A necessidade de tratamentos mais eficazes e menos invasivos para os pacientes, em adição à capacidade de diferenciação celular da medula óssea sugere que o transplante de células mononucleares totais poderia ser uma das melhores formas de tratamento para as diversas patologias existentes. Entretanto, vários fatores implicam sobre a viabilidade das células da medula óssea dos quais destacamos a ausência de padronização de protocolo de criopreservação que permita a manutenção da viabilidade celular, sendo altamente necessário o desenvolvimento de estudos nesta área. Deste modo, neste estudo, após a anestesia de um grupo de animais foi realizada punção da medula óssea, separação das células mononucleares e avaliação da viabilidade. Foram testados oito meios diferentes para criopreservação das células. O meio de congelamento A é composto por 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium (DMEM) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento B contém 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento C tem em sua composição 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% soro fetal bovino (SFB) e 40% plasma autólogo, o meio de congelamento D é composto de 20% dimetilsulfóxido (DMSO) e 80% de plasma autólogo, o meio E constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) e 47,5% de plasma autólogo, o meio F contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 47,5% de plasma autólogo, o meio G contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de soro fetal bovino (SFB) e 47,5% de plasma autólogo e o meio H constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO) e 95% de plasma autólogo. Após as análises realizadas pela técnica de citometria de fluxo, o meio mais eficiente na criopreservação das células mononucleares de suínos foi o protocolo D por possuir maior concentração de plasma autólogo e crioprotetor. / The necessity of the most efficient and less invasive treatments for the patients, in addition to the capacity of cellular differentiation of the bone marrow suggests that the transplant of mononuclear total cells might be one of the best treatment for several pathologies. Meantime, several factors influence on the viability of the cells of the bone marrow as the absence of standardization of criopreservação protocol which could allow the maintenance of the cellular viability, being an important issue of investigation. In this study, after the anaesthesia of a group of animals, samples of bone marrow were collected, following the separation of the mononuclear cells and evaluation of the viability. Eight different protocols were tested for cells criopreservation. The protocol A by 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 40% autologus plasma, B protocol conatained 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 40% autologus plasma, the C protocol was composed 20 % dimetilsulfóxido (DMSO), 40% bovine fetal serum (SFB) e 40% autologus plasma, D protocol was made using 20% dimetilsulfóxido (DMSO) and 80% autologus plasma, E protocol was constituted by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 47,5% autólogo plasma, the F contains 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 47,5% autologo plasma, the protocol G was compoed by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de bovine feta serum (SFB) and 47,5% autologus plasma and the H protocol was 5% dimetilsulfóxido (DMSO) and 95% autologus plasma. After flux citometer analyses, the most efficient protocol in criopreservation of the mononuclear cells of pigs was the protocol D which was composed the by the most amount of autologus plasma and crioprotectant.

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-16T18:51:03Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao_JaquelineUrbanMoura.pdf: 1509481 bytes, checksum: 50fc9b8749e3c39f430ae1e85248c04f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T18:51:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_JaquelineUrbanMoura.pdf: 1509481 bytes, checksum: 50fc9b8749e3c39f430ae1e85248c04f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-03-20 / Mangiferin is a natural bioactive, more specifically a glycosylated xanthone which was originally isolated from Mangifera indica L., mango tree, belonging to the family Anacardiaceae. It has a variety of pharmacological activities already studied, including antioxidant, anti-diabetic, antitumoral, hepatoprotective, antiviral, among others. Mangiferin presents very poor water solubility, and low chemical stability, which makes difficult the formulation of a suitable pharmaceutical drug delivery system. A strategy for preserving the chemical integrity and enhancing the bioavailability of poorly watersoluble drugs is nanoencapsulation. In this way, mangiferin nanocapsule suspensions were prepared at the concentration of 250 μg/mL using interfacial deposition of pre-formed polymer technique containing as polymer Eudragit® S100 and as a co-solvent dimethylsulfoxide (DMSO). The suspensions were characterized by determining pH, particle diameter, polydispersity index, zeta potential, drug content, encapsulation efficiency, release profile and morphology (transmission electronic microscopy - TEM). In order to assess the initial profile of cytotoxicity, cellular viability and irritability tests were conducted through diphenyltetrazolium bromide (MTT) test and Hen’s Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET CAM), respectively. Mangiferin nanocapsules showed acid pH, particle diameter of 92 nm, polydispersity index > 0.2, zeta potential of -18.31 mV, encapsulation efficiency of 71.78 % ± 1.54, and drug loading of 88.17 ± 1.80 %. The analytical method validation was performed through studies of specificity, linearity, limit of detection and quantification, robustness, precision and accuracy of high performance liquid chromatography (HPLC) method using a mobile phase of water and methanol(70:30), acidified with acetic acid (pH 3.5), with determination at 254 nm. The method was linear (r = 0.9996) and precise (RSD = 1.71 % for intra-day and RSD = 1.80 % for interdays precision). The accuracy was 94.98 %. The robustness indicated that temperature, flow rate and pH of the mobile phase did not interfere in the analysis. TEM demonstrated that nanocapsules of mangiferin showed adequate morphological characteristics and were not aggregated, presenting homogeneous size. In order to study the release profile, dialysis technique was used, and 54.88% of mangiferin was released to the medium within 24 hours. The results of MTT assay showed no significant difference (p ˂ 0.0 ) in viability of cells treated with 0.75 mg/mL, 1.5 mg/mL and 2.5 mg/mL suspension of mangiferin nanocapsules , when compared with the control. HET CAM test showed that nanocapsules had a slightly irritating profile compared to the negative control, probably due to its acidic pH, which does not impair its use. Based on these results, we can conclude that mangiferin nanocapsules are a promising alternative for therapeutic use of this drug, especially for oral administration. As future prerspectives, further in vivo and in vitro studies are needed to evaluate its pharmacokinetics and toxicity. / A mangiferina é um composto natural, mais especificamente uma xantona glicosilada, que foi originalmente isolada da Mangifera indica L., a mangueira, pertencente à família Anacardiaceae. Possui uma variedade de atividades farmacológicas já estudadas, incluindo ação antioxidante, antidiabética, antitumoral, hepatoprotetora antiviral, entre outras. A mangiferina apresenta baixa solubilidade em água, além de baixa estabilidade química, o que dificulta a formulação de uma forma farmacêutica adequada para administração oral. Uma estratégia para preservar a integridade química e aumentar a biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em água é a nanoencapsulação. Desta forma, suspensões de nanocápsulas de mangiferina foram preparadas na concentração de 250 μg/mL pela técnica de deposição interfacial do polímero pré-formado, contendo como polímero o Eudragit® S100 e como um co-solvente o dimetilsolfóxid (DMSO). As suspensões foram caracterizadas através da determinação do pH, diâmetro de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, taxa de associação, doseamento do fármaco, perfil de liberação e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Para avaliar o perfil preliminar de citotoxicidade, foram realizados testes de viabilidade celular e irritabilidade através do teste de 3-4, 5-dimethylthiazolyl-2-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) e o Hen’s Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET CAM), respectivamente As nanocápsulas de mangiferina apresentaram pH ácido, diâmetro de partícula de 92 nm, índice de polidispersão menor que 0,2, potencial zeta de -18,3 mV, a eficiência de encapsulação foi de 71,78% ± 1,54 e o doseamanto foi de 88,17±1,80. A validação do método foi realizada através de estudos de especificidade, linearidade, limite de detecção, quantificação, robustez, precisão e exatidão através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando como fase móvel água e metanol, 70:30 acidificada com ácido acético glacial (pH 3,5),com determinação em 254 nm. O método apresentou linearidade (r= 0,9996) e precisão (DPR= 1,71%, reprodutibilidade interna e DPR= 1,80%, repetibilidade). A exatidão foi de 94,98%. A robustez indicou que a temperatura, o fluxo e o pH da fase móvel não interferem na análise. A MET demostrou que as nanocápsulas de mangiferina apresentaram boas características morfológicas, estando com tamanho homogêneo e não agregadas. Para o estudo do perfil de liberação, foi empregada a técnica de diálise, sendo que 54,88% de mangiferina foi liberada para o meio, em 24 horas. Os resultados do ensaio de MTT mostram que não houve diferença significativa (p ˂ 0,05) na viabilidade celular das células tratadas com 0,75 μg/mL, 1,5 μg/mL e 2,5 μg/mL de suspensão de nanocápsulas de mangiferina, quando comparadas com o controle. Já o teste de HET CAM demonstrou que as nanocápsulas de mangiferina possuem um perfil levemente irritante, comparadas com o controle negativo, provavelmente devido ao seu pH ácido, o que não inviabiliza seu uso. Com base nestes resultados, podemos concluir que as nanocápsulas de mangiferina são uma alternativa promissora de uso terapêutico deste fármaco, principalmente por via oral. Como perspectivas futuras, são necessários mais estudos in vivo e in vitro para avaliação de sua farmacocinética e toxicidade.

Este trabalho tem como objetivo estudar filmes finos de polímeros semicondutores preparados a partir de dispersões coloidais de poli(3,4 etilenodioxitiofeno)/poli(estirenosulfonato de sódio) (PEDOT:PSS), submetidos a tratamentos físico-químicos para alterar as suas características morfológicas e estruturais, melhorando a condutividade elétrica e mantendo um bom nível de transmitância óptica na faixa de comprimento de onda da luz visível. Foram utilizadas no estudo duas dispersões coloidais comerciais de PEDOT:PSS, identificadas como P1 e P2. O P1 descrito pelo fornecedor como de grau condutivo (1 S.cm-1) e P2 de grau altamente condutivo (<100 ?/?). Foram produzidos filmes finos em três procedimentos diferentes e realizadas medidas de resistência elétrica e transmitância óptica. Na primeira série, os filmes foram preparados por spin-coating da dispersão coloidal original de PEDOT:PSS e seguidos pelo recozimento na estufa. Na segunda série, foi adicionado à dispersão coloidal original de PEDOT:PSS um solvente orgânico polar, o dimetilsulfóxido (DMSO), após a centrifugação, a dispersão sobrenadante foi depositada para a preparação de filmes finos como descrito na etapa anterior. Na terceira série, à parte sobrenadante da dispersão coloidal de PEDOT:PSS preparada na segunda série, foi adicionada uma solução precursora de nanopartículas de prata (Tinta Reativa de Prata) (TRP2) e a dispersão coloidal foi depositada para formar filmes finos como descrito anteriormente. As resistividades elétricas com os valores mais significativos foram de filmes de P1 e de P2 depositados a 2000 rpm. Para P1 foram observadas resistividades de 1,37 ?.cm, 0,34 ?.cm e 0,18 ?.cm, para as dispersões coloidais P1 original, P1 tratado com DMSO e P1 tratado com DMSO/TRP2, respectivamente, correspondendo a uma redução de 87% do valor da resistência elétrica da primeira para a terceira série. A transmitância óptica dos filmes a 550 nm se manteve entre 80~90% para todas as séries, nas análises por espectroscopia no UV-Vis. Para os filmes de P2, depositadas a 2000 rpm, as resistividades elétricas nos filmes foram de 0,76 ?.cm, 0,015 ?.cm e 0,0012 ?.cm, para P2 original, P2 tratado com DMSO e P2 tratado com DMSO/TRP2, respectivamente, correspondendo a uma redução de 99,8% do valor da resistência elétrica da primeira para a terceira série. O valor da transmitância óptica dos filmes a 550 nm manteve-se entre 85~90% na primeira e segunda série, entretanto para os filmes da terceira série, devido à presença da fase prata grosseira, reduziu-se para o intervalo entre 40~60%. / This work aims to study thin films of semiconducting polymers prepared from colloidal dispersions of poly(3,4-ethylenedioxythiophene)/poly(styrenesulfonate) (PEDOT: PSS), submitted to physicochemical treatments in order to change their microstructural features and improve their electrical conductivity, while maintaining a good level of optical transmittance in the visible wavelength range. Two types of commercial colloidal dispersions of PEDOT:PSS were used in the study, named as P1 and P2. The P1 is described as a conductive grade (250 ?/?) and P2, highly conductive grade (<100 ?/?). Thin films were produced from colloidal dispersions through three different procedures and their electrical resistance and optical transmittance were measured. In the first series, films were prepared by spin-coating of the PEDOT: PSS pristine colloidal dispersion, followed by annealing in the oven. In the second series, to the pristine colloidal dispersion of PEDOT:PSS a polar organic solvent dimethylsulfoxide (DMSO) was added, then after centrifugation, the supernatant colloidal dispersion was deposited to form thin films as described previously. In the third series, to the supernatant colloidal dispersion of PEDOT:PSS prepared in the second series, a silver nanoparticle precursor solution (Reactive Silver Ink) (TRP2) was added and the colloidal dispersion was deposited to form thin films as described previously. Electrical resistivity with the most significant values from P1 and P2 films deposited at 2000 rpm. For the films from P1, 1.37 ?.cm, 0.34 ?.cm and 0.18 ?.cm were observed, for pristine colloidal dispersion, with DMSO and with DMSO and TRP2, respectively; corresponding to a reduction of 87% of the electrical resistance from the first to the third series. The optical transmittance of films at 550 nm, as measured by UV-Vis spectroscopy, was maintained in the range 80~90% for all series. For the films from P2, the electrical resistances were observed to vary from 0.76 ?.cm to 0.015 ?.cm and 0.0012 ?.cm, for pristine P2 colloidal dispersion, after DMSO addition and with DMSO and TRP2, respectively, corresponding to a reduction of 99.8% in the electrical resistance from the first series to the third one. The optical transmittance of films at 550 nm was observed to remain in the range 85~90% for the first and second series, while the third series, due to the massive presence of a coarse silver phase, dropped to the range 40~60%.

A necessidade de tratamentos mais eficazes e menos invasivos para os pacientes, em adição à capacidade de diferenciação celular da medula óssea sugere que o transplante de células mononucleares totais poderia ser uma das melhores formas de tratamento para as diversas patologias existentes. Entretanto, vários fatores implicam sobre a viabilidade das células da medula óssea dos quais destacamos a ausência de padronização de protocolo de criopreservação que permita a manutenção da viabilidade celular, sendo altamente necessário o desenvolvimento de estudos nesta área. Deste modo, neste estudo, após a anestesia de um grupo de animais foi realizada punção da medula óssea, separação das células mononucleares e avaliação da viabilidade. Foram testados oito meios diferentes para criopreservação das células. O meio de congelamento A é composto por 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium (DMEM) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento B contém 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento C tem em sua composição 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% soro fetal bovino (SFB) e 40% plasma autólogo, o meio de congelamento D é composto de 20% dimetilsulfóxido (DMSO) e 80% de plasma autólogo, o meio E constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) e 47,5% de plasma autólogo, o meio F contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 47,5% de plasma autólogo, o meio G contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de soro fetal bovino (SFB) e 47,5% de plasma autólogo e o meio H constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO) e 95% de plasma autólogo. Após as análises realizadas pela técnica de citometria de fluxo, o meio mais eficiente na criopreservação das células mononucleares de suínos foi o protocolo D por possuir maior concentração de plasma autólogo e crioprotetor. / The necessity of the most efficient and less invasive treatments for the patients, in addition to the capacity of cellular differentiation of the bone marrow suggests that the transplant of mononuclear total cells might be one of the best treatment for several pathologies. Meantime, several factors influence on the viability of the cells of the bone marrow as the absence of standardization of criopreservação protocol which could allow the maintenance of the cellular viability, being an important issue of investigation. In this study, after the anaesthesia of a group of animals, samples of bone marrow were collected, following the separation of the mononuclear cells and evaluation of the viability. Eight different protocols were tested for cells criopreservation. The protocol A by 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 40% autologus plasma, B protocol conatained 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 40% autologus plasma, the C protocol was composed 20 % dimetilsulfóxido (DMSO), 40% bovine fetal serum (SFB) e 40% autologus plasma, D protocol was made using 20% dimetilsulfóxido (DMSO) and 80% autologus plasma, E protocol was constituted by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 47,5% autólogo plasma, the F contains 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 47,5% autologo plasma, the protocol G was compoed by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de bovine feta serum (SFB) and 47,5% autologus plasma and the H protocol was 5% dimetilsulfóxido (DMSO) and 95% autologus plasma. After flux citometer analyses, the most efficient protocol in criopreservation of the mononuclear cells of pigs was the protocol D which was composed the by the most amount of autologus plasma and crioprotectant.

O curto período de armazenamento dos concentrados de plaquetas (CP), de 5 a 7 dias, torna esse hemocomponente crítico para os serviços de hemoterapia. A criopreservação se apresenta então como uma possibilidade para a manutenção dos estoques por período mais prolongado. Essa prática exige a adição de substância crioprotetora e a adequação do volume em relação à concentração de plaquetas. O CP obtido por aférese (CPAF) é um hemocomponente proveniente de um único doador, coletado em sistema automatizado, que equivale a 6-8 unidades de CP obtidas da coleta de doadores convencional. Objetivo: Avaliar o efeito da criopreservação de CPAF no quinto dia do armazenamento, por meio de análises imunofenotípicas e funcionais das plaquetas, utilizando o crioprotetor dimetilsulfóxido (DMSO) a 5%, em freezer a -80°C e descongelamento em banho maria a 37°C, sem a remoção do crioprotetor. Material e Métodos: Foram analisadas 20 unidades de CPAF em quatro fases diferentes do processo: Fase I (pré-redução de volume), Fase II (pós-repouso, agitação e adição do DMSO), Fase III (pós-descongelamento) e Fase IV (após duas horas de descongelamento e agitação). Todas as bolsas foram avaliadas quanto à presença do \"swirling\" plaquetário, e análise microbiológica, contagem de plaquetas e leucócitos, determinação do volume plaquetário médio (VPM), análise do pH, dosagem de desidrogenase lática (DHL) e glicose, a ativação plaquetária por meio de citometria de fluxo com os marcadores CD61, CD62P e anexina V e para a avaliação funcional, as técnicas de microagregação plaquetária e retração do coágulo. Os resultados de cada fase foram analisados e comparados, considerando resultados p< 0,05 de significância estatística, avaliada pelos testes de Wilcoxon e Teste-T pareado. Resultados: Todos os CPs criopreservados apresentaram na inspeção visual presença de \"swirling\" e ausência de grumos. O pH manteve-se com mediana de 7,185 (6,076-7,528) pra fase III, análise microbiológica foi negativa em todas as unidades criopreservadas, o número mediano de plaquetas caiu de 3,04x1011/U na Fase II para 2,27x1011/U na fase III (redução de 25,32%). A ativação plaquetária na fase II foi de 23% CD62P+ para 44% CD62P+ na fase III (p=0,067). O marcador anexina V estava expresso em 13% das plaquetas na fase II e em 11% na fase III, (p=0,33). A LDH aumentou de 747 U/L (4-3079) para 1.428 U/L (662-2303) da fase II para a fase III, respectivamente (p=0,055). A glicose diminuiu em todas as fases (p<0,0001). Os testes de função plaquetária revelaram que a plaquetas descongeladas mantêm sua função. Conclusão: Os resultados obtidos mostraram que, embora tenham ocorrido ativação e redução significativa do número de plaquetas, o produto final conservou quantidade suficiente de plaquetas, cujas funções foram mantidas, o que torna viável a utilização do hemocomponente CP criopreservado. Sugere ainda que os CPAF possam ser criopreservados no quinto dia de armazenamento, com o uso do DMSO a 5%, ideal para que não se faça necessário sua remoção pós-descongelamento. / The concentration time of the platelet concentrates (CP), from 5 to 7 days, makes this blood component critical for hemotherapy services. Cryopreservation presents itself as a possibility of maintaining stocks for a longer period. This practice requires an additional cryoprotectant and a suitability of volume in relation to platelet concentration. The CP collected by the same (CPAF) is a blood component of a single dosage, being collected in an automated system, which is equivalent to 6-8 CP units from the collection of conventional donors. Objective: To evaluate the effect of CPAF cryopreservation on the fifth day of storage, by means of immunophenotypic and functional platelet analysis using the 5% DMSO cryoprotectant in a freezer at -80 ° C and thawing in a Maria bath at 37 ° C, without removal of the cryoprotectant. Material and Methods: 20 units of CPAF were analyzed in four different phases of the process: Phase I (pre-reduction of volume), Phase II (post-rest, agitation and DMSO addition), Phase III (post-thaw) and Phase IV (after two hours of thawing and shaking). All units were evaluated for platelet swirling and microbiological analysis, platelet and leukocyte counts, determination of mean platelet volume (MVP), pH analysis, lactate dehydrogenase (LDH) and glucose, platelet activation by means of flow cytometry with the markers CD61, CD62P and annexin V and for the functional evaluation, platelet microaggregation and clot retraction techniques. The results of each phase were analyzed and compared, considering results p <0.05 of statistical significance, evaluated by the Wilcoxon and Paired T-test. Results: All cryopreserved CPs presented visual presence of \"swirling\" and absence of lumps. The pH was maintained at a median of 7.185 (6.076- 7.528) for phase III, microbiological analysis was negative in all cryopreserved units, the median number of platelets fell from 3.04x1011/U in Phase II to 2.27x1011/U in phase III (reduction of 25.32%). Phase II platelet activation was 23% CD62P + to 44% CD62P + in phase III (p=0.067). The annexin V marker was expressed in 13% of platelets in phase II and 11% in phase III (p=0.33). LDH increased from 747 U/L (4-3,079) to 1,428 U / L (662-2303) from phase II to phase III, respectively (p<0,0055). Glucose decreased in all phases (p <0.0001). Platelet function tests have revealed that thawed platelets maintain their function. Conclusion: The results showed that, although activation and significant reduction of platelet count occurred, the end product preserved sufficient quantity of platelets, whose functions were maintained, which makes the use of the cryopreserved CP blood component viable. It also suggests that CPAFs can be cryopreserved on the fifth day of storage using 5% DMSO, so that their post-thaw removal is not required.

A series of macrocyclic FeIII/II and CoIII/II transition metal complexes has been selected and tested to serve as artificial mediators in redox potentiometry of proteins and also in catalytic cyclic voltammetry of redox active enzymes. The potentials of these mediators ranges approximately from +200 mV to -600 mV vs the normal hydrogen electrode (NHE) at pH 7, which spans the range of most redox active proteins. These coordination complexes are mostly stable in both the oxidized and the reduced forms and show pH-independent electrochemistry within the range 6 < pH < 9. A significant advantage of these mediators is to exhibit very weak visible absorption maxima which enable proteins with low extinction coefficients to be studied by optical potentiometry without spectral interference from the mediators. These mediators have been applied to the catalytic electrochemistry of dimethyl sulfoxide (DMSO) reductase. DMSO reductase isolated from Rhodobacter capsulatus has been studied extensively in this work. It is an 82 kDa monomeric, soluble enzyme found in the periplasmic space of the organism where it is responsible for catalyzing the reduction of DMSO to dimethyl sulfide (DMS). DMSO is a rather inert and difficult to analyse compound, which appears in foods and beverages, such as wine, coffee, and tea. Enzyme based methods offer an effective way to detect DMSO in these samples. Rhodobacter capsulatus DMSO reductase contains only a single molybdenum cofactor which cycles between MoVI and MoIV during catalysis and provides a rare example of a Mo enzyme that has no other cofactors such as hemes, Fe-S clusters and flavins. Previous studies of direct (unmediated) electrocatalysis by DMSO reductase have shown only modest activity in comparison to that of other Mo enzymes. Mediated electrochemistry of DMSO reductase from Rhodobacter capsulatus using low-potential macrocyclic complexes such as [Co(trans-diammac)]3+, [Co(cis-diammac)]3+, or [Co(AMMEsar)]3+ as a mediator has been studied. The normal transient CoIII/II voltammetric response of the complex is converted into a sigmoidal (steady state) waveform in the presence of both DMSO and DMSO reductase. A single set of enzymatic rate and equilibrium constants has been determined through digital simulation (DigiSim) of the cyclic voltammetry performed under conditions where the scan rate, DMSO concentration, DMSO reductase concentration and mediator concentration were varied systematically. This information provides new insight to the kinetics of the DMSO reductase catalytic mechanism that has never before been obtained from steady state or stopped flow kinetics studies. Of note is that lowering the thermodynamic driving force by sequentially raising the redox potential of the mediator ([Co(trans-diammac)]3+ to [Co(cis-diammac)]3+ to [Co(AMMESar)]3+) slows the enzyme-mediator electron transfer reaction in accord with Marcus theory. Finally, preparation of enantiomerically pure sulfoxides by an electrochemical enzymatic system utilizing DMSO reductase from Rhodobacter capsulatus has also been investigated. This method has been performed using the coordination complex [Co(trans-diammac)]3+ as an electron donor during bulk electrocatalysis. The results indicate that DMSO reductase from R. capsulatus prefers to catalyze the reduction of both R-MPTSO (methyl p-tolyl sulfoxide) and R-MPSO (methyl phenyl sulfoxide) over their S-enantiomers. These results have been rationalized on the basis of the published crystal structure of DMSO reductase (R. capsulatus) with DMSO bound at the active site.

A series of macrocyclic FeIII/II and CoIII/II transition metal complexes has been selected and tested to serve as artificial mediators in redox potentiometry of proteins and also in catalytic cyclic voltammetry of redox active enzymes. The potentials of these mediators ranges approximately from +200 mV to -600 mV vs the normal hydrogen electrode (NHE) at pH 7, which spans the range of most redox active proteins. These coordination complexes are mostly stable in both the oxidized and the reduced forms and show pH-independent electrochemistry within the range 6 < pH < 9. A significant advantage of these mediators is to exhibit very weak visible absorption maxima which enable proteins with low extinction coefficients to be studied by optical potentiometry without spectral interference from the mediators. These mediators have been applied to the catalytic electrochemistry of dimethyl sulfoxide (DMSO) reductase. DMSO reductase isolated from Rhodobacter capsulatus has been studied extensively in this work. It is an 82 kDa monomeric, soluble enzyme found in the periplasmic space of the organism where it is responsible for catalyzing the reduction of DMSO to dimethyl sulfide (DMS). DMSO is a rather inert and difficult to analyse compound, which appears in foods and beverages, such as wine, coffee, and tea. Enzyme based methods offer an effective way to detect DMSO in these samples. Rhodobacter capsulatus DMSO reductase contains only a single molybdenum cofactor which cycles between MoVI and MoIV during catalysis and provides a rare example of a Mo enzyme that has no other cofactors such as hemes, Fe-S clusters and flavins. Previous studies of direct (unmediated) electrocatalysis by DMSO reductase have shown only modest activity in comparison to that of other Mo enzymes. Mediated electrochemistry of DMSO reductase from Rhodobacter capsulatus using low-potential macrocyclic complexes such as [Co(trans-diammac)]3+, [Co(cis-diammac)]3+, or [Co(AMMEsar)]3+ as a mediator has been studied. The normal transient CoIII/II voltammetric response of the complex is converted into a sigmoidal (steady state) waveform in the presence of both DMSO and DMSO reductase. A single set of enzymatic rate and equilibrium constants has been determined through digital simulation (DigiSim) of the cyclic voltammetry performed under conditions where the scan rate, DMSO concentration, DMSO reductase concentration and mediator concentration were varied systematically. This information provides new insight to the kinetics of the DMSO reductase catalytic mechanism that has never before been obtained from steady state or stopped flow kinetics studies. Of note is that lowering the thermodynamic driving force by sequentially raising the redox potential of the mediator ([Co(trans-diammac)]3+ to [Co(cis-diammac)]3+ to [Co(AMMESar)]3+) slows the enzyme-mediator electron transfer reaction in accord with Marcus theory. Finally, preparation of enantiomerically pure sulfoxides by an electrochemical enzymatic system utilizing DMSO reductase from Rhodobacter capsulatus has also been investigated. This method has been performed using the coordination complex [Co(trans-diammac)]3+ as an electron donor during bulk electrocatalysis. The results indicate that DMSO reductase from R. capsulatus prefers to catalyze the reduction of both R-MPTSO (methyl p-tolyl sulfoxide) and R-MPSO (methyl phenyl sulfoxide) over their S-enantiomers. These results have been rationalized on the basis of the published crystal structure of DMSO reductase (R. capsulatus) with DMSO bound at the active site.

O objetivo deste trabalho foi determinar o protocolo mais eficiente de criopreservação de tecido ovariano utilizando o sistema automático de congelação, que requer rampas de resfriamento gradativo, modelo Freeze Control®, para comparar a integridade do tecido ovariano congelado através de duas diferentes curvas de congelação combinadas com dois diferentes crioprotetores: dimetilsulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG). Para a realização do trabalho foram utilizadas 20 ratas Wistar que foram submetidas à oofarectomia bilateral. Os ovários foram divididos em duas partes, uma parte foi criopreservada em DMSO 1,5M e a outra em EG 1,5M. Ainda, foram analisadas duas curvas de congelamento (curva lenta com duração de 1h e 50min, e uma curva rápida com duração de 35 min). As amostras de tecido, após congelação, foram descongeladas, fixadas e processadas para a coloração com hematoxilina e eosina para a análise da integridade dos oócitos. Finalmente fez-se a análise e quantificação dos folículos íntegros versus os não íntegros, como também o dano tecidual. Para a análise folicular foi utilizado o microscópio óptico em aumento de 400x e realizou-se a classificação dos folículos pré-antrais de acordo com o estágio de desenvolvimento em primordiais e primários. Os resultados foram submetidos à ANOVA e as comparações entre as médias feitas pelo teste de Tukey com (P<0,05). Nos resultados foi observado que no tecido criopreservado os folículos que persistiram íntegros em cada ovário foram os primordiais em 79% e primários em 29%. Já no tecido não congelado (controle) foram encontrados todos os tipos foliculares, primordiais, primários, secundários, pré-antrais e antrais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se vacuolizacão citoplasmática e contorno irregular. Quanto às alterações irreversíveis foi encontrado picnose. Concluindo, no tecido ovariano criopreservado, foram encontrados apenas folículos primordiais e primários apresentando alterações histológicas reversíveis e irreversíveis. Além disso, o crioprotetor EG promoveu uma melhor preservação destes folículos, comparado com o DMSO. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa, na preservação dos folículos, quando se comparou as duas curvas de congelação. / The aim of this study was to determine the most efficient protocol of cryopreservation of ovarian tissue using authomatic freezing system. This system requires Freeze Control® ramps of gradative cooling to compare the integrity of frozen ovarian tissue through two different freezing curves together with two different cryoprotectants: dimethilsulphoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG). In this work 20 Wistar female rats were submitted to bilateral oophorectomy. The ovaries were divided in two parts, one part was cryopreserved in DMSO 1,5M and the other in EG 1,5M. Two frozen curves (a slow curve lasting 1h and 50min and a rapid curve lasting 35min) were analyzed. The tissue samples were frozen and after defrosted, fixed, and processed to hematoxylin and eosin staining to analyse oocyte. The analysis and quantification of integrated follicles, non-integrated, and tissue damage was performed. In the follicular analysis it was used 400x optical microscope and performed the classification of pre-antral follicles in primordial and primary according to their stage of development. The results were submitted to ANOVA and the comparasions between the averages were done using the Tukey test (P<0,05). It was observed that in the cryopreserved tissue the follicles remaining integrated in each ovary were 79% primordial and 29% primary. In the non-frozen tissue (control) were found all kinds follicular primordial, primary, secondary, preantral and antral follicles. Cytoplasmic vacuolization and irregular cell outline were identified among reversible alterations. Picnosis was found as an irreversible alteration. To conclude only primordial and primary follicles were enconutered in the ovarian tissue cryopreserved and there are revisable and irreversible histological alterations. Furthermore, the crioprotectant EG was more efficient then DMSO in other to preserve a higher number of primordial and primary viable folicules. No statistical significant difference was detected when we compare the two curves of cryopreservation system.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-05-08T13:14:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 143104 bytes, checksum: e10cdeabc002cbd306bcf6dff0777353 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-08T13:14:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 143104 bytes, checksum: e10cdeabc002cbd306bcf6dff0777353 (MD5) Previous issue date: 2003-12-11 / O presente trabalho teve por objetivo aprimorar o protocolo para multiplicação in vitro de videira Vitis aestivalis (Michx.) cv. Norton, sendo dividido em três etapas: seleção de formulações salinas; definição de doses de BAP; e teste do DMSO. As formulações MS, MS 50%, C2D, C2D 50%, B5, NN e Knudson C foram testadas em meio de cultura contendo 4 μM de BAP. Às formulações C2D e C2D 50% foram testados diferentes níveis de BAP (0, 2, 4, 8 e 16 μM), num fatorial 2 x 5. O DMSO foi testado em dois experimentos, constituídos de três tratamentos: 2 e 4 μM de BAP dissolvido em 2 e 4 mL de DMSO, respectivamente; 2 e 4 μM de BAP dissolvido em HCl 1N; e 2 e 4 μM de BAP dissolvido em HCl 1N, com adição de alíquotas de DMSO correspondentes ao primeiro tratamento. O delineamento estatístico foi o de Blocos Casualizados, com seis repetições, nas três etapas. A unidade experimental consistiu de um frasco de cultivo com cinco explantes. O meio de cultura foi constituído de 10 mL L-1 de vitaminas de Staba, 100 mg L-1 de mio-inositol, 30 g L-1 de sacarose, com pH ajustado para 5,70 ± 0,01, acrescido de 10 g L-1 de ágar. Distribuíram-se 30 mL de meio em frascos de vidro de 320 mL, diâmetros externo e interno de 68 mm e 65 mm, e 125 mm de altura, fechados com tampa de polipropileno e filme de PVC, que foram esterilizados em autoclave à 121oC e 1,5 atm, por 20 minutos. Em câmara de fluxo laminar, os explantes foram inoculados verticalmente no meio de cultura. Os frascos foram dispostos em sala de cultura à 27 ± 2oC, umidade relativa de 60 a 70 %, fotoperíodo de 16/8 horas e irradiância de 90 μmol m-2 s-1. A avaliação foi feita aos 30 dias, quanto ao peso fresco de calo, número e comprimento de brotos. As formulações salinas C2D e C2D 50% foram as melhores, destacando-se C2D com maior taxa de multiplicação, brotosm alongados e reduzido peso fresco de calo. A taxa de multiplicação aumentou linearmente nestas formulações, sendo os maiores comprimentos de brotos, 12,10 mm e 7,80 mm, respectivamente, obtidos com 6,14 μM e 5,13 μM. Níveis elevados de BAP reduziram a qualidade dos brotos, aumentando o índice de hiperhidricidade. A dissolução de BAP em DMSO aumentou significativamente o número de brotos. A presença do DMSO como componente do meio de cultura aumentou tanto a massa fresca de calo para ambas as doses, quanto o número de brotos para 4 μM de BAP. O comprimento ideal de brotos na multiplicação in vitro de videira é de, no mínimo 10 mm, para tanto recomenda-se 12,5 μM de BAP para o cv. Norton, nível no qual são obtidos 5,63 brotos/explante, com reduzida formação de calo. / The purpose of this work was to improve a protocol for in vitro multiplication of grape Vitis aestivalis (Michx.) cv. Norton, realized into three stages: salt constitution selection; citokinins (BAP) levels effective determination; and DMSO test on in vitro culture. The salt constitution MS, MS 50%, C2D, C2D 50%, B5, NN and Knudson C were evaluated on medium culture containing 4 μM BAP. Different BAP levels (0, 2, 4, 8 and 16 μM), were evaluated on C2D and C2D 50% salt constitution, in a 2 x 5 factorial. DMSO was evaluated in two experiments with three treatments: 2 and 4 μM BAP dissolved in 2 and 4 mL DMSO, concerning; 2 and 4 μM BAP dissolved in HCl 1N; and 2 and 4 μM BAP dissolved in HCl 1N, adding the same DMSO quantity concerning at first treatment. A randomized complete-block design with six blocks was used in all stages. The experimental unit consisted of a flask containing five explants. The culture medium was composed by 10 mL L-1 Staba vitamins, 100 mg L-1 mio-inositol, 30 g L-1 sucrose, pH adjusted to 5,70 ± 0,01, with 10 g L-1 agar-agar increased. Flasks with 320 mL capacity, 2.68 and 2.56 inches external and intern diameter, 4.92 inch height, containing 30 mL culture medium, were stoppered with polipropilen top and PVC film, and after were sterilized at 121 oC and 1.5 atm, during 20 minutes. In sterile chamber, explants were vertical inoculated in culture medium. Flasks were placed in a growth room at 27 ± 2oC, under a 16-h light//8-h dark photoperiod and a photon flux density of 90 μmol m-2 s-1. Estimation was made at 30 days, for callus fresh weight, shoot number and length. C2D and C2D 50% salt constitution were the best, with higher multiplication rate, length shoots and smaller callus fresh weight in C2D salt. Multiplication rate linear increased in these salt constitutions, with greater shoot length, 0.48 and 0.31 inches, concerning, obtained at 6.14 μM and 5.13 μM. Higher BAP levels caused shoots quality reducing, with hyperhidricity index increase. BAP dissolution in DMSO expressive increased shoot number. Culture medium containing DMSO how a component increased both callus fresh weight in both levels, and shoot number at 4 μM BAP. Ideal shoot number on in vitro multiplication of grape is the least 0.39 inches, for which recommend 12.5 μM BAP to cv. Norton, level which obtains 5.63 shoots/explant, with reducing callusing. / Não foram localizados o cpf e o currículo lattes do autor.

O objetivo deste trabalho foi determinar o protocolo mais eficiente de criopreservação de tecido ovariano utilizando o sistema automático de congelação, que requer rampas de resfriamento gradativo, modelo Freeze Control®, para comparar a integridade do tecido ovariano congelado através de duas diferentes curvas de congelação combinadas com dois diferentes crioprotetores: dimetilsulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG). Para a realização do trabalho foram utilizadas 20 ratas Wistar que foram submetidas à oofarectomia bilateral. Os ovários foram divididos em duas partes, uma parte foi criopreservada em DMSO 1,5M e a outra em EG 1,5M. Ainda, foram analisadas duas curvas de congelamento (curva lenta com duração de 1h e 50min, e uma curva rápida com duração de 35 min). As amostras de tecido, após congelação, foram descongeladas, fixadas e processadas para a coloração com hematoxilina e eosina para a análise da integridade dos oócitos. Finalmente fez-se a análise e quantificação dos folículos íntegros versus os não íntegros, como também o dano tecidual. Para a análise folicular foi utilizado o microscópio óptico em aumento de 400x e realizou-se a classificação dos folículos pré-antrais de acordo com o estágio de desenvolvimento em primordiais e primários. Os resultados foram submetidos à ANOVA e as comparações entre as médias feitas pelo teste de Tukey com (P<0,05). Nos resultados foi observado que no tecido criopreservado os folículos que persistiram íntegros em cada ovário foram os primordiais em 79% e primários em 29%. Já no tecido não congelado (controle) foram encontrados todos os tipos foliculares, primordiais, primários, secundários, pré-antrais e antrais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se vacuolizacão citoplasmática e contorno irregular. Quanto às alterações irreversíveis foi encontrado picnose. Concluindo, no tecido ovariano criopreservado, foram encontrados apenas folículos primordiais e primários apresentando alterações histológicas reversíveis e irreversíveis. Além disso, o crioprotetor EG promoveu uma melhor preservação destes folículos, comparado com o DMSO. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa, na preservação dos folículos, quando se comparou as duas curvas de congelação. / The aim of this study was to determine the most efficient protocol of cryopreservation of ovarian tissue using authomatic freezing system. This system requires Freeze Control® ramps of gradative cooling to compare the integrity of frozen ovarian tissue through two different freezing curves together with two different cryoprotectants: dimethilsulphoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG). In this work 20 Wistar female rats were submitted to bilateral oophorectomy. The ovaries were divided in two parts, one part was cryopreserved in DMSO 1,5M and the other in EG 1,5M. Two frozen curves (a slow curve lasting 1h and 50min and a rapid curve lasting 35min) were analyzed. The tissue samples were frozen and after defrosted, fixed, and processed to hematoxylin and eosin staining to analyse oocyte. The analysis and quantification of integrated follicles, non-integrated, and tissue damage was performed. In the follicular analysis it was used 400x optical microscope and performed the classification of pre-antral follicles in primordial and primary according to their stage of development. The results were submitted to ANOVA and the comparasions between the averages were done using the Tukey test (P<0,05). It was observed that in the cryopreserved tissue the follicles remaining integrated in each ovary were 79% primordial and 29% primary. In the non-frozen tissue (control) were found all kinds follicular primordial, primary, secondary, preantral and antral follicles. Cytoplasmic vacuolization and irregular cell outline were identified among reversible alterations. Picnosis was found as an irreversible alteration. To conclude only primordial and primary follicles were enconutered in the ovarian tissue cryopreserved and there are revisable and irreversible histological alterations. Furthermore, the crioprotectant EG was more efficient then DMSO in other to preserve a higher number of primordial and primary viable folicules. No statistical significant difference was detected when we compare the two curves of cryopreservation system.