Abstract During DNA replication cells accurately copy their DNA to transfer the genetic information to daughter cells. DNA polymerases synthesise the new DNA strand using the old strand as a template. Other functions of DNA polymerases are recombination linked and DNA iamage repair linked DNA synthesis, regulation of replication complex formation and regulation of transcription – a process in which the genetic information is transformed into an RNA sequence needed to guide protein synthesis. In this study, the TopBP1 protein was shown to associate with DNA polymerase epsilon. TopBP1 contains eight BRCT domains mediating interactions between phosphorylated proteins and is a human homolog of bakers yeast Dpb11 and fission yeast Cut5. These yeast proteins act on DNA replication and cell cycle arrest after DNA damage. TopBP1 was found to be phosphorylated and expressed in elevated amounts during S phase suggesting an involvement in DNA replication. This was directly demonstrated by DNA synthesis inhibition by a competing TopBP1 fragment and by an antibody targeted to block TopBP1. Ultraviolet irradiation damages DNA and decreases the amount of TopBP1 in the nucleus. The transcription factor Miz-1 was found to associate with TopBP1 and was released from this interaction after UV damage. Free Miz-1 activated the expression of the cell cycle arresting proteins p15 and p21 cooperatively with other transcription factors and allowed extra time for DNA damage repair. TopBP1 was also found to interact with the breast cancer susceptibility protein 1 and both proteins localised together to arrested DNA synthesis apparatuses. The interaction of TopBP1 with the damage recognition and processing protein Rad9 is still further evidence of a link between TopBP1 and DNA damage. DNA polymerase epsilon forms a complex with Cdc45, a protein involved in DNA replication initiation and elongation. This complex does not interact with Cdc45 complexed with DNA polymerase delta, suggesting that these complexes synthesise DNA independently of each other. Our results are in agreement with the view that polymerase epsilon synthesises the first strand of DNA and polymerase delta the other. Finally,DNA polymerase epsilon binds to the RNA synthesising form of RNA polymerase II and nascent transcripts. The physiological meaning of this interaction needs to be determined.

La duplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée à partir de l'activation de plusieurs dizaines de milliers d'origines de réplication. La mise en place des origines a lieu au cours de la phase G1 sous la forme de complexe de pré-réplication (pré-RC) et leur activation est orchestrée par un programme spatio-temporel. La régulation spatiale détermine les origines qui seront activées et la régulation temporelle, ou timing de réplication, détermine le moment de leur activation. En effet, toutes ces origines ne sont pas activées en même temps durant la phase S : certaines origines seront activées en début de phase S, d'autre en milieu, ou d'autre à la fin. Ce programme est établi en tout début de phase G1, au " point de décision du timing ". C'est un programme très robuste qui signe l'identité d'une cellule, son état de différenciation et le type cellulaire à laquelle elle appartient. Il a aussi été montré qu'il est altéré dans des situations pathologiques, en particulier le cancer, sans qu'on ne comprenne très bien les raisons mécanistiques. De manière générale, les mécanismes moléculaires qui régulent le timing de réplication sont méconnus. Le premier volet de ma thèse a permis l'identification d'un nouveau régulateur du timing de réplication : il s'agit de l'ADN polymérase spécialisée Thêta. Recrutée à la chromatine très tôt en phase G1, elle interagit avec des composants du pré-RC, et régule le recrutement des hélicases réplicatives à la chromatine. Enfin, sa déplétion ou sa surexpression entraîne une modification du timing de réplication à l'échelle du génome. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai exploré les mécanismes qui régulent ce programme temporel d'activation des origines suite à un stress réplicatif. J'ai identifié un mécanisme de régulation transgénérationnel inédit : la modification du timing de réplication de domaines chromosomiques ayant subi un stress réplicatif au cycle cellulaire précédent. Des cellules-filles issues d'une cellule ayant subi des problèmes de réplication dans des domaines fragiles (riches en AT, et donc potentiellement structurés, et pauvres en origines) présentent un timing plus précoce de l'activation des origines au niveau de ces domaines. Ce nouveau processus biologique d'adaptation est particulièrement intéressant dans un contexte tumoral de haut stress réplicatif chronique car ce pourrait être un moyen pour la cellule tumorale de survivre à son propre stress réplicatif mais aussi aux thérapies antitumorales qui sont nombreuses à cibler la réplication de l'ADN. / DNA duplication in S phase starts from thousands of initiation sites called DNA replication origins. These replication origins are set in G1 as pre-replication complexes (pre-RC) and fired in S phase following a spatio-temporal program of activation. This program determines which origins will be fired and when. Indeed, all the origins are not fired in the same time and we can distinguish early, middle and late replication origins. This temporal regulation is called "replication timing" and is determined at the "timing decision point" (TDP) in early G1. It's a robust program, which participates to the definition of cell identity, in term of differentiation state or cell type. However, the precise molecular mechanisms involved are poorly understood. Defective timing program has been evidenced in pathological contexts, in particular in cancers, but the mechanisms of this deregulation remain unclear. In the first part of my PhD, I contributed to the discovery of a new regulator of the origin timing program: the specialized DNA polymerase Theta (Pol Theta). Pol Theta is loaded onto chromatin in early G1, coimmunoprecipitates with pre-RC components and modulates the recruitment of Mcm helicases at TDP. Moreover, depletion or overexpression of Pol Theta modifies the timing of replication at a fraction of chromosomal domains. The second part of my work aimed at exploring the mechanisms that regulates replication timing after a replicative stress. I identified a totally new transgenerational adaptive mechanism of DNA replication timing regulation: the modification of the timing of origin activation at chromosomal domains that have suffered from a replicative stress during the previous cell cycle. Daughter cells from a cell that has experienced replication stress at particular domains (late replicating domains, AT rich so they can form structured DNA, and poor in origin density) shows advanced origin activation within these regions. This new biological process in response to replicative stress could be of particular interest in the context of cancer since, tumor cells are characterized by high level of intrinsic chronic replicative stress. This new mechanism may favor cancer cell survival despite replication stress, particularly upon treatments with anti-tumor agents that target DNA.

La réplication de l'ADN est un évènement majeur pour la cellule car elle permet la duplication fidèle du matériel génétique. Il s'agit d'une étape critique du cycle cellulaire, car les fourches de réplication rencontrent fréquemment des barrières naturelles ou des lésions d'origine endogènes (lésions oxydatives) ou exogènes (agents physiques ou chimiques), sources de cassures chromosomiques et donc d'instabilité génétique. Une des réponses à ces fourches bloquées est l'activation du point de contrôle (checkpoint) de la phase S du cycle cellulaire. Nous avons montré que l'ADN polymérase Kappa (pol Kappa), polymérase dite translesionnelle en raison de ses capacité à franchir des lésions sur l'ADN, s'avère être aussi un acteur du point de contrôle de phase S. En effet, la déplétion de pol Kappa par ARN interférence dans différentes lignées cellulaires ou par immunodépletion d'un extrait de Xénope, entraîne un défaut de phosphorylation de Chk1. Pol Kappa est impliquée dans la synthèse de brins naissant d'ADN au niveau des fourches bloquées, ce qui facilite le recrutement du complexe 9-1-1 composé des protéines Rad9, Rad1 et Hus1et permet alors, une activation correcte du checkpoint de phase S. Afin de décrypter le rôle de pol kappa, nous avons construits différents mutants et nous avons analysé leur capacité à former des foyers, à être recrutés à la chromatine et à interagir avec différents partenaires dans des conditions d'activation du point de contrôle de phase S. Nous avons pu constater que le mutant du domaine d'interaction à PCNA était incapable de former des foci foyers ?. Nous avons ensuite observé, qu'en condition de stress réplicatif, pol Kappa était recruté à la chromatine grâce à son domaine d'interaction à PCNA et par différentes approches biochimiques, nous avons pu voir que pol kappa interagissait avec Rad9 et Chk1. Nous avons également mis en évidence que le défaut d'activation de Chk1 en l'absence de pol kappa reflétait d'une diminution de son taux dans le noyau, suggérant une régulation commune entre Chk1 et pol Kappa. En effet, nous avons observé que pol Kappa, comme Chk1, était régulés par l'ubiquitine hydrolase USP7. En effet, l'interaction entre pol Kappa et USP7 est augmentée en condition de stress. Nous avons pu voir, qu'à l'instar de Chk1, l'absence de USP7 entrainait une baisse du niveau de pol kappa dans le noyau. Ainsi nous proposons qu'en réponse à un stress réplicatif, pol Kappa et Chk1 soient stabilisés via leur dé-ubiquitination par USP7, permettant leur recrutement à la chromatine et une activation correcte du checkpoint de phase S. Parallèlement à ces travaux, des publications récentes montrent une implication possible de pol Kappa au niveau des séquences répétées. Nous avons pu mettre en évidence une interaction entre pol Kappa et Cenpb, protéine centromérique reconnaissant une séquence de 17 paires de bases dans l'ADN a-satellite. Ces résultats préliminaires suggèrent que le rôle de pol Kappa dans le checkpoint de phase S s'adresse notamment aux régions d'hétérochromatine. L'ensemble des résultats obtenus montre l'importance de pol Kappa dans le maintien de la stabilité génomique, par son rôle dans le checkpoint de phase S, et par son implication dans la régulation de Chk1 en condition de stress réplicatif. / DNA replication is a major event for cells which allow the faithful duplication of genetic material. It is a critical step of cell cycle, because replication forks encounters frequently naturals barriers (non B-DNA structures), exogenous barriers (chemicals agents), or endogenous barriers (oxydatives lesions). These different barriers can be at the origin of chromosomes breaks and lead to genetic instability. To overcome the stalled forks, cells have evolved two major mechanisms: the induction of ATR replication checkpoint pathway and the recruitment of specialized DNA polymerase to perform the translesion synthesis. This two pathways are essential to maintain genomic stability. Human DNA polymerase Kappa (pol Kappa), the most conserved specialized DNA polymerase, is best known to participate to translesion synthesis. Recently, we have shown that pol kappa has a crucial role in the S-phase checkpoint activation. Indeed, pol Kappa is implicated in the synthesis of short DNA intermediates at the stalled forks, facilitating the recruitment of 9-1-1 clamp, and is required for an optimal phosphorylation of Chk1, the main effector of the S-phase checkpoint. Durant my PhD thesis, I explored the molecular mechanisms underlying this newly identified role. We have constructed several pol kappa mutants, and we have observed that for the mutation in the PCNA binding domain impeded pol kappa to form foci in response to replication stress. We also showed the requirement of this domain for pol Kappa recruitment on chromatin. By different experimental approaches, we have described a complex in which pol Kappa interacts with Rad9 and Chk1, two proteins required for the S-phase checkpoint activation. The Chk1 phosphorylation defect observed in absence of Kappa could also be the consequence of the Chk1 protein level decreased in the nucleus, meaning a potential common regulation between pol Kappa and Chk1. Based on this observation, we have studied how pol Kappa is regulated upon a replication stress and like Chk1, pol Kappa seems to be regulated by ubiquitination. We focused our attention on USP7 an ubiquitin hydrolase known to regulate Chk1. We have demonstrated an interaction between pol Kappa and USP7, which is stimulated after replication stress. Moreover, USP7 depletion leads to a decrease of pol Kappa level in the nucleus, suggesting that de-ubiquination of pol Kappa could to be a prerequisite for its checkpoint function and its stability.

Chez les plantes, les méristèmes ont la capacité de se diviser tout au long de la vie de la plante, qui peut dépasser 1000 ans pour certaines espèces. De plus, la lignée germinale n'est pas définie dès l'embryogenèse mais provient des cellules méristématiques et s’individualise relativement tard au cours du développement. Il est donc crucial que le cycle cellulaire soit finement régulé afin d'éviter une accumulation de mutations au cours de la croissance végétative et de la reproduction. Chez tous les eucaryotes, les protéines CDT1 sont impliquées dans l’initiation de la réplication de l'ADN en permettant la formation du complexe de pré-réplication et l'ouverture de la fourche de réplication avant le recrutement des ADN polymérases. Leur activité est strictement régulée afin que chaque partie du génome soit répliquée une fois et une seule au cours de la phase S. Le génome d’Arabidopsis thaliana code pour deux protéines homologues du facteur d’initiation de la réplication CDT1 (CDC10 Target1) : AtCDT1a et AtCDT1b. La sur-expression de CDT1a stimule la réplication de l’ADN et, chez Arabidopsis, cette protéine aurait une double fonction dans la régulation du cycle cellulaire et dans la division des plastes. Nous avons étudié ici les fonctions respectives de AtCDT1a et AtCDT1b. En utilisant des approches génétiques, nous avons montré que ces deux protéines jouent des rôles partiellement redondants pour maintenir l’intégrité du génome et permettre le développement des gamétophytes. De plus, en réalisant une approche de TAP (Tandem Affinity Purification), nous avons montré qu’elles interagissent avec l’ADN polymérase ε, une ADN polymérase réplicative, ouvrant de nouvelles perspectives de recherche concernant le rôle des protéines CDT1de plantes lors de la réplication de l'ADN. En parallèle, nous avons essayé d'élucider les spécificités de CDT1a et plus précisément de son extension N-terminale qui est absente de CDT1b. Nous avons constaté que ce domaine de CDT1a est requis pour son interaction avec l'ADN pol ε, et que les mutants cdt1a complémentés par une version tronquée de la protéine présentent une croissance considérablement réduite, un arrêt prématuré du méristème racinaire, et un stress de l'ADN constitutif, ce qui suggère que l’interaction CDT1a/pol ε est indispensable à la progression normale de la phase S. L’ensemble de nos résultats ont révélé de nouvelles fonctions pour les homologues de CDT1 de plantes. Une question importante sera de déterminer si celles-ci sont caractéristiques du cycle cellulaire chez les plantes, ou si nous avons identifié de nouveaux mécanismes qui sont conservés chez tous les eucaryotes. / In plants, meristems retain the ability to divide throughout the life cycle of plants, which can last for over 1000 years in some species. Furthermore, the germline is not laid down early during embryogenesis but originates from the meristematic cells relatively late during development. Thus, accurate cell cycle regulation is of utmost importance to avoid the accumulation of mutations during vegetative growth and reproduction. In all eukaryotes, CDT1 proteins are involved in the onset of DNA replication by allowing the formation of the pre-replication complex and subsequent opening of the replication fork. Their activity is strictly regulated to ensure faithful duplication of the genome during S-phase. The Arabidopsis thaliana genome encodes two homologs of the replication licensing factor CDT1 (CDC10 Target 1): AtCDT1a and AtCDT1b. Overexpression of CDT1a stimulates DNA replication, and this protein would have a function both in cell cycle regulation and plastid division.Here, we have investigated the respective roles of Arabidopsis CDT1a and CDT1b. Using genetic approaches, we have shown that the two proteins function partially redundantly to maintain genome integrity and allow gametophyte development. In addition, using Tandem Affinity Purification, we have shown that they interact with DNA pol ε, a replicative DNA polymerase, opening further research prospects regarding the role of plant CDT1 proteins during DNA replication. In parallel, we have tried to elucidate the specificities of CDT1a and more precisely of its N-terminal extension that is absent from CDT1b. We have found that this domain of CDT1a is required for its interaction with DNA pol ε, and that cdt1a mutants complemented with a truncated version of the protein show drastically reduced growth, premature meristem arrest, and constitutive DNA stress, suggesting that the CDT1a/pol ε interaction is indispensible to the normal progression of S-phase. Together, our results have unraveled new functions for plant CDT1 homologues, and one important aspect of future research will be to determine whether these are features of the plant cell cycle, or if we have identified new mechanisms that are conserved in all eukaryotes.

This work discusses applications of computational simulations to enzymatic systems with a particular focus on the effects of various small perturbations on cancer and disease-related systems. First, we cover the development of carbohydrate-based PET imaging ligands for Galectin-3, which is a protein overexpressed in pancreatic cancer tumors. We uncover several structural features for the ligands that can be used to improve their binding and efficacy. Second, we discuss the AlkB family of enzymes. AlkB is the E. coli DNA repair protein for alkylation damage, and has human homologues with slightly different functions and substrates. Each has a conserved active site with a catalytic iron and a coordinating His...His...Asp triad. We have applied molecular dynamics (MD) to investigate the effect of a novel single nucleotide polymorphism for AlkBH7, which is correlated with prostate cancer and has an unknown function. We show that the mutation leads to active site distortion, which has been confirmed by experiments. Thirdly, we investigate the unfolding of hen egg white lysozyme in 90% ethanol solution and low pH, to show the initial steps of unfolding from a native-like state to the disease-associated beta-sheet structure. We compare to mass spectrometry experiments and also show differing pathways based on protonation state. Finally, we discuss three different DNA polymerase systems. DNA polymerases are the primary proteins that replicate DNA during cell division, and have various extra or specific functions. We look at a proofreading-deficient DNA polymerase III mutant, the effects of solvent on DNA polymerase IV's ability to bypass bulky DNA adducts, and a variety of mutations on DNA polymerase kappa.

Probiotic lactic acid bacteria of genus Lactobacillus play an important role in the digestive tract of human. They are used in food processing and they are the part of food supplements. Lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus can be identificated by polymerase chain reaction (PCR). Bacterial DNA was isolated from cell lysates of 4 synbiotic food suplements by magnetic particles P(HEMA-co-GMA). Isolated DNA was amplified by genus-specific and species-specific primers. Magnetic particles with immobilized antibodies against Lactobacillus bacteria were used in the next part of thesis. These particles were used for isolation target cells from products with their identification by genus specific PCR.

Probiotic lactic acid bacteria (LAB) are very often used in food procesing industry, such as milk products, cheese and fermentsd salami production in nova days. In diploma thesis were tested symbiotic food supplements from different producers. Bacterial DNA was isolated from crude cell lysates of six food suplements by magnetic particles P(HEMA-co-GMA). PCR-ready DNAs were isolated. from all products The detection of Bifidobacterium bacteria identified by PCR was in agreement with those declared by the manufacturers. Magnetic particles with immobilized antibodies against Bifidobacterium were used in the next part of thesis. These particles were used for the isolation of target cells from two products with cell identification by genus specific PCR.

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