Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-10T19:39:08Z No. of bitstreams: 1 2014_OtavioBravimdaSilva.pdf: 1922867 bytes, checksum: dbcb4c4c303fda4471705d99bcd96cbd (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-14T13:22:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_OtavioBravimdaSilva.pdf: 1922867 bytes, checksum: dbcb4c4c303fda4471705d99bcd96cbd (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-14T13:22:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_OtavioBravimdaSilva.pdf: 1922867 bytes, checksum: dbcb4c4c303fda4471705d99bcd96cbd (MD5) / As sedas produzidas pelos aracnídeos são essencialmente constituídas de proteínas, as quais são secretadas por glândulas específicas, sendo também encontradas em diferentes grupos de artrópodes. Todos os individuos da classe dos aracnídeos produzem sedas, com diversas funções, sendo todas essas sedas sintetizadas por glândulas presentes no abdômen e polimerizadas por meio de uma série de estruturas denominadas fiandeiras ou fieiras, que são anexos finais da glândula. As aranhas podem possuir em seu corpo ate sete tipos diferentes de glândulas produtoras de seda. Sendo assim, diferentes glândulas produzem diferentes fibras, permitindo então a comparação entre a fibra produzida e sua função, pois cada uma possui propriedades distintas, sendo compostas por motivos de sequência, que conferem a cada uma suas propriedades. Há anos as sedas de aranha tem sido estudadas devido a sua resistência mecânica, que é extremamente superior a do bicho-da-seda. A dificuldade de obtenção dessas sedas através da domesticação de aranhas, que são extremamente agressivas e territorialistas, aliada a possibilidade de produção de novos materiais com propriedades semelhantes, motivaram o desenvolvimento de estrategias alternativas para a producao dessa seda, utilizando a tecnologia do DNArecombinante. Este projeto visou a manipulação e expressão de biopolimeros produzidos a partir de um gene isolado da glandula ampola da principal, produtora de seda da aranha brasileira Parawixia bistriata emmicroorganismos do dominio Bactéria também modificados para possivel aumento da expressão desta proteína. Após produção e purificação, as proteínas de seda foram extruidas para formação de fibra e analises estruturais foram feitas para verificação da qualidade do processo de extrusão, bem como identificação de algumas características moleculares da proteína. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Silks produced by spiders are mainly consisting of proteins, which aresecreted by specific glands, also found in different arthropod groups. Allindividual from the Arachnida class produce silks with different functions, allthese silks are synthesized by glands in the abdomen and polymerizedthrough a series of structures called spinnerets, final appendix of the silkglands. Spiders can have on your body up to seven different types of silkproducingglands. Thus, different glands produce different fibers, thusallowing a comparison between the fiber produced and its function, becauseeach one has different properties and is composed of repetitive amino acidmodules that give each one its properties. For years the spider silks havebeen studied due to its mechanical strength, which is far superior tosilkworm silk. The difficulty of obtaining these silks through thedomestication of spiders, which are extremely aggressive and territorial,combined with the possibility of producing new materials with similarproperties, motivated the development of alternatives for the production ofthis silk strategies using recombinant DNA technology. This project aimed atthe manipulation and expression of biopolymers produced from a geneisolated from the major ampulate gland from the Brazilian spider Parawixiabistriata, which produce spider silk, in microorganisms of the domainBacteria also modified to increase the expression of this protein. Afterproduction and purification, the silk proteins were spun into fibers andstructural analysis were made for verification of the quality of the spinprocess, as well to identify some molecular characteristics of the protein.

Made available in DSpace on 2015-07-08T12:28:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 13.pdf: 1194887 bytes, checksum: 54a931fb645150833adeccae7c782e0b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A eritropoietina humana recombinante (rhEPO) é produzida em células de ovário de hamster chinês (CHO) pela tecnologia do DNA recombinante (rDNA) e vem sendo amplamente utilizada na prática clínica, para redução da necessidade de transfusão sanguínea em processos cirúrgicos e no tratamento de anemias de várias etiologias, incluindo anemia devido à doença renal crônica; relacionada ao câncer ou ao tratamento do mesmo, anemia relacionada à utilização de zidovudina, utilizada para terapia de pacientes infectados pelo HIV e anemia relacionada à utilização de ribavirina, utilizada para terapia de pacientes portadores de hepatite C. Diante da gama de produtos contendo rhEPO disponíveis no mercado, da abrangência da indicação terapêutica e das características dos pacientes usuários de rhEPO, é de grande importância o efetivo controle da qualidade deste produto previamente ao seu ingresso no mercado. Neste contexto, a avaliação da potência biológica é um dos ensaios preconizados para produtos contendo rhEPO, devendo ser realizada a cada lote produzido, antes que o mesmo possa ser liberado para uso da população. A Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.) preconiza o ensaio de potência biológica de rhEPO, recomendando a utilização da linhagem de camundongos B6D2F1. Entendendo que a possibilidade de utilização de outras linhagens de camundongos seria de grande utilidade para laboratórios produtores, assim como para os laboratórios de controle da qualidade, o presente estudo teve como objetivo principal avaliar a concordância entre os valores de potência biológica obtidos com a linhagem preconizada pela Ph. Eur. (B6D2F1) e Swiss Webster (SW). Todos os resultados foram considerados válidos e satisfatórios, pois cumpriram com os critérios de regressão, linearidade e paralelismo. Os resultados se mantiveram dentro dos limites estabelecidos pela Ph. Eur. / The recombinant human erythropoietin (rhEPO) is produced in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells by recombinant DNA technology (rDNA) and has been widely used in clinical practice, to reduce the need for blood transfusion and in surgical procedures for treatment of anemia of various etiologies; including anemia due to chronic kidney disease, cancer-related or treatment thereof, anemia related to the use of zidovudine therapy used for patients infected with HIV, anemia related to the use of ribavirin, used for therapy of patients with hepatitis C. Given the range of products available on the market containing rhEPO, the scope of the therapeutic indication and characteristics of patients using rhEPO, it is of great importance to effective control the quality of this product prior to its entry into the market. The assessment of biological potency is a recommended test by the European Pharmacopoeia (Ph. Eur) for products containing rhEPO, and B6D2F1 is the mice strain recommended for this test. The possibility of using other mouse strains would be useful for producing laboratories, as well as for quality control laboratories. For this reason, the present study aimed to evaluate the agreement between values obtained with the strain recommended by the Ph. Eur (B6D2F1) and Swiss Webster (SW). The methodology for assessing the potency of rhEPO was standardized for the SW strain and the biological potency results conducted with both strains by INCQS were compared with those conducted by a producing laboratory. All tests were considered valid, satisfactory and met the criteria for regression, linearity and parallelism. The results remained within the limits setted by Ph. Eur. In all groups of data evaluated by the KS test, p> 0.05, no statistical evidence existed to prove that the distribution is not normal. There was no need for combination of tests to obtain satisfactory results in both strains tested. The potency assay using the SW strain is standardized under control and can be employed in assessing the biological potency of rhEPO. For the all variables, i.e. intra-and inter-assay and accuracy, with both strains tested, the values obtained were excellent, especially considering an in vivo assay. The strains, SW and B6D2F1, generated statistically homogeneous and similar results, and therefore can be considered concordant. The assay proved to be reproducible by the practical approach adopted, however, further studies with different laboratories using the SW strain, should be performed.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-01Bitstream added on 2014-06-13T21:03:44Z : No. of bitstreams: 1 prando_ec_dr_botib.pdf: 1650912 bytes, checksum: 61a3213e2810a3629780bb8a28aa87c8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Atualmente, o silenciamento de genes supressores de tumor por mecanismos epigenéticos é reconhecido como uma característica importante das células tumorais. Estudos recentes mostraram que as alterações da metilação do DNA não estão restritas a genes discretos, mas podem afetar ilhas CpG consecutivas em algumas regiões genômicas, levando à hipótese de que mecanismos epigenéticos coordenados poderiam silenciar simultaneamente a expressão de vários genes. A perda da expressão da isoforma A do gene RASSF1, localizado em 3p21.3 (uma região cromossômica frequentemente deletada no câncer), constitui um dos principais exemplos de genes que são inativados tanto por mecanismos genéticos quanto epigenéticos no câncer, incluindo os carcinomas mamários. Este estudo teve como finalidade investigar a ocorrência de alterações epigenéticas em um agrupamento gênico em 3p21.3 contendo vários genes candidatos a supressores tumorais. Foram selecionados 10 genes contíguos (SEMA3B, HYAL3, HYAL1, HYAL2 TUSC2, RASSF1, ZMYND10, NPRL2, TMEM115 e CACNA2D2) e um painel de 17 linhagens celulares derivadas de carcinomas mamários (BT-20, BT-474, BT-483, BT-549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-134 IV, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-415, MDA-MB-436, MDAMB- 453, MDA-MB-468, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1 e ZR-75-30), uma linhagem epitelial derivada de doença fibrocística benigna da mama (MCF10A) e duas linhagens derivadas de epitélio mamário normal (184A1 e 184B5). Inicialmente, os níveis de expressão foram quantificados por qRT-PCR (quantitative real time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) após o tratamento das linhagens com as drogas 5-aza-2’-desoxicitidina (5AzadC), um agente desmetilante, e tricostatina A (TSA), um inibidor das desacetilases de histonas em... / Currently, the silencing of tumor suppressor genes by epigenetic mechanisms is recognized as an important feature of tumor cells. Recent studies have showed that aberrant DNA methylation patterns are not restricted to discrete genes, but also could affect consecutive CpG islands in some genomic regions, which suggested that epigenetically coordinated mechanisms could lead to the simultaneous silencing of cancer-related genes. The loss of expression of the isoform A of the RASSF1 gene, mapped at 3p21.3 (a chromosomal region frequently deleted in cancer), is listed among those genes inactivated by both, genetic and epigenetic mechanisms in human cancer, including breast carcinomas. The purpose of this study was to investigate the occurrence of epigenetic alterations in a gene cluster at 3p21.3 which contains several candidates to tumor suppressor genes. It was selected 10 contiguous genes (SEMA3B, HYAL3, HYAL1, HYAL2 TUSC2, RASSF1, ZMYND10A, NPRL2, TMEM115 and CACNA2D2) and a panel of 17 breast cancer cell lines (BT-20, BT-474, BT- 483, BT-549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-134 IV, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-415, MDA-MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1 and ZR-75-30), one cell line derived from benign fibrocystic disease of the breast (MCF10A) and two cell lines derived from normal mammary epithelium (184A1 and 184B5). Initially, the expression levels were quantified by qRT-PCR (quantitative real time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) after the treatments of the cell lines with the 5-aza-2'-deoxycytidine (5Azadc), a DNA demethylating agent and trichostatin A (TSA) a histone deacetylase inhibitor, relative to the untreated controls. The results obtained showed that RASSF1 transcripts were detected in all cell lines; however, the expression of RASSF1A isoform was detected only in the Hs578T and... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Cláudia Aparecida Rainho / Banca: Fábio Tebaldi Silveira Nogueira / Banca: Ana Elizabete Silva / Banca: Spencer Luiz Marques Payão / Banca: Patrícia Pintor dos Reis / Resumo: Atualmente, o silenciamento de genes supressores de tumor por mecanismos epigenéticos é reconhecido como uma característica importante das células tumorais. Estudos recentes mostraram que as alterações da metilação do DNA não estão restritas a genes discretos, mas podem afetar ilhas CpG consecutivas em algumas regiões genômicas, levando à hipótese de que mecanismos epigenéticos coordenados poderiam silenciar simultaneamente a expressão de vários genes. A perda da expressão da isoforma A do gene RASSF1, localizado em 3p21.3 (uma região cromossômica frequentemente deletada no câncer), constitui um dos principais exemplos de genes que são inativados tanto por mecanismos genéticos quanto epigenéticos no câncer, incluindo os carcinomas mamários. Este estudo teve como finalidade investigar a ocorrência de alterações epigenéticas em um agrupamento gênico em 3p21.3 contendo vários genes candidatos a supressores tumorais. Foram selecionados 10 genes contíguos (SEMA3B, HYAL3, HYAL1, HYAL2 TUSC2, RASSF1, ZMYND10, NPRL2, TMEM115 e CACNA2D2) e um painel de 17 linhagens celulares derivadas de carcinomas mamários (BT-20, BT-474, BT-483, BT-549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-134 IV, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-415, MDA-MB-436, MDAMB- 453, MDA-MB-468, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1 e ZR-75-30), uma linhagem epitelial derivada de doença fibrocística benigna da mama (MCF10A) e duas linhagens derivadas de epitélio mamário normal (184A1 e 184B5). Inicialmente, os níveis de expressão foram quantificados por qRT-PCR (quantitative real time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) após o tratamento das linhagens com as drogas 5-aza-2'-desoxicitidina (5AzadC), um agente desmetilante, e tricostatina A (TSA), um inibidor das desacetilases de histonas em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Currently, the silencing of tumor suppressor genes by epigenetic mechanisms is recognized as an important feature of tumor cells. Recent studies have showed that aberrant DNA methylation patterns are not restricted to discrete genes, but also could affect consecutive CpG islands in some genomic regions, which suggested that epigenetically coordinated mechanisms could lead to the simultaneous silencing of cancer-related genes. The loss of expression of the isoform A of the RASSF1 gene, mapped at 3p21.3 (a chromosomal region frequently deleted in cancer), is listed among those genes inactivated by both, genetic and epigenetic mechanisms in human cancer, including breast carcinomas. The purpose of this study was to investigate the occurrence of epigenetic alterations in a gene cluster at 3p21.3 which contains several candidates to tumor suppressor genes. It was selected 10 contiguous genes (SEMA3B, HYAL3, HYAL1, HYAL2 TUSC2, RASSF1, ZMYND10A, NPRL2, TMEM115 and CACNA2D2) and a panel of 17 breast cancer cell lines (BT-20, BT-474, BT- 483, BT-549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-134 IV, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-415, MDA-MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1 and ZR-75-30), one cell line derived from benign fibrocystic disease of the breast (MCF10A) and two cell lines derived from normal mammary epithelium (184A1 and 184B5). Initially, the expression levels were quantified by qRT-PCR (quantitative real time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) after the treatments of the cell lines with the 5-aza-2'-deoxycytidine (5Azadc), a DNA demethylating agent and trichostatin A (TSA) a histone deacetylase inhibitor, relative to the untreated controls. The results obtained showed that RASSF1 transcripts were detected in all cell lines; however, the expression of RASSF1A isoform was detected only in the Hs578T and... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Vera Nisaka Solferini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:12:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yotoko_KarlaSuemyClemente_D.pdf: 2841719 bytes, checksum: 0d737c55afe08da16be5abc2a6e50ebd (MD5) Previous issue date: 2003 / Doutorado

Submitted by Tatiana Oliveira (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-05-20T23:46:19Z No. of bitstreams: 1 alexandre_s_freire_ioc_ebs_0019_2009.pdf: 1308505 bytes, checksum: c7f7d30c3e4948ed48a24eab9058e569 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-20T23:46:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alexandre_s_freire_ioc_ebs_0019_2009.pdf: 1308505 bytes, checksum: c7f7d30c3e4948ed48a24eab9058e569 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz . Rio de Janeiro,RJ, Brasil / A produção do conhecimento dá-se de forma mais veloz do que as mudanças educacionais podem acompanhar. Em Biologia, muitas novas teorias são rapidamente traduzidas em produtos que são, por sua vez, absorvidos pela sociedade. É necessário discutir os novos conceitos juntamente com as idéias clássicas no Ensino Médio. Esse trabalho tem como objetivo discutir a Genética Clássica e moderna a partir da avaliação: i) do espaço dedicado [aos esses] assuntos nos livros didáticos; ii) da análise dos posicionamentos dos estudantes acerca dos novos conceitos da “Nova Biologia”; iii) do desenvolvimento e da discussão do uso do “Jogo do Genoma” entre estudantes de Ensino Médio. Para responder a esses questionamentos, os resultados estão divididos em três capítulos, além do Anexo I (Xavier et al., 2006). O artigo no Anexo I avaliou o conteúdo dos livros didáticos. Um total de 12 livros foi analisado quanti e qualitativamente. Os resultados deste artigo sugerem que apenas alguns livros apresentam termos associados à “Nova Biologia”, além de haver de muito espaço dedicado a termos clássicos da Genética.O capítulo 5.1 demonstrou as visões dos estudantes em relação aos conceitos da “Nova Biologia”. Questionários e entrevistas semi-estruturadas foram aplicados em colégios privados e públicos de duas cidades do estado do Rio de Janeiro. Os resultados sugerem que os estudantes sabem sobre os conceitos relacionados à “Nova Biologia”, especialmente aqueles que estão sendo discutidos já mais tempo e mais amplamente pela mídia. O capítulo 5.2 fala sobre a elaboração do “Jogo do Genoma”. O capítulo 5.3 discute o uso do jogo em turmas do terceiro ano de escolas de Ensino Médio do município de Petrópolis, no estado do Rio. Os estudantes jogaram o jogo e responderam perguntas para que as impressões sobre o jogo pudessem ser obtidas. Os resultados sugerem que o Jogo do Genoma pode ser utilizado em aulas de Genética para motivar os alunos a participar mais ativamente no seu próprio aprendizado. Neste trabalho, foi observado que os livros didáticos não abrangem o conteúdo mínimo relativo aos avanços biotecnológicos, e os estudantes não são fluentes na maioria dos temas da “Nova Biologia”. Por outro lado, o “Jogo do Genoma” parece motivar os alunos de forma que atuem como uma ferramenta auxiliar e eficiente para o ensino de Genética e que também poderá ser usado no ensino de Biologia. / The production of knowledge takes place more quickly than changes in education can follow. In biology, many new theories are quickly translated into products that are in turn absorbed by society. It is necessary to discuss the new concepts together with the classical ideas in high school. This paper aims to discuss the classical and modern genetics from the evaluation: i) the space dedicated to [these] issues in textbooks, ii) the analysis of placements of students about new concepts of "New Biology", iii) development and discussion of the use of "Game of the Genome" among high school students. To answer these questions, the results are divided into three chapters, in addition to Annex I (Xavier et al., 2006). Article in Annex I assessed the content of textbooks. A total of 12 books was analyzed quantitative and qualitatively. The results of this paper suggest that only a few books have terms associated with "New Biology", besides having a lot of space devoted to the classical terms Genética.O Section 5.1 demonstrated the views of students about the concepts of "New Biology". Questionnaires and semi-structured interviews were applied to public and private schools in two cities in the state of Rio de Janeiro. The results suggest that students know about the concepts related to the "New Biology", especially those that are being discussed now longer and more widely by the media. Chapter 5.2 discusses the development of the "Game of the Genome." Chapter 5.3 discusses the use of the game in the third year classes of high schools in the city of Petrópolis, State of Rio Students played the game and answered questions for the impressions of the game could be obtained. The results suggest that the Genome Game can be used in genetics classes to motivate students to participate more actively in their own learning. In this study, we observed that textbooks do not cover the minimum content on the advances in biotechnology, and students are not proficient in most of the themes of "New Biology". On the other hand, the "Game of the Genome" seems to motivate students so that they act as an auxiliary tool and efficient for teaching genetics and can also be used in teaching biology.

Made available in DSpace on 2015-06-01T19:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 501.pdf: 2806630 bytes, checksum: 5dbcbb44377fbc1620ff4879d96a08d9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / A vacina da febre amarela 17D (YFV-17D) é bastante segura e uma dose única confere imunidade potente e duradoura. Por essas e outras características, diferentes tecnologias têm sido propostas para a utilização da cepa 17D como vetor vacinal. Estratégias promissoras para o desenvolvimento de novas vacinas têm se baseado na construção de quimeras YFV-17D com inserção de seqüências heterólogas e produção em larga escala de replicons empacotados em partículas pseudo-infecciosas (PPIs), no entanto, ainda não existe um consenso da melhor estratégia a ser utilizada para esses fins. O presente estudo teve por objetivo avaliar diferentes estratégias de construção para a utilização do YFV-17D como vetor vacinal. Para isso foram construídos duas quimeras do YFV-17D com inserção de um gene repórter YFP (Yellow Fluorescent Protein) na junção E/NS1 e dois replicons subgenômicos do YFV-17D expressando o gene repórter luciferase. Para a produção de PPIs foi desenvolvida a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt. O YFV-YFPSSE revelou instabilidade genética com perda do gene YFP e correlação negativa entre expressão de proteínas virais e do gene repórter. O YFV-YFP-DENV1linker mostrou-se estável geneticamente com expressão eficiente de YFP e proteínas virais, e mostrou-se ser o mais adequado para ser utilizado como vetor viral. Os replicons do YFV-17D mostraram-se funcionais e capazes de expressar eficientemente o gene heterólogo. E, embora a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt tenha expressado as proteínas estruturais prM e E eficientemente, poucas partículas pseudo-infecciosas foram produzidas. Diante do exposto, as diferentes estratégias de manipulação genética do YFV avaliadas neste trabalho constituem ferramentas viáveis e aplicáveis ao processo de desenvolvimento de vacinas, havendo, porém, necessidade de otimização dessas estratégias para assegurar maiores segurança e eficácia

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-05T18:08:18Z No. of bitstreams: 1 2008betuliademoraissouto.pdf: 2890430 bytes, checksum: 567ba1f351800aa293b7ae5a1a034f2b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-11-10T13:22:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008betuliademoraissouto.pdf: 2890430 bytes, checksum: 567ba1f351800aa293b7ae5a1a034f2b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-10T13:22:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008betuliademoraissouto.pdf: 2890430 bytes, checksum: 567ba1f351800aa293b7ae5a1a034f2b (MD5) Previous issue date: 2008-03 / Sedas são compostos protéicos secretadas por glândulas especializadas encontradas em diferentes grupos de artrópodes. Aranhas produzem uma diversidade de fibras, que são predominantemente compostas por proteínas repetitivas (espidroínas), codificadas por uma família multigênica. A caracterização dessa família está focada em espidroínas sintetizadas por espécies de Araneomorphae (aranhas verdadeiras), enquanto poucas seqüências de Mygalomorphae (tarântulas) são conhecidas. Sedas formam uma família diversa de materiais naturais com extraordinárias propriedades mecânicas, como resistência e extensibilidade, além da biocompatibilidade demonstrada. A possibilidade de produzir novos biomateriais com propriedades similares às das espidroínas levou à inúmeros estudos dessas proteínas. Apesar das potenciais características mecânicas, a inabilidade de domesticar as aranhas para produzir quantidades suficientes de proteínas conduziu ao desenvolvimento de estratégias alternativas para a produção das sedas utilizando a tecnologia do DNA recombinante. Proteínas com resistência e elasticidade definidas podem ser produzidas utilizando engenharia genética de maneira a misturar os módulos repetitivos em proporções específicas, produzindo biomateriais com grande potencial para uso na medicina e engenharia. Este trabalho envolve a expressão recombinante de seda de aranhas em Escherichia coli, por meio da manipulação genética de genes isolados das glândulas produtoras de seda das espécies Nephilengys cruentata (Araneomorphae) e Avicularia juruensis (Mygalomorphae). A proteína AJSilk Gland Protein – 1 de A. juruensis identificada neste trabalho pode ajudar no melhor entendimento da diversidade e evolução da família de genes das espidroínas. Além disso, genes sintéticos foram construídos para codificar um análogo à Flag-like de N. cruentata. Esses genes artificiais foram obtidos por meio de uma estratégia controlada, usada para proteínas repetitivas compostas por diferentes unidades repetitivas in tandem. Resultados de análises por SDS-PAGE e “Western blot” e a purificação (em coluna de afinidade) demonstraram que as proteínas Flag recombinantes foram expressas com sucesso em microorganismos. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Silks are protein compounds secreted by specialized glands, and are found in different groups of arthropods. Spiders can produce a number of silk fibers (spidroins) that are predominately composed of repetitive amino acid modules encoded by a multigenic family. The characterization of this multigenic family has focused on spidroins synthesized by Araneomorphae species (true spiders), whereas only a few sequences are known from the Mygalomorphae species (tarantulas). Silks represent a diverse family of natural materials with extraordinary mechanical properties such as high tensile strength and extensibility, as well as a great biocompatibility. The possibility of producing new biomaterials properties similar to spidroins motivated this research. Despite their superior mechanical characteristics, the inability of domesticating spiders to produce enough protein for industrial applications had lead to alternative strategies for silk production, mainly through the recombinant DNA technology. By using genetic engineering aproaches to mix the conserved and repetitive modules in specific proportions, proteins with defined strength and elasticity can be designed, and they may have many potential medical and engineering uses. This work involves the recombinant expression of spider silk proteins in Escherichia coli through the manipulation of silk genes isolated from glands of the Brazilian species Nephilengys cruentata (Araneomorphae) and Avicularia juruensis (Mygalomorphae). The protein AJSilk Gland Protein – 1 from A. juruensis was identified in this work and could enlighten some diversity and evolution issues of the spidroin multigenic family. In addition, synthetic genes were designed to encode analogs of the N. cruentata Flag-like gene. These artificial genes were constructed by using a controlled strategy to generate repetitive proteins composed of tandem different repeat units. The results of SDS-PAGE, Western blot analysis and the purification (using a affinity column) of the spider flagelliform recombinant proteins demonstrated that the strategy was successfully conducted to produce these spider proteins in microorganisms.

Orientador: Cristina Bruzzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Educação / O exemplar da FE pertence a Coleção do Centro de Documentação em Ensino de Ciências (CEDOC). / Made available in DSpace on 2018-08-03T14:38:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_DeisiSangoi_D.pdf: 7428314 bytes, checksum: 873ede23d80b479eeb8220811d570d59 (MD5) Previous issue date: 2002 / Doutorado

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:15:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_WilliamJamesNogueira_D.pdf: 7186235 bytes, checksum: ddd703d245f4f54c40b8d88fbf10674a (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Neste trabalho foi possível estudar o cultivo em altas densidades celulares de E. coli recombinante em bioreatores identificando importantes parâmetros cinéticos para as fases de crescimento celular e indução da proteína recombinante. Foram estudadas diversas estratégias de cultivo para obtenção de elevadas densidades celulares, no intuito de desenvolver' uma tecnologia de fermentação robusta que permitisse: Elevados níveis de biomassa em peso seco de células por litro; determinar as condições nutricionais que permitem expressão da proteína de fusão da ordem de 20% ou mais em fermentações com alta concentração de biomassa e determinar a melhor estratégia de fermentação para atingir elevadas concentrações celulares, entre as quais, batelada-alimentada com cortes, batelada-alimentada cíclica em dois estágios e fermentações com reciclo e microfiltração. A cepa utilizada neste estudo foi a E. coli N-4830-1 transformada com o plasmídeo pHis. As fermentações foram realizadas em bioreatores de bancada de capacidade útil de 4,0 L e 12,0 L (NBS e Inceltech). Foram medidas as concentrações de biomassa, glicose, acetato e proteína recombinante. Os estudos cinéticos das diferentes estratégias mostraram incrementos em biomassa e em proteína de fusão, sendo que o melhor resultado foi obtido para fermentações com reciclo total de células, microfiltração do meio e alimentação exponencial de nutrientes, as quais obtiveram produtividade celular igual a PR = 6,437 g/L/h. A concentração final em peso seco de células foi 173,8 g/L, com porcentagem de expressão da proteína de fusão em 17,8%. Os incrementos obtidos em biomassa e em proteína de fusão, em relação à batelada-alimentada tradicional, foram respectivamente 341 % e 328 %. A técnica mostrou-se adequada para remoção de inibidores no meio de cultura permitindo maior produtividade e, conseqüentemente, maior crescimento celular, sendo até 3,5 vezes superiores aos cultivos em batelada-alimentada tradicional / Abstract: This thesis studied submerged high cell-density cultures (HCDC) of recombinant Escherichia coli identifying important kinetic parameters on growth and production phases. Several strategies to obtain HCDC were studied aiming to develop a robust fermentation process that allowed: High cell dry weight per liter; to determine the nutritional conditions to express the fusion protein in levels up to 20% of total protein, and to determine the best fermentation technique to reach dry biomass concentration higher that 100,0 g/L. The strain used in this work was E. colí N-4830-1 transformed with the plasmid pHis. The fermentations were ran out in 4.0 L and 12.0 L bench-top bioreactors (NBS e Inceltech). Total protein concentration, recombinant protein concentration, cell concentration, glucose concentration and acetate concentration were analyzed. The kinetics studies demonstrated that biomass and fusion protein were increased, however the best results were performed on a continuous fermentation with microfiltration, total cell recycle and exponencial feeding. The cell productivity was PR = 6,437 glUh, the final cell dry weight was 173,8 g/L and the percentage of fusion protein was 17,8 % of total protein. The biomass and fusion protein increase obtained were, respectively, 341 % and 328 %, comparing with traditional fed-batch fermentation. This technique showed appropriated to remove inhibitors of the broth allowing higher cell concentration and, consequently, higher productivity. In this type of culture strategy, the final cell concentration was 3.5 fold than one obtained in traditional fed-batch / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química