In dieser Arbeit werden Strategien zur Entwicklung von biohybriden Photoelektroden, die Licht in elektrische Energie umwandeln, demonstriert und diskutiert. Der natürliche Photonen-transformierende Superkomplex der oxygenen Photosynthese aus Thermosynechococcus elongatus, das Photosystem I (PSI), kann durch die nicht-native Interaktion zum Redoxprotein Cytochrom c (Cyt c), erfolgreich funktional in Elektroden integriert werden. Hierfür wurden unterschiedliche Strategien entwickelt, z. B. bilden beide Biokomponenten unspezifische Komplexe in Lösung und assemblieren gemeinsam auf modifizierten Goldoberflächen. Aus der Kontaktierung des PSI mit einer thiol-modifizierten Goldelektrode via Cyt c ergeben sich unidirektionale kathodische Photoströme. DNA, als ein Polyelektrolytmatrixelement, kann zum Aufbau von 3D-Protein-Mehrschichtarchitekturen höherer Stabilität und Leistungsfähigkeit verwendet werden. Der Einsatz von mesoporösen Indium-Zinnoxid-Elektroden vergrößert die Photostromgenerierung um mehr als eine Größenordnung, wodurch sich hieraus skalierbare transparente Photobioelektroden mit hohen Quanteneffizienzen (bis zu 30%) erzeugen lassen. / In this thesis, strategies are demonstrated and discussed for the development of biohybrid photoelectrodes transforming light into electrical energy. The natural photon-to-charge carrier converting super-complex from oxygenic photosynthesis of Thermosynechococcus elongatus, photosystem I (PSI), can be functionally implemented into such electrodes, due to the non-native interaction with the small redox protein cytochrome c (cyt c). Different strategies have been developed, e. g. both biocomponents form complexes in solution and self-assemble on modified gold-surfaces. The electrical connection of PSI to thiol-modified gold electrodes via cyt c results in unidirectional cathodic photocurrents of high efficiency. DNA, as a polyelectrolyte matrix element, can be used to build up 3D protein multilayer architectures of higher stability and performance. The use of mesoporous indium tin oxide electrodes further enhances the photocurrent generation more than one order of magnitude, thus resulting in scalable transparent photobioelectrodes of high quantum efficiencies (up to 30 %).

Cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19) from the alkaliphilic Bacillus sp. G-825-6 converts starch mainly to c-cyclodextrin (CD8). A combination of error-prone PCR and DNA shuffling was used to obtain variants of this enzyme with higher product specificity for CD8 and a broad pH activity range. The variant S54 with seven amino acid substitutions showed a 1.2-fold increase in CD8-synthesizing activity and the product ratio of CD7:CD8 was shifted to 1:7 compared to 1:3 of the wild-type enzyme. Nine amino acid substitutions of the cyclodextrin glucanotransferase were performed to generate the variant S35 active in a pH range 4.0–10.0. Compared to the wild-type enzyme which is inactive below pH 6.0, S35 retained 70% of its CD8-synthesizing activity at pH 4.0.

Mit Aminotransferasen können chirale Amine auf biotechnologischem Weg hergestellt werden. Diese besitzen große Bedeutung als Bausteine für weitere Synthesen in der pharmazeutischen und agrochemischen Industrie. Da natürlich vorkommende Enzyme oft nicht die gewünschte Substratspezifität für bestimmte industrielle Anwendungen besitzen, ist eine Optimierung durch Mutagenese notwendig. Solche Entwicklungen sind jedoch oft mit hohem Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Die Optimierung kann entweder ungezielt durch empirische Methoden oder gezielt unter Einbeziehung von Informationen über das Enzym erfolgen. Die notwendigen Daten können als Vorbereitung zu konkreten Produktentwicklungen durch Untersuchungen an potentiell geeigneten Enzymen gewonnen werden. Um einen solchen rationalen Ansatz bei der einer speziellen Amin-Pyruvat-Aminotransferase zu ermöglichen, war es Ziel der vorliegenden Arbeit die Grundlagen für die Veränderung der Substratspezifität dieses Enzyms zu erarbeiten. Zunächst wurden strukturelle Informationen durch ein Homologie-Modell gewonnen und später durch eine experimentell bestimmte Struktur ergänzt. Mit dieser Struktur wurden die Substrat-bindenden Reste identifiziert und zunächst der Einfluss auf die Substratbindung durch ortsgerichtete Mutagenese überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle acht ausgewählten Aminosäurereste an der Substratbindung beteiligt sind. Zudem wurde unter diesen Positionen nach Mutanten gesucht, die neue Substrate umsetzen können. Eine Reihe von Mutanten wurde identifiziert, die verschiedene neue Substrate umsetzen. Für zwei Positionen konnten eine Reihe von Mutanten identifiziert werden, die neue Substrate akzeptieren. Durch die Art der Seitenketten, die Position der Aminosäuren und der chemischen Struktur der akzeptierten Substrate konnten eine Reihe von Aussagen über den Mechanismus der Substratbindung für diese Amin-Pyruvat-Aminotransferase gemacht werden. Außerdem wurde die Zweckmäßigkeit der eingesetzten theoretischen und experimentellen Methoden für die Anwendung bei Entwicklungen mit Enzymen dieser Klasse gezeigt.

We present a new diffuse interface model for the dynamics of inextensible vesicles in a viscous fluid with inertial forces. A new feature of this work is the implementation of the local inextensibility condition in the diffuse interface context. Local inextensibility is enforced by using a local Lagrange multiplier, which provides the necessary tension force at the interface. We introduce a new equation for the local Lagrange multiplier whose solution essentially provides a harmonic extension of the multiplier off the interface while maintaining the local inextensibility constraint near the interface. We also develop a local relaxation scheme that dynamically corrects local stretching/compression errors thereby preventing their accumulation. Asymptotic analysis is presented that shows that our new system converges to a relaxed version of the inextensible sharp interface model. This is also verified numerically. To solve the equations, we use an adaptive finite element method with implicit coupling between the Navier-Stokes and the diffuse interface inextensibility equations. Numerical simulations of a single vesicle in a shear flow at different Reynolds numbers demonstrate that errors in enforcing local inextensibility may accumulate and lead to large differences in the dynamics in the tumbling regime and smaller differences in the inclination angle of vesicles in the tank-treading regime. The local relaxation algorithm is shown to prevent the accumulation of stretching and compression errors very effectively. Simulations of two vesicles in an extensional flow show that local inextensibility plays an important role when vesicles are in close proximity by inhibiting fluid drainage in the near contact region.

In der vorliegenden Arbeit diente das Kapsid der Bakteriophage Qbeta als multivalentes Gerüst und ermöglichte die Bildung eines monodispersen multivalenten Systems, welches mit Homopropargylglycin als unnatürliche Aminosäure modifiziert wurde. Das so eingeführte Alkin ermöglichte kupferkatalysierte Alkin-Azid-Cycloaddition zur Anbindung von Sialinsäuregrupen. Die entsprechende Synthese der hierzu kompatiblen Azid-modifizierten Sialinsäurederivate war eine der Hauptaufgaben dieser Arbeit. Zu diesem Zweck wurde das einfach zugängliche 5-N-Acetyladamantanylthiosialosid als Glykosylierungsdonor in der alpha-selektiven Synthese von Sialosiden evaluiert. Eine effiziente Aktivierung dieses Donors wurde unter optimierten Bedingungen bei -78°C mit N-Iodsuccinimid und Trifluormethansulfonsäure erreicht, was zu hohen alpha-Selektivitäten und Gesamtausbeuten der gewünschten Sialoside führte. Insbesondere Azidoethylenglykol-verknüpfte Sialinsäuren wurden synthetisiert, die für nachfolgende Biokonjugationsreaktionen an das Qbeta-Kapsid verwendet wurden. Die so dargestellten Sialinsäure-modifizierten Qbeta-Kapsidpartikel wurden dann eingehend mit Hilfe mehrerer biophysikalischer und biologischer Tests hinsichtlich ihrer Fähigkeit an Hämagglutinin zu binden und eine Influenza-Infektion zu inhibieren charakterisiert. Niedrige nanomolare Affinitäten wurden in diesen Assays gemessen. Eine sehr effiziente Infektionshemmung in vergleichbaren Konzentrationsbereichen konnte in einem in vitro Zell-, sowie einem in vivo Maus- als auch einem menschlichen ex vivo Modellsystem beobachtet werden. Verschiedene pathologisch relevante Influenzastämme konnten über die hier vorgestellte Strategie ebenfalls gebunden werden. Die monodisperse und definierte Struktur des Qbeta-Gerüsts erlaubte es außerdem ein theoretisches Modell der zugrundeliegenden Bindungsmodi zu erstellen. / In this thesis, the bacteriophage Qbeta capsid served as a multivalent scaffold and facilitated the generation of a monodisperse multivalent system which was modified with homopropargylglycine as an unnatural amino acid. The introduced alkyne enabled copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition to attach sialic acid groups. The corresponding synthesis of the compatible azide-modified sialic acid derivatives was one of the main tasks of this work. For this purpose, the straightforwardly accessible 5-N-acetyladamantanyl thiosialoside was evaluated as a glycosylation donor in the alpha-selective synthesis of sialosides. Efficient activation of this donor was achieved under optimized conditions at -78°C with N-iodosuccinimide and trifluoromethanesulfonic acid which led to high alpha selectivities and overall yields of the desired sialosides. Particularly azidoethylene glycol-linked sialic acids were synthesized which were used for subsequent bioconjugation reactions to the Qbeta capsid. These synthesized sialic acid-modified Qbeta capsid particles were then thoroughly characterized by multiple biophysical and biological assays regarding their ability to bind to hemagglutinin and to inhibit influenza infection. Low nanomolar affinities were measured in these assays. A very efficient infection inhibition in a comparable concentration range was observed in in vitro cellular, in vivo mouse and ex vivo human model systems. Several pathologically relevant influenza strains could also be bound with the strategy presented here. The monodisperse and defined structure of the Qbeta scaffold additionally allowed for the establishment of a theoretical model describing the underlying binding modes.

Die Acetyl-CoA Synthase (ACS) beinhaltet ein einzigartiges Metallcluster (Cluster A) in seinem aktiven Zentrum, welches wichtig für ein autotrophes Wachstum von Bakterien und Archaeen ist, die den reduktiven Acetyl-CoA-Weg nutzen. Der letzte Schritt dieses Syntheseweges wird von der ACS am proximal zum [4Fe-4S] Cluster liegenden Ni ion katalysiert (Nip). In meiner Arbeit wurde die ACS von Carboxydothermus hydrogenoformans (ACSCh) auf seine Ligandenbindung untersucht und in verschiedenen Konformationen kristallisiert. Zuerst wurde die ACSCh in einer neuen Konformation (ACSCh-closed) kristallisiert und deren Struktur mit einer Auflösung von 2.1 Å bestimmt. Diese wies einen geringeren Kontakt zur Solventumgebung auf als die vorher bekannte Struktur der ACSCh (ACSCh-open, PDB-ID: 1RU3). Das Cluster A der ACSCh-closed unterscheidet sich von der ACSCh-open in der Koordination des Nip, welches verzerrt tetraedrisch koordiniert in ACSCh-closed vorliegt und quadratisch planar in ACSCh-open. Eine Analyse des Modells wies einen molekularen Tunnel auf, der nur in ACSCh-closed vorhanden ist, welcher als CO-Kanal zur Substratversorgung dienen könnte. Zweitens wurde die Kristallstruktur einer CO gebunden ACSCh-closed mit einer Auflösung von 2.0 Å gelöst. Darin wurde eine Elektronendichte am Nip identifiziert, die als CO überzeugend modelliert werden konnte. CO bindet am ebenfalls verzerrt tetraedrisch koordinierten Nip. Die Konformationsänderung von ACSCh-open zu ACSCh-closed scheint der entscheidende Schritt zu sein, um CO zur Bindungsstelle zu leiten. Die dritte Struktur zeigt eine CoA gebundene ACSCh Struktur mit einer Auflösung von 2.3 Å. CoA bindet am Nip, wobei Nip quadratisch planar koordiniert wird. Die Gegenwart von CoA wurde mit Berechnungen verschiedener Elektronendichte-Karten für CoA validiert. Die Bindung von CO und CoA an ACSCh wurde zudem mittels isothermaler Titrationskalorimetrie weiter charakterisiert. Dabei bindet CoA enthalpisch getrieben mit einem KD von 3.1 µM und CO entropisch getrieben mit einem KD von 9.4 µM an ACSCh. / The acetyl-CoA synthase (ACS) harbors a unique metal cluster (cluster A) in its active site, which is important for bacteria and archaea to survive in autotrophic growth using the reductive acetyl-CoA. The last step of this pathway is catalyzed by ACS at the Nip, the Ni ion proximal to the [4Fe-4S] cluster. In my study, the monomeric ACS of Carboxydothermus hydrogenoformans (ACSCh) was studied in its ligand binding and crystallized in different forms. At first, an ACSCh structure was solved in a new conformation at dmin of 2.1 Å and less solvent exposed (called ACSCh-closed) than the known structure of ACSCh (called ACSCh-open, PDB-ID:1RU3). The cluster A of ACSCh-closed differs to that of ACSCh-open in the coordination of the proximal Ni, which is distorted tetrahedrally coordinated in ACSCh-closed and square planar coordinated in ACSCh-open. Analysis of the model revealed a molecular tunnel that is only present in ACSCh-closed, which might act as CO channel for substrate delivery. Secondly, a CO-bound ACSCh-closed crystal was obtained and solved at a resolution of 2.0 Å. An electron density fitting with a diatomic ligand at the Nip site was clearly identified and modeled as a CO molecule. CO binds at the Nip site completing the tetrahedral coordination geometry of Nip. The conformational switch between open and closed is responsible for CO migration and binding to the catalytic site. A third crystal structure depicts a CoA bound ACSCh structure at 2.3 Å resolution. CoA binds at the Nip which shows a square planar geometry. This was further supported by calculating different electron density maps for CoA. The binding of CO and CoA to ACSCh has been characterized by isothermal calorimetry experiments. While CoA binding is enthalpically driven with a KD of 3.1 µM, CO binds to ACSCh by entropic contribution with a KD of 9.4 µM.

Ein vielversprechender Ansatz zur Verhinderung von Infektionen mit Influenzavirus ist die kompetitive Inhibition der Virusanhaftung an die Wirtszellen durch Behinderung der Bindung des viralen Hemagglutinin (HA) an sialylierte Glykanrezeptoren. Allerdings erschwert die hohe Variabilität des HA die Entwicklung von universellen Sialinsäure (SA)-basierten Virostatika. In dieser Arbeit wurde der antivirale Effekt von mit SA funktionalisierten Polyglycerolen (PGs) auf Influenza A Viren (IAV) evaluiert. SA-basierte PGs waren nur bei der Inhibition einer geringen Anzahl an IAV Stämmen effektiv. Um die molekulare Basis für diese Beschränkung zu ergründen, wurden mittels Serienpassagen IAV Mutanten selektiert, die gegen sialyliertes PG resistent waren. Es entwickelten sich drei unabhängige resistente Virusvarianten, die einen einfachen bzw. doppelten Aminosäuren-Austausch in der HA RBS aufwiesen. Durch Hemagglutinations-Elution, Einzel-Virus Kraft-Untersuchungen und Glykanarray Analysen konnte eine verringerte Rezeptorbindungsstabilität sowie ein verändertes Rezeptorbindeprofil für diese Virusvarianten gezeigt werden. Interessanterweise wurden drei unterschiedliche Fälle von Virusbindung und Inhibition beobachtet: 1) Virales HA wurde vom PG gebunden und die Virusreplikation inhibiert, 2) virales HA wurde vom PG gebunden ohne Inhibition der Virusreplikation und 3) Virales HA wurde nicht vom PG gebunden und es gab keine Inhibition. Diese Ergebnisse suggerieren, dass es eine Mindestanforderung an die Affinität oder Avidität für eine effektive kompetitive Inhibition von HA gibt. Durch modifizierte PGs, die Sialyllaktose statt SA und einen Amidlinker enthielten, konnte das Potential von PGs als breite IAV Inhibitoren demonstriert werden. Zusammenfassend bieten die Ergebnisse dieser Arbeit wertvolle Einblicke in die Entwicklung von Resistenzen in IAV gegen Inhibitoren des HA-Attachment und in das strategische Design von sialylierten mutlivalenten Inhibitoren gegen IAV. / A promising approach to block influenza virus infections is competitive inhibition of virus attachment to host cells by interfering with binding of the viral surface protein hemagglutinin (HA) to sialylated glycan receptors. However, the high structural and genetic variability of the viral HA has hampered the development of universal sialic acid (SA)-based antivirals. Here, the antiviral effect of biocompatible Polyglycerols (PGs) functionalized with SA on influenza A virus (IAV) was evaluated. PG compounds were only effective at inhibiting a narrow spectrum of IAV strains. To elucidate the molecular basis for this restriction, PG-resistant IAV mutants were selected using serial passaging. Three independent resistant variants developed with single or double amino acid changes mapping to the HA RBS. By employing hemagglutination elution, single-virus force measurements and glycan array analyses, a reduced receptor binding stability as well as an altered receptor binding profile of mutant viruses was shown. Intriguingly, three different cases of virus binding and inhibition were observed using Cy3-labeled compound: 1) viral HA was bound by the compound and resulted in inhibition of replication, 2) viral HA was bound by the compound but replication was not inhibited and 3) viral HA was not bound by the compound and no inhibition occurred. These results suggest that there is an affinity or avidity requirement for effective competitive inhibition of HA attachment. The suitability of PGs as IAV inhibitors with potential for broad activity was demonstrated by a modified PG incorporating sialyllactose instead of SA and an amide linkage covering an extended spectrum of inhibited IAV strains. Taken together, results described in this thesis provide valuable insights into the development of resistance against inhibitors of HA attachment in IAV and into the strategic design of sialylated, multivalent inhibitors aiming at broad activity against influenza viruses.

Eukaryontische Zellen besitzen ein Zytoskelett, ein zelluläres Netzwerk aus Biopolymeren. Unter diesen Biopolymeren sind die Mikrotubuli weitgehend konserviert. Diese aus Tubulin aufgebauten Filamente sind dynamisch und wechseln zwischen Phasen des Wachstums und der Schrumpfung. Die genauen Mechanismen, die die dynamische Instabilität der Mikrotubuli bestimmen, werden noch erforscht. Die Allgegenwart von Mikrotubuli wirft die Frage auf, wie sie in verschiedenen thermischen Umgebungen konservierte Funktionen ausführen können. Um dieser Fragestellung nachzugehen, habe ich verwandte Froscharten mit unterschiedlich temperierten Lebensräumen untersucht: Xenopus laevis (16-22 °C), Xenopus borealis (19-23 °C) und Xenopus tropicalis (22-30 °C). Um zu untersuchen, ob sich die biochemischen Eigenschaften von Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli bei den drei Arten an die Temperatur angepasst hat, habe ich die Methoden der Tubulin-Affinitätsreinigung und die temperaturgesteuerte TIRF-Mikroskopie zur Rekonstitution der Mikrotubuli-Dynamik kombiniert. Dabei habe ich festgestellt, dass bei einer Temperatur von 25°C die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikrotubuli im Bezug zur thermischen Nische der einzelnen Arten negativ korreliert. Die Verwendung der Arrhenius-Gleichung zum Vergleich der Aktivierungsenergie der Mikrotubuli-Polymerisation für jede Spezies ergab, dass die freie Energie des Tubulins umso höher ist, je kälter die thermische Nische der Spezies ist. Die Mikrotubuli von X. laevis und X. borealis zeigten eine längere Lebensdauer und wurden häufiger zerstört als die von X. tropicalis. Die Tubuline von X. laevis und X. borealis sind phosphoryliert, im Gegensatz zu X. tropicalis. Die Ergebnisse zeigen, dass sich Xenopus Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli an die Temperatur angepasst haben. Kalt lebende Arten kommen mit der niedrigeren Energie des Milieus zurecht, durch verbessertes Wachstum und Stabilität. / Eukaryotic cells hold a cytoskeleton, a cellular network of biopolymers. Among the filaments of the cytoskeleton, microtubules are widely conserved. Built from tubulin, those filaments are dynamic, alternating between phases of growth and shrinkage. The biochemical properties of tubulin shape the dynamic behavior of microtubules, which is crucial for many cellular processes. The precise mechanisms determining microtubule dynamic instability are still under investigation. The ubiquity of microtubules raises the question of how they can perform conserved functions within various thermal environments. To address this, I turned to closely related frog species living at different temperatures, Xenopus laevis (niche: 16-22°C), Xenopus borealis (19-23°C) and Xenopus tropicalis (22-30°C). To probe whether the biochemical properties of tubulin and microtubule dynamics adapted to temperature across those three species, I combined tubulin affinity purification and temperature-controlled TIRF microscopy of in vitro reconstitution of microtubule dynamics. I found that at 25°C, the microtubule growth velocity inversely correlates with the thermal niche of each species. Adjusting temperature to each species’ endogenous condition modulates the growth rate differences across species. Using the Arrhenius equation to compare the activation energy of microtubule polymerization for each species suggested that the colder the thermal niche of the species, the higher the free energy of its tubulin. Microtubules from the cold-adapted species X. laevis and X. borealis have longer lifetimes and rescue more often than those of X. tropicalis, both at 25°C and at each species’ endogenous condition. X. laevis and X. borealis tubulins are phosphorylated, contrary to X. tropicalis. My results show that Xenopus tubulin and microtubule dynamics have adapted to temperature. Cold-living species cope with the lower energy of the milieu by facilitating growth and stability.

Die Fähigkeit Nukleinsäuren in lebenden Organismen nachzuweisen und zu visualisieren, ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Prozesse. Die Forschungsgruppe von Prof. Dr. Oliver Seitz hat zu diesem Zweck fluorogene FIT-Hybridisierungssonden entwickelt, die die besondere Eigenschaft der Cyaninfarbstoffe Thiazolorange und Chinolinblau nutzen, stärker zu fluoreszieren, wenn sie in die beengte Umgebung eines Nukleinsäureduplex aus Sonde und spezifischer Zielsequenz eingebracht werden. Obwohl FIT-Sonden eine gute Fluoreszenzverstärkung und Spezifität aufweisen, wäre eine weitere Verbesserung ihrer Helligkeit und des Signal-Hintergrund-Verhältnisses wünschenswert. Um dies zu erreichen, wurde in dieser Arbeit ein Ansatz untersucht, bei dem FIT-Sonden mit zwei Fluorophoren desselben Typs ausgestattet werden (FIT2-Strategie). Dies sollte sowohl die Helligkeit der Sonde erhöhen, als auch die Fluoreszenz im Einzelstrang und bei Hybridisierung mit fehlgepaarter RNA durch eine Mischung aus kontaktvermittelter Fluo-reszenzlöschung und strahlungsfreiem Energietransfer verringern. Verschiedene Sonden-längen, Farbstoffabstände und -positionen wurden untersucht und es konnte bestätigt werden, dass FIT2-Sonden eine höhere Extinktionskoeffizienten, größere Fluoreszenzver-stärkung und eine bessere Selektivität aufweisen als einfach markierte Sonden. Außerdem behalten sie ihre Fähigkeit zur Unterscheidung von Match- und Mismatch-Zielen in visko-sem Zelllysat besser bei. Zudem konnte gezeigt werden, dass das FIT2-Konzept durch Hinzufügen eines hybridisie-rungsunempfindlichen Cyanin 7 Farbstoffs zu den Sonden dahingehend erweitert werden kann, dass eine ratiometrische Detektion der hybridisierten Sonde möglich ist und Hellig-keitsunterschiede aufgrund von lokalen Schwankungen der Sondenkonzentration bei der Bildgebung lebender Zellen korrigiert werden können. Mit diesen qFIT2-Sonden konnten Jurkat und CCRF-CEM T-Zellen in einem Mikroskopie-basierten Experiment unterschieden werden. / The ability to detect and visualize nucleic acids in living organisms is crucial for under-standing cellular processes. For this purpose, the research group of Prof. Dr. Oliver Seitz has introduced fluorogenic forced intercalation (FIT) hybridization probes, which exploit the unique property of the cyanine dyes thiazole orange and quinoline blue to exhibit increased fluorescence when placed in the constrained environment of a nucleic acid du-plex formed between probe and specific target sequence. Although FIT probes demon-strate solid fluorescence enhancement and specificity, further improvement of their abso-lute brightness and signal-to-background ratio would be desirable. To achieve this, the present thesis investigated an approach that equips FIT probes with two identical fluorophores (FIT2 strategy). This should on the one hand increase probe brightness, while simultaneously reducing fluorescence in the single strand and when hy-bridized to mismatched RNA, through a combination of contact-mediated quenching and non-radiant energy transfer. Various probe lengths, dye-dye distances and positions were screened, and it could be confirmed that FIT2 probes have higher extinction coefficients, greater fluorescence enhancement and better selectivity than their mono-dye counter-parts. Moreover, they better retain their ability to discriminate match and mismatch tar-gets in viscous cell lysate. Finally, it was demonstrated that the FIT2 concept can be extended by adding a hybridiza-tion-insensitive Cyanine 7 dye to the probes, allowing ratiometric detection of hybridized probe and correction of brightness differences due to local fluctuations in probe concen-tration during live-cell imaging. Using these qFIT2 probes, Jurkat and CCRF-CEM T-cells could be distinguished in a microscopy-based experiment.

RNA-bindende Proteine sind zentrale Regulatoren der Genexpression, aber ihre Funktionen bei der Koordinierung von Zellschicksalsentscheidungen sind unzureichend verstanden. In dieser Studie haben wir RNA interactome capture angewandt, um die globalen Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während der Auflösung der Pluripotenz und neuronaler Differenzierung zu bestimmen. Wir haben entdeckt, dass 30-40% der RNA-bindenden Proteine sehr dynamisch während der Zellschicksalentscheidungen sind, die Abundanzdynamiken dieser Proteine aber nicht hauptursächlich dafür zu sein scheinen. Basierend auf unseren Daten haben wir ZAP (ZC3HAV1) als einen Faktor identifiziert, der mit Pluripotenz assoziiert ist. Um die Rolle von ZAP in der Stammzellbiologie zu analysieren, haben wir PAR-CLIP, SLAMseq und einen Differenzierungsassay angewandt. Unsere Daten haben gezeigt, dass ZAP mehr als 2,000 mRNA-Transkripte innerhalb des murinen Stammzelltranskriptoms in Abhängigkeit von CG-Dinukleotiden bindet. Zieltranskripte sind angereichert mit Genfunktionen in Zell-Zell-Interaktionen, Gewebemorphogenese und Pluripotenzregulation und werden in Abwesenheit von ZAP stabilisiert. Auβerdem haben wir herausgefunden, dass Depletion von ZAP zu flacherer und breiterer Koloniemorphologie von Stammzellen bei gleichzeitiger Fehlexpression von hunderten von Genen inklusive Lineage-Faktoren führt. Desweiteren führt Abwesenheit von ZAP zu erhöhter Geschwindigkeit bei der Auflösung der Pluripotenz. Zusammengefasst stellen wir die These auf, dass ZAP ein multi-modaler Regulator der Pluripotenz ist. ZAP agiert als positiver Regulator während Aufrechterhaltung der Pluripotenz, während es am Anfang der Pluripotenzauflösung pluripotenz-fördernde Faktoren herunterreguliert. Schlussendlich demonstriert diese Studie, wie die Erforschung von Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während Zellschicksalsentscheidungen neue Wege öffnet, um die Funktion von RNA-bindenden Proteinen im entwicklungsbiologischen Kontext zu analysieren. / RNA-binding proteins are key regulators of gene expression, but their functions in coordinating cell fate transitions are poorly understood. In this study, we applied RNA interactome capture to determine the global dynamics of the RNA-bound proteome during dissolution of pluripotency and neuronal differentiation. We discovered that 30-40% of RNA-binding proteins are highly dynamic during cell fate transitions and that these dynamics do not appear to be predominantly governed by alterations in their abundance. Based on our data, we identified ZAP (ZC3HAV1) as a factor highly associated with pluripotency. In order to dissect the role of ZAP in mESC biology, we applied a variety of approaches including PAR-CLIP, SLAMseq and pluripotency exit reporter assays. We found that ZAP binds more than 2,000 mRNAs in the mESC transcriptome in a CG dinucleotide-dependent manner. Targets are enriched for transcripts encoding cell-cell adhesion, tissue morphogenesis and pro-pluripotency regulators and stabilized in absence of ZAP. Furthermore, we found that ZAP depletion leads to flattened and spreading stem cell colony morphology, concomitant misexpression of hundreds of transcripts including lineage factors and accelerated early dissolution of pluripotency. In conclusion, we propose that ZAP is a multi-modal stem cell RNA-binding protein acting as a positive regulator in maintenance of pluripotency while aiding downregulation of pro-pluripotent factors at the onset of differentiation. Ultimately, this study demonstrates how exploration of RNA-bound proteome dynamics during cell fate transitions can open paths to dissecting functions of RNA-binding proteins in a developmental context.