendung gegen einige Virusinfektionen und verschiedene Krebsarten ist. Darüber hinaus ist IFN-α2 auch in drei PEGylierten Formen zugelassen, die unterschiedliche Molekulargewichte haben und verschiedene Konjugationstechniken für die Polymeranbindung verwenden. Dies macht es zu einem idealen Kandidaten für den Vergleich neuer Polymere mit dem Goldstandard PEG. Interleukin-4 (IL-4) wurde als zweites Modellprotein gewählt, da es eine ähnliche Größe und Biopotenz aufweist. Dies ermöglicht es, die von IFN-α2a gefundenen Trends mit einer anderen Biokonjugat-Plattform zu vergleichen und zwischen IFN-α2a-spezifischen und allgemeinen Trends zu unterscheiden. Darüber hinaus ist IL-4 ein vielversprechender Kandidat für klinische Anwendungen, da es ein starkes entzündungshemmendes Protein ist, das Makrophagen vom entzündungsfördernden M1-Zustand in den entzündungshemmenden M2-Zustand polarisiert.

Lung cancer is the main cause of cancer-related deaths worldwide. Despite the availability of several targeted therapies and immunotherapies in the clinics, the prognosis for lung cancer remains poor. A major problem for the low benefit of these therapies is intrinsic and acquired resistance, asking for pre-clinical models for closer investigation of predictive biomarkers for refined personalized medicine and testing of possible combination therapies as well as novel therapeutic approaches to break resistances. One third of all lung adenocarcinoma harbor mutations in the KRAS gene, of which 39 % are transitions from glycine to cysteine in codon 12 (KRASG12C). Being considered “undruggable” in previous decades, KRASG12C-inhibitors now paved the way into the standard-of-care for lung adenocarcinoma treatment in the clinics. Still, the overall response rates as well as overall survival of patients treated with KRASG12C-inhibitors are sobering. Therefore, 3D KRASG12C-biomarker in vitro models were developed based on a decellularized porcine jejunum (SISmuc) using commercial and PDX-derived cell lines and characterized in regards of epithelial-mesenchymal-transition (EMT), stemness, proliferation, invasion and c-MYC expression as well as the sensitivity towards KRASG12C-inhibiton. The phenotype of lung tumors harboring KRAS mutations together with a c-MYC overexpression described in the literature regarding invasion and proliferation for in vivo models was well represented in the SISmuc models. A higher resistance towards targeted therapies was validated in the 3D models compared to 2D cultures, while reduced viability after treatment with combination therapies were exclusively observed in the 3D models. In the test system neither EMT, stemness nor the c-MYC expression were directly predictive for drug sensitivity. Testing of a panel of combination therapies, a sensitizing effect of the aurora kinase A (AURKA) inhibitor alisertib for the KRASG12C-inhibitor ARS-1620 directly correlating with the level of c-MYC expression in the corresponding 3D models was observed. Thereby, the capability of SISmuc tumor models as an in vitro test system for patient stratification was demonstrated, holding the possibility to reduce animal experiments. Besides targeted therapies the treatment of NSCLC with oncolytic viruses (OVs) is a promising approach. However, a lack of in vitro models to test novel OVs limits the transfer from bench to bedside. In this study, 3D NSCLC models based on the SISmuc were evaluated for their capability to perform efficacy and risk assessment of oncolytic viruses (OVs) in a pre-clinical setting. Hereby, the infection of cocultures of tumor cells and fibroblasts on the SISmuc with provided viruses demonstrated that in contrast to a wildtype herpes simplex virus 1 (HSV-1) based OV, the attenuated version of the OV exhibited specificity for NSCLC cells with a more advanced and highly proliferative phenotype, while fibroblasts were no longer permissive for infection. This approach introduced SISmuc tumor models as novel test system for in vitro validation of OVs. Finally, a workflow for validating the efficacy of anti-cancer therapies in 3D tumor spheroids was established for the transfer to an automated platform based on a two-arm-robot system. In a proof-of-concept process, H358 spheroids were characterized and treated with the KRASG12C-inhibitor ARS-1620. A time- and dose-dependent reduction of the spheroid area after treatment was defined together with a live/dead-staining as easy-to-perform and cost-effective assays for automated drug testing that can be readily performed in situ in an automated system. / Lungentumoren sind die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit. Trotz der Verfügbarkeit diverser zielgerichteter Therapien und Immuntherapien im klinischen Alltag ist die Prognose für Lungenkrebs nach wie vor schlecht. Eine Hauptursache hierfür sind intrinsische und erworbene Resistenzen. Hieraus ergibt sich ein Bedarf für präklinische Modelle zur genaueren Untersuchung prädiktiver Biomarker für eine verbesserte personalisierte Medizin und zur Testung von Kombinationstherapien sowie neuartiger therapeutischer Ansätze, um bestehende Resistenzen zu brechen. Ein Drittel aller Lungen-Adenokarzinome weisen Mutationen im KRAS-Gen auf, von denen 39 % Transitionen von Glycin zu Cystein in Codon 12 (KRASG12C) darstellen. Obwohl KRAS in den vergangenen Jahrzehnten als "unbehandelbar" galt, haben sich KRASG12C-Inhibitoren nun den Weg in die klinische Standardbehandlung von Lungen-Adenokarzinomen gebahnt. Jedoch sind die Ansprech- und Überlebensraten von Patienten, die mit KRASG12C-Inhibitoren behandelt werden, ernüchternd. Daher wurden in dieser Arbeit 3D KRASG12C-Biomarker in vitro Modelle basierend auf dezellularisierten Schweinedünndarm (SISmuc) unter Verwendung kommerzieller und PDX-abgeleiteter Zelllinien aufgebaut und hinsichtlich der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), Stammzell-Eigenschaften, Proliferation, Invasion und c MYC-Expression sowie der Sensitivität gegenüber KRASG12C-Inhibitoren charakterisiert. Der in der Literatur für in vivo Modelle beschriebene Phänotyp von Lungentumoren mit KRAS-Mutationen und c-MYC-Überexpression in Bezug auf Invasion und Proliferation war in den SISmuc-Modellen reproduzierbar. Während in den 3D Modellen erhöhte Resistenz gegenüber zielgerichteten Therapien im Vergleich zu 2D beobachtet wurde, konnte eine verringerte Viabilität nach der Behandlung mit Kombinationstherapien ausschließlich in den 3D Modellen beobachtet werden. Im Test-System zeigten sich weder EMT noch die c-MYC-Expression als direkt prädiktiv für die Sensitivität gegenüber KRASG12C-Inhibitoren. Bei der Prüfung von verschiedenen Kombinationstherapien, wurde eine sensibilisierende Wirkung des Aurora-Kinase A (AURKA)-Inhibitors Alisertib für den KRASG12C-Inhibitor ARS-1620 beobachtet, welche direkt mit dem Grad der c-MYC-Expression in den entsprechenden 3D-Modellen korrelierte. Hierdurch konnte die Eignung von SISmuc Tumor Modellen als in vitro Test-System zur Patienten-Stratifizierung gezeigt werden, welches die Möglichkeit einer Reduktion von Tierversuchen birgt. Neben zielgerichteten Therapien ist die Behandlung von NSCLC mit onkolytischen Viren (OVs) ein vielversprechender Ansatz. Es mangelt jedoch an in vitro Modellen, um neue OVs in einer präklinischen Umgebung zu testen. Hierfür wurden 3D-NSCLC-Modelle auf der Grundlage der SISmuc bezüglich ihrer Eignung zur Durchführung von Wirksamkeits- und Risikobewertungen von OVs untersucht. Dabei zeigte die Infektion von Kokulturen aus Tumorzellen und Fibroblasten auf der SISmuc mit bereitgestellten Viren, dass die abgeschwächte Version des OV im Gegensatz zu einem auf dem Wildtyp des Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) basierenden OV eine Spezifität für NSCLC-Zellen mit einem fortgeschritteneren und stark proliferativen Phänotyp aufwies, während Fibroblasten sich für eine Infektion nicht länger permissiv zeigten. Dieser Ansatz stellt unter Beweis, dass SISmuc-Tumormodelle sich als neues Test-System zur in vitro Prüfung von OVs eignen. Schließlich wurde ein Arbeitsablauf zur Validierung der Wirksamkeit von Krebstherapien in 3D-Tumor-Sphäroiden für die Übertragung auf eine automatisierte Plattform auf der Grundlage eines zweiarmigen Robotersystems entwickelt. In einem Proof-of-Concept-Prozess wurden H358-Sphäroide charakterisiert und mit dem KRASG12C-Inhibitor ARS-1620 behandelt. Eine zeit- und dosisabhängige Reduktion der Sphäroid-Fläche nach der Behandlung wurde zusammen mit einer Lebend/Tot-Färbung als einfach durchzuführender und kostengünstiger Assay für automatisierte Medikamententests definiert, welche in situ in einer automatisierten Umgebung durchgeführt werden können.

The Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa is a life-threatening nosocomial pathogen due to its generally low susceptibility toward antibiotics. Furthermore, many strains have acquired resistance mechanisms requiring new antimicrobials with novel mechanisms to enhance treatment options. Proline-rich antimicrobial peptides, such as the apidaecin analog Api137, are highly efficient against various Enterobacteriaceae infections in mice, but less active against P. aeruginosa in vitro. Here, we extended our recent work by optimizing lead peptides Api755 (gu-OIORPVYOPRPRPPHPRL-OH; gu = N,N,N′,N′-tetramethylguanidino, O = L-ornithine) and Api760 (gu-OWORPVYOPRPRPPHPRL-OH) by incorporation of Ile-Orn- and Trp-Orn-motifs, respectively. Api795 (gu-O(IO)2RPVYOPRPRPPHPRL-OH) and Api794 (gu-O(WO)3RPVYOPRPRPPHPRL-OH) were highly active against P. aeruginosa with minimal inhibitory concentrations of 8–16 and 8–32 μg/mL against Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Assessed using a quartz crystal microbalance, these peptides inserted into a membrane layer and the surface activity increased gradually from Api137, over Api795, to Api794. This mode of action was confirmed by transmission electron microscopy indicating some membrane damage only at the high peptide concentrations. Api794 and Api795 were highly stable against serum proteases (half-life times >5 h) and non-hemolytic to human erythrocytes at peptide concentrations of 0.6 g/L. At this concentration, Api795 reduced the cell viability of HeLa cells only slightly, whereas the IC50 of Api794 was 0.23 ± 0.09 g/L. Confocal fluorescence microscopy revealed no colocalization of 5(6)-carboxyfluorescein-labeled Api794 or Api795 with the mitochondria, excluding interactions with the mitochondrial membrane. Interestingly, Api795 was localized in endosomes, whereas Api794 was present in endosomes and the cytosol. This was verified using flow cytometry showing a 50% higher uptake of Api794 in HeLa cells compared with Api795. The uptake was reduced for both peptides by 50 and 80%, respectively, after inhibiting endocytotic uptake with dynasore. In summary, Api794 and Api795 were highly active against P. aeruginosa in vitro. Both peptides passed across the bacterial membrane efficiently, most likely then disturbing the ribosome assembly, and resulting in further intracellular damage. Api795 with its IOIO-motif, which was particularly active and only slightly toxic in vitro, appears to represent a promising third generation lead compound for the development of novel antibiotics against P. aeruginosa.

Background: A large number of human inherited and acquired diseases and phenotypes are caused by mutations in G protein-coupled receptors (GPCR). Genome-wide association studies (GWAS) have shown that variations in the ADGRD1 (GPR133) locus are linked with differences in metabolism, human height and heart frequency. ADGRD1 is a Gs protein-coupled receptor belonging to the class of adhesion GPCRs. Results: Analysis of more than 1000 sequenced human genomes revealed approximately 9000 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the human ADGRD1 as listed in public data bases. Approximately 2.4 % of these SNPs are located in exons resulting in 129 non-synonymous SNPs (nsSNPs) at 119 positions of ADGRD1. However, the functional relevance of those variants is unknown. In-depth characterization of these amino acid changes revealed several nsSNPs (A448D, Q600stop, C632fs [frame shift], A761E, N795K) causing full or partial loss of receptor function, while one nsSNP (F383S) significantly increased basal activity of ADGRD1. Conclusion: Our results show that a broad spectrum of functionally relevant ADGRD1 variants is present in the human population which may cause clinically relevant phenotypes, while being compatible with life when heterozygous.

Riboswitches have gained attention as tools for synthetic biology, since they enable researchers to reprogram cells to sense and respond to exogenous molecules. In vitro evolutionary approaches produced numerous RNA aptamers that bind such small ligands, but their conversion into functional riboswitches remains difficult. We previously developed a computational approach for the design of synthetic theophylline riboswitches based on secondary structure prediction. These riboswitches have been constructed to regulate ligand dependent transcription termination in Escherichia coli. Here, we test the usability of this design strategy by applying the approach to tetracycline and streptomycin aptamers. The resulting tetracycline riboswitches exhibit robust regulatory properties in vivo. Tandem fusions of these riboswitches with theophylline riboswitches represent logic gates responding to two different input signals. In contrast, the conversion of the streptomycin aptamer into functional riboswitches appears to be difficult. Investigations of the underlying aptamer secondary structure revealed differences between in silico prediction and structure probing. We conclude that only aptamers adopting the minimal free energy (MFE) structure are suitable targets for construction of synthetic riboswitches with design approaches based on equilibrium thermodynamics of RNA structures. Further improvements in the design strategy are required to implement aptamer structures not corresponding to the calculated MFE state.

G-protein signalling is an evolutionary conserved concept highlighting its fundamental impact on developmental and functional processes. Studies on the effects of G protein signals on tissues as well as an entire organism are often conducted in Caenorhabditis elegans. To understand and control dynamics and kinetics of the processes involved, pharmacological modulation of specific G protein pathways would be advantageous, but is difficult due to a lack in accessibility and regulation. To provide this option, we designed G protein-coupled receptor-based designer receptors (DREADDs) for C. elegans. Initially described in mammalian systems, these modified muscarinic acetylcholine receptors are activated by the inert drug clozapine N-oxide, but not by their endogenous agonists. We report a novel C. elegans-specific DREADD, functionally expressed and specifically activating Gq-protein signalling in vitro and in vivo which we used for modulating mating behaviour. Therefore, this novel designer receptor demonstrates the possibility to pharmacologically control physiological functions in C. elegans.

Die Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (CODH) ist ein Schlüsselenzym des reduktiven Acetyl-CoA Wegs, und katalysiert in diesem die Reduktion von CO2 zu CO mit Raten von bis zu 12 s 1. Die Rückreaktion, die Oxidation von CO, katalysiert die CODH mit Raten von bis zu 31000 s-1. Beide Reaktionen finden am aktiven Zentrum des Enzyms, einem [NiFe4S4OHx]-Cluster (C Cluster), statt. Das Genom des hydrogenogenen Bakteriums C. hydrogenoformans beinhaltet fünf putative CODHs, welche vermutlich unterschiedliche Funktionen im Organismus ausüben. Diese Arbeit charakterisiert CODH-II und CODH-IV strukturell und biochemisch. In CODH-II wurden dafür Seitenketten der 1. und 2. Koordinationssphäre des C-Clusters ausgetauscht und einer strukturellen und kinetischen Analyse unterzogen. Der zweite Teil der Arbeit analysiert den Einfluss von O2 auf CODH-II und CODH-IV. In Lösung zeigte CODH-II bei Inkubation mit O2 einen Verlust der CO-Oxidationsaktivität. Analog dazu konnte in CODH-II Kristallen die Zerstörung des C Clusters durch O2 verfolgt werden. Elektrochemisch wurde das Verhalten der CODH-II in der Gegenwart von O2 mit der CODH-IV, für welche eine Rolle in der oxidativen Stressantwort von C. hydrogenoformans diskutiert wird, verglichen. CODH-IV ist sauerstofftoleranter als CODH-II und katalysiert die Oxidation von CO hocheffizient nahe des CO-Diffussionslimits. Die Aufklärung der Struktur von CODH-IV erlaubte die Identifikation einer möglichen Ursache der höheren O2-Toleranz. Die Strukturen beider CODHs ähneln sich stark. Allerdings weist CODH IV an der Rückseite des C-Clusters eine dichtere Packung der Seitenketten auf, wodurch der Cluster von einem Angriff durch O2 abgeschirmt werden könnte. / CO-Dehydrogenase (CODH) is a key enzyme of the reductive acetyl-CoA pathway, in which it catalyses the reduction of CO2 to CO with rates up to 12 s-1. CODH catalyses the reverse reaction, the oxidation of CO with rates up to 31000 s-1. Both reactions take place at the active site of the enzyme, a [NiFe4S4OHx] cluster (cluster C). The genome of the hydrogenogenic bacterium C. hydrogenoformans contains five putative CODHs which might serve distinctive functions within the organism. This study characterises CODH-II and CODH-IV structurally and biochemically. Residues of the first and second coordination sphere of cluster C from CODH-II were exchanged and analysed concerning their structural and biochemical properties. The second part of this study analyses the influence of O2 on CODH-II and CODH-IV. CODH-II showed in solution a loss in CO-oxidation activity upon incubation with O2. In an analogous experiment, the destruction of cluster C by O2 was followed crystallographically. A role for CODH-IV in the oxidative stress response of C. hydrogenoformans has been discussed previously. Therefore, the behaviour of CODH-II and CODH-IV was analysed electrochemically in the presence of O2. CODH IV is more O2-tolerant than CODH-II and catalyses the oxidation of CO with high efficiency close to the diffusion limit of CO. Reasons for the enhanced O2-tolerance of CODH-IV could be deduced by elucidating its structure. Generally, both CODHs show high structural similarity. However, at the backside of cluster C CODH-IV shows a tighter packing of residues by which the cluster C might be shielded from O2.

Immer mehr Berichte deuten darauf hin, dass nicht-kodierende RNAs an der Regulation des Immunsystems beteiligt sind. In dieser Arbeit wurden nicht-kodierende RNAs identifiziert, die durch zwei unterschiedliche immunologische Prozesse in zwei verschiedenen Zelltypen reguliert wurden. Zum einen wurde das Transkriptom von Multiplen Myelom-Zellen in Abhängigkeit von der Interleukin 6-Stimulation untersucht. Dabei wurden einige sehr lange, IL 6-regulierte macroRNAs identifiziert, die STAIRs (STAT3-induced RNAs). Bei den STAIRs handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle, kontinuierliche, nicht-kodierende macroRNAs, die im Zellkern angereichert sind. Einige STAIRs dienen eventuell zusätzlich oder ausschließlich als Primärtranskript für gespleißte, lange ncRNAs (lncRNAs), die weitere Funktionen in der Zelle ausüben können. Die STAIRs weisen eine große Bandbreite an Gewebsspezifität auf und bei den Untersuchungen in dieser Arbeit zeigten sich Hinweise, dass sie sich für verschiedene Krebserkrankungen als Biomarker eignen könnten. Die zweite Transkriptomanalyse wurde bei der Aktivierung naiver T Zellen durchgeführt. Dabei offenbarte sich, dass die Zellen bei diesem Prozess einen dramatischen Wechsel ihres Transkriptionsprogrammes vollziehen und eine Vielzahl nicht Protein-kodierender Gene reguliert werden. Es wurde die Regulation von ncRNAs, die bisher noch nicht im Zusammenhang mit T Zellen beschrieben wurden, beobachtet und erneut unbekannte, differentiell exprimierte Bereiche identifiziert. Im Anschluss wurde STAIR18, eine nicht-kodierende RNA, die durch die beiden untersuchten Signalwege reguliert wird, eingehender untersucht. Es zeigte sich, dass STAIR18 im menschlichen Genom dupliziert ist und beide Loci die gespleißte, lange ncRNA152 in diversen Varianten transkribieren. ncRNA152 ist hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert und befindet sich dort anscheinend in perinukleären Aggregaten. Die verschiedenen ncRNA152-Isoformen scheinen unter-schiedliche Funktionen auszuführen. Einerseits ist eine Wirkung als competing endogenous RNA wahrscheinlich. Eine weitere Aufgabe der ncRNA152 scheint darin zu bestehen, das STAT3-Primärtranskript zu stabilisieren oder dessen Prozessierung zu fördern.

Background: Trypsinogen is the inactive precursor of trypsin, a serine protease that cleaves proteins and peptides after arginine and lysine residues. In this study, human trypsinogen was used as a model protein to study the influence of electrostatic forces on protein–protein interactions. Trypsinogen is active only after its eight-amino-acid-long activation peptide has been cleaved off by another protease, enteropeptidase. Trypsinogen can also be autoactivated without the involvement of enteropeptidase. This autoactivation process can occur if a trypsinogen molecule is activated by another trypsin molecule and therefore is based on a protein–protein interaction. Results: Based on a rational protein design based on autoactivation-defective guinea pig trypsinogen, several amino acid residues, all located far away from the active site, were changed to modify the surface charge of human trypsinogen. The influence of the surface charge on the activation pattern of trypsinogen was investigated. The autoactivation properties of mutant trypsinogen were characterized in comparison to the recombinant wild-type enzyme. Surface-charged trypsinogen showed practically no autoactivation compared to the wild-type but could still be activated by enteropeptidase to the fully active trypsin. The kinetic parameters of surface-charged trypsinogen were comparable to the recombinant wild-type enzyme. Conclusion: The variant with a modified surface charge compared to the wild-type enzyme showed a complete different activation pattern. Our study provides an example how directed modification of the protein surface charge can be utilized for the regulation of functional protein–protein interactions, as shown here for human trypsinogen.