From the simplest single-cellular organism to the most complex multicellular life forms, genetic information in form of DNA represents the universal basis for all biological processes and thus for life itself. Maintaining the structural and functional integrity of the genome is therefore of paramount importance for every single cell. DNA itself, as an active and complex macromolecular structure, is both substrate and product of many of these biochemical processes. A cornerstone of DNA maintenance is thus established by the tight regulation of the multitude of reactions in DNA metabolism, repressing adverse side reactions and ensuring the integrity of DNA in sequence and function. The family of RecQ helicases has emerged as a vital class of enzymes that facilitate genomic integrity by operating in a versatile spectrum of nucleic acid metabolism processes, such as DNA replication, repair, recombination, transcription and telomere stability. RecQ helicases are ubiquitously expressed and conserved in all kingdoms of life. Human cells express five different RecQ enzymes, RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 and RecQ5, which all exhibit individual as well as overlapping functions in the maintenance of genomic integrity. Dysfunction of three human RecQ helicases, BLM, WRN and RecQ4, causes different heritable cancer susceptibility syndromes, supporting the theory that genomic instability is a molecular driving force for cancer development. However, based on their inherent DNA protective nature, RecQ helicases represent a double-edged sword in the maintenance of genomic integrity. While their activity in normal cells is essential to prevent cancerogenesis and cellular aging, cancer cells may exploit this DNA protective function by the overexpression of many RecQ helicases, aiding to overcome the disadvantageous results of unchecked DNA replication and simultaneously gaining resistance against chemotherapeutic drugs. Therefore, detailed knowledge how RecQ helicases warrant genomic integrity is required to understand their implication in cancerogenesis and aging, thus setting the stage to develop new strategies towards the treatment of cancer. The current study presents and discusses the first high-resolution X-ray structure of the human RecQ4 helicase. The structure encompasses the conserved RecQ4 helicase core, including a large fraction of its unique C- terminus. Our structural analysis of the RecQ4 model highlights distinctive differences and unexpected similarities to other, structurally conserved, RecQ helicases and permits to draw conclusions about the functional implications of the unique domains within the RecQ4 C-terminus. The biochemical characterization of various RecQ4 variants provides functional insights into the RecQ4 helicase mechanism, suggesting that RecQ4 might utilize an alternative DNA strand separation technique, compared to other human RecQ family members. Finally, the RecQ4 model permits for the first time the analysis of multiple documented RecQ4 patient mutations at the atomic level and thus provides the possibility for an advanced interpretation of particular structure-function relationships in RecQ4 pathogenesis. / Vom simpelsten einzelligen Organismus bis hin zu hoch komplexen Lebensformen, genetische Information in Form von DNA repräsentiert die universelle Grundlage aller biologischer Prozesse, und damit die des Lebens selbst. Die Aufrechterhaltung der intakten Struktur und Funktion des Genoms ist daher von höchster Priorität für jede einzelne Zelle. Die DNA selbst, als aktives und komplexes Makromolekül, ist sowohl Substrat als auch Produkt einer Vielzahl dieser biochemischen Prozesse. Ein wesentlicher Aspekt für die Aufrechterhaltung genomischer Integrität besteht daher in der gezielten Regulation aller Prozesse des DNA Metabolismus, um die Konservierung der DNA in Sequenz und Funktion zu gewährleisten und unerwünschte Nebenreaktionen zu verhindern. Die Familie der RecQ Helikasen hat sich als eine essentielle Gruppe von Enzymen etabliert, die diese genomische Integrität gewährleisten, indem sie eine Vielzahl von DNA basierten Prozessen kontrollieren. Dies umfasst die Replikation, Reparatur, Rekombination und Transkription von DNA, sowie Prozesse, die der Stabilisierung der Telomere dienen. RecQ Helikasen werden von allen Zellen exprimiert und können in allen Domänen des Lebens – Bakterien, Archaeen und Eukaryoten nachgewiesen werden. Humane Zellen enthalten fünf verschiedene RecQ Helikasen, RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 und RecQ5, welche sowohl individuelle als auch überlappende Funktionen in der Aufrechterhaltung genomischer Integrität innehaben. Eine Beeinträchtigung der Funktion der humanen RecQ Helikasen BLM, WRN und RecQ4 führt zu Krankheiten die durch eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für die Entstehung von Krebs gekennzeichnet sind. Dies unterstützt die Theorie, dass die genomische Instabilität eine molekulare Grundlage für die Entstehung von Krebs darstellt. Allerdings repräsentiert die den RecQ Helikasen innewohnende Funktion der Aufrechterhaltung genomischer Integrität ein zweischneidiges Schwert. Während ihre Aktivitäten auf der einen Seite für normale Zellen essentiell sind, um Krankheiten und zelluläre Alterungserscheinungen zu verhindern, wird ihre DNA protektive Funktion von Krebszellen genutzt, indem sie verschiedenste RecQ Helikasen überexprimieren und damit den nachteiligen Effekten der unkontrollierten DNA Replikation entgegenwirken. Zudem erlangen Tumorzellen durch die erhöhte Präsenz der RecQ Helikasen Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Chemotherapeutika. Es ist daher von größter Bedeutung zu verstehen, wie genau die einzelnen RecQ Helikasen in der Entstehung von Krebs und dem Alterungsprozess involviert sind, um neue Ansätze in der Krebstherapie zu entwickeln. Die vorliegende Arbeit präsentiert und diskutiert die erste detaillierte Röntgen-Kristallographische Struktur der humanen RecQ4 Helikase. Die vorgestellte Struktur umfasst den konservierten Kern der RecQ4 Helikase, einschließlich eines großen Teils ihres einzigartigen C-terminus. Eine Analyse des RecQ4 Modells weist sowohl eindeutige Unterschiede als auch unerwartete Gemeinsamkeiten im Vergleich mit anderen, untereinander strukturell und funktional ähnlichen, humanen RecQ Helikasen auf und erlaubt zudem Rückschlüsse auf die Funktion der einzigartigen C-terminalen RecQ4 Domäne. Die biochemische Charakterisierung verschiedener RecQ4 Varianten liefert funktionelle Einblicke in den Mechanismus der DNA Doppelstrangtrennung durch RecQ4 und deutet darauf hin, dass sich dieser in weiten Teilen vom Mechanismus der anderen humanen RecQ Helikasen unterscheidet. Letztlich repräsentiert das hier vorgestellte Modell der RecQ4 Helikase die Grundlage für die Analyse verschiedenster dokumentierter RecQ4 Patientenmutationen und erlaubt damit eine erste Abschätzung von Struktur-und-Funktions-Beziehungen bezüglich der bekannten RecQ4- assoziierten Krankheitsbilder.

Several important cellular processes, including transcription, nucleotide excision repair and cell cycle control are mediated by the multifaceted interplay of subunits within the general transcription factor II H (TFIIH). A better understanding of the molecular structure of TFIIH is the key to unravel the mechanism of action of this versatile protein complex within these pathways. This becomes especially important in the context of severe diseases like xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy, that arise from single point mutations in some of the TFIIH subunits. In an attempt to structurally characterize the TFIIH complex, we harnessed the qualities of the eukaryotic thermophile Chaetomium thermophilum, a remarkable fungus, which has only recently been recognized as a novel model organism. Homologues of TFIIH from C. thermophilum were expressed in E. coli, purified to homogeneity and subsequently utilized for crystallization trials and biochemical studies. The results of the present work include the first crystal structure of the p34 subunit of TFIIH, comprising the N-terminal domain of the protein. The structure revealed a von Willebrand Factor A (vWA) like fold, which is generally known to be involved in a multitude of protein-protein interactions. Structural comparison allowed to delineate similarities as well as differences to already known vWA domains, providing insight into the role of p34 within TFIIH. These results indicate that p34 assumes the role of a structural scaffold for other TFIIH subunits via its vWA domain, while likely serving additional functions, which are mediated through its C-terminal zinc binding domain and are so far unknown. Within TFIIH p34 interacts strongly with the p44 subunit, a positive regulator of the XPD helicase, which is required for regulation of RNA Polymerase II mediated transcription and essential for eukaryotic nucleotide excision repair. Based on the p34 vWA structure putative protein-protein interfaces were analyzed and binding sites for the p34 p44 interaction suggested. Continuous crystallization efforts then led to the first structure of a p34 p44 minimal complex, comprising the N-terminal vWA domain of p34 and the C-terminal C4C4 RING domain of p44. The structure of the p34 p44 minimal complex verified the previous hypothesis regarding the involved binding sites. In addition, careful analysis of the complex interface allowed to identify critical residues, which were subsequently mutated and analyzed with respect to their significance in mediating the p34 p44 interaction, by analytical size exclusion chromatography, electrophoretic mobility shift assays and isothermal titration calorimetry. The structure of the p34 p44 complex also revealed a binding mode of the p44 C4C4 RING domain, which differed from that of other known RING domains in several aspects, supporting the hypothesis that p44 contains a novel variation of this domain. / Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Transkription, die Nukleotid-Exzisionsreparatur und die Kontrolle des Zellzyklus sind abhängig vom vielschichtigen Zusammenspiel der zehn Protein-Untereinheiten des allgemeinen Transkriptionsfaktors II H (TFIIH). Zur Aufklärung der genauen Funktion dieses Komplexes ist ein besseres Verständnis seiner molekularen Struktur essentiell. Besondere Bedeutung erhält der TFIIH dabei im Hinblick auf verschiedene schwerwiegende Krankheiten, wie z.B. Xeroderma pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und Trichothiodystrophie (TTD), die als Folge von einzelnen Punkt-Mutationen in bestimmten Untereinheiten des Komplexes entstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden zur strukturellen Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 die homologen Proteine aus Chaetomium thermophilum verwendet. Hierbei handelt es sich um einen eukaryotischen und thermophilen Pilz, der erst kürzlich als neuer und vielversprechender Modellorganismus an Bedeutung gewann. Die TFIIH Homologe aus C. thermophilum wurden rekombinant exprimiert, gereinigt und anschließend für Kristallisations-Versuche eingesetzt. Darüber hinaus wurden die Proteine mittels verschiedener biochemischer Verfahren analysiert. Die erzielten Resultate beinhalten unter anderem die erste Kristall-Struktur der p34 Untereinheit des TFIIH und zeigen eine von Willebrand Faktor A (vWA) ähnliche Domäne im N-terminalen Bereich des Proteins. Vergleiche mit bereits bekannten vWA Proteinen liefern Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede und erlauben erste Einblicke in die Funktion der p34 Untereinheit innerhalb des TFIIH Komplexes. Die gewonnenen Erkenntnisse legen nahe, dass p34 über seine vWA Domäne anderen TFIIH Untereinheiten als strukturelles Gerüst dient, während die C-terminale Zinkfinger-Domäne des Proteins sehr wahrscheinlich zusätzliche Aufgaben übernimmt, die bisher noch nicht genau bekannt sind. Innerhalb des TFIIH Komplexes ist p34 eng mit der p44 Untereinheit assoziiert. Letztere ist als positiver Regulator der XPD Helikase bekannt, die im Rahmen der RNA Polymerase II vermittelten Transkription und der eukaryotischen Nukleotid-Exzisionsreparatur eine entscheidende Rolle spielt. Basierend auf der erzielten p34ct vWA Struktur wurden verschiedene Interaktions-Flächen zwischen p34 und p44 analysiert und mögliche Bindestellen für die beiden Proteine ermittelt. Weitere Kristallisations-Experimente ermöglichten schließlich die Aufklärung der Struktur eines p34 p44 Minimal-Komplexes, bestehend aus der N-terminalen vWA Domäne von p34 und der C-terminalen C4C4 RING Domäne von p44. Die gewonnenen Struktur-Daten bestätigten die zuvor ermittelte Bindestelle der beiden Proteine. Eine genauere Untersuchung der Kontakt-Fläche zwischen p34 und p44 lieferte darüber hinaus entscheidende Hinweise auf besonders wichtige Interaktions-Bereiche und Aminosäuren, die im Folgenden mutiert wurden, um deren Bedeutung für die Komplexbildung zu ermitteln. Mit Hilfe der analytischen Größenausschluss-Chromatographie, elektro-phoretischer Mobilitäts-Verlagerungs-Assays und isothermaler Titrations-Kalorimetrie konnten hierbei verschiedene Aminosäuren identifiziert werden, die für eine stabile p34 p44 Interaktion erforderlich sind. Ferner zeigte die Struktur des p34 p44 Minimal-Komplexes eine Bindungsweise der p44 C4C4 RING Domäne, die sich von der anderer, bereits bekannter RING Domänen in verschiedenen Punkten unterschied. Diese Erkenntnis bestätigt die zuvor aufgestellte Hypothese, dass es sich im Falle von p44 um eine neue Variante der bereits gut charakterisierten RING Domäne handelt.

Fanconi Anämie (FA) gehört zu den seltenen Chromsomeninstabilitäts-Syndromen. Ursächlich für die Erkrankung sind biallelische Mutationen mit autosomal rezessiver Vererbung in einem der bisher bekannten 21 Genen (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U und –V). Eine Ausnahme stellen FANCB und FANCS dar, die X-chromosomal rezessiv bzw. mit einem dominant negativen Effekt vererbt werden. Die Genprodukte sind als Teil des FA/BRCA-DNA-Reparatur Netzwerks bei der Beseitigung von DNA-Interstrang-Quervernetzungen (ICL) involviert. ICLs führen zu einer Stagnation der Replikationsgabel und blockieren somit wichtige zelluläre Prozesse wie Replikation und Transkription, sodass eine Aufrechterhaltung der Genomstabilität nicht mehr gewährleistet ist. FA ist gekennzeichnet durch angeborene Fehlbildungen, fortschreitendes Knochenmarkversagen und eine erhöhte Prädisposition gegenüber Krebserkrankungen. Die Diagnose basiert auf phänotypischen Auffälligkeiten und wird auf zellulärer Ebene durch die Hypersensititvät gegenüber DNA-quervernetzenden Substanzen wie Mitomycin C (MMC) bestätigt. Da nicht jeder Patient einer bisher bekannten Komplementationsgruppe zugeordnet werden kann und herkömmliche molekulare Diagnostikverfahren mit der steigenden Anzahl an FA-Genen mühsam, zeitaufwändig und teuer geworden sind, war es nötig, neue molekulare Verfahren wie Whole Exome Sequencing (WES) zu etablieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential dieser Methode im Bezug auf die FA-Genotypisierung erforscht. Bei der Suche nach einer optimalen Anwendung des WES, untersuchten wir verschiedene Anreicherungs- und Sequenziertechniken. Dennoch führen Fehler in den Datenbanken sowie Pseudogene zu falschen Dateninterpretationen und –darstellungen und stellen somit eine Herausforderung dar. Trotzdem zeigen unserer Daten, dass WES eine wertvolle Methode in der Molekulardiagnostik von FA ist. Dies bestätigte sich durch die Zuordnung mehrerer, vorher unklassifizierter FA-Patienten zu den bekannten Komplementationsgruppen und der Ergänzung eines siebten Patienten zum Subtyp FA-P, im Rahmen von zwei Next Generation Sequencing (NGS) Publikationen. Außerdem wurden mit Hilfe von WES zwei neue FA-Gene (FANCQ und FANCW) im Rahmen dieser Arbeit gefunden, wobei XPF (FANCQ) das erste Gen überhaupt war, welches anhand von NGS detektiert wurde. ERCC4/XPF ist eine strukturspezifische Endonuklease, die durch ein Gen kodiert wird, welches bereits vorher mit den Krankheiten Xeroderma Pigmentosum (XP) und dem segmentalen XFE progeroid Syndrom in Verbindung gebracht wurde. Unsere Daten zeigen, dass abhängig von der Mutation in XPF, Patienten eine der drei unterschiedlichen Funktionsstörungen aufweisen. Dies hebt die multifunktionale Stellung der XPF Endonuklease im Rahmen der Genomstabilität und von humanen Erkrankungen hervor. Das zweite Gen, das während dieser Arbeit entdeckt wurde, ist die WD40-Domäne tragende E3 Ubiquitin Ligase RFWD3, die kürzlich mit DNA Reparatur und insbesondere HR verknüpft wurde. Wir konnten zeigen, dass eine RFWD3 Mutation in der WD40-Domäne bei einem FA-Patienten mit der genetischen Erkrankung Fanconi Anämie assoziiert ist. Die HR ist in RFWD3 (FANCW) mutierten Zellen gestört, was auf einer verminderten Relokalisation von mutiertem RFWD3 an das Chromatin und einer defekten Interaktion mit RPA beruht. Des Weiteren weisen Rfwd3 defiziente Mäuse typische Merkmale anderer FA-Mausmodelle auf, wie verminderte Fertilität, ovarielle und testikuläre Atrophie sowie eine reduzierte Lebenserwartung. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass neue molekulare Ansätze wie NGS ein wertvolles Hilfsmittel in der FA-Diagnostik sind um bisher unklassifizierte Patienten einer Komplementationsgruppe zuordnen zu können. Zudem konnten mit Hilfe dieser Technik zwei neue Gene identifiziert werden. Deren Charakterisierung trägt zu einer Vervollständigung und weiteren Aufklärung des FA/BRCA-DNA-Reparatur-Netzwerks bei. / Fanconi anemia (FA) is a rare genomic instability syndrome. Biallelic mutations are disease causing in any one of at least 21 genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U and -V). All are inherited in an autosomal recessive way, except FANCB and FANCS, which are inherited in a X-chromosomal recessive and a dominant negative way, respectively. The gene products are involved in the FA/BRCA DNA damage response pathway to remove interstrand-crosslinks (ICL). ICLs cause stalled replication forks and hence block crucial cellular processes like replication and transcription resulting in decreased maintenance of genome stability. FA is characterized by congenital malformations, progressive bone marrow failure (BMF), and susceptibility to malignancies. Patients are diagnosed based upon phenotypical manifestations and the diagnosis of FA is confirmed by the hypersensitivity of cells to DNA interstrand crosslinking agents such as Mitomycin C (MMC). Since not every patient can be assigned to a complementation group and customary molecular diagnostics has become increasingly cumbersome, time-consuming and expensive the more FA genes have been identified new molecular approaches like Whole Exome Sequencing (WES) has been established. The potential of this method for FA genotyping has been investigated in the context of this thesis. By exploring different enrichment and sequencing techniques, we were able to identify the pathogenic mutations in each case using WES. However, database errors and pseudogenes pose challenges to interpret data correctly. Nevertheless our results show that WES is a valuable tool for molecular diagnosis of FA, since we were able to assign several previously unclassified FA patients to known complementation groups in the framework of two Next Generation Sequencing (NGS) studies. In addition WES revealed two new FA-genes, XPF and RFWD3. Extraordinarily, XPF (FANCQ) is the first gene to be detected with NGS. ERCC4/XPF is a structure specific nuclease - encoding a gene previously connected to xeroderma pigmentosum (XP) and segmental XFE progeroid syndrome. Depending on the type of ERCC4 mutation individuals present with one of the three clinically distinct disorders highlighting the multifunctional nature of the XPF endonuclease in genome stability and human disease. The second gene identified within this thesis is the WD40-containing E3 ubiquitin ligase RFWD3, which has been recently linked to the repair of DNA damage by Homologous Recombination (HR). Here, we show that an RFWD3 mutation within the WD40 domain of a patient with typical FA malformations is connected to the genetic disease Fanconi anemia (FA). Disordered HR is the result of depleted relocation of mutant RFWD3 to chromatin and defective physical interaction with RPA. In addition, Rfwd3 knockout mice show ovarian and testicular atrophy, a reduced life span and pups with sub-Mendelian birth ratios indicating embryonal-lethality. These features resemble other FA mouse models. In summary, this work showed that new molecular approaches like WES are valuable tools for FA diagnosis. Additionally, this method is a useful medium to assign FA patients to so far unknown complementation groups. Two novel genes have been identified and contribute to further completion of the FA/BRCA DNA repair network in the context of genome stability.

Die Fanconi-Anämie (FA) ist eine seltene, heterogene Erbkrankheit. Sie weist ein sehr variables klinisches Erscheinungsbild auf, das sich aus angeborenen Fehlbildungen, hämatologischen Funktionsstörungen, einem erhöhten Risiko für Tumorentwicklung und endokrinen Pathologien zusammensetzt. Die Erkrankung zählt zu den genomischen Instabilitätssyndromen, welche durch eine fehlerhafte DNA-Schadensreparatur gekennzeichnet sind. Bei der FA zeigt sich dies vor allem in einer charakteristischen Hypersensitivität gegenüber DNA-quervernetzenden Substanzen (z. B. Mitomycin C, Cisplatin). Der zelluläre FA-Phänotyp zeichnet sich durch eine erhöhte Chromosomenbrüchigkeit und einen Zellzyklusarrest in der G2-Phase aus. Diese Charakteristika sind bereits spontan vorhanden und werden durch Induktion mit DNA-quervernetzenden Substanzen verstärkt. Der Gendefekt ist dabei in einem der 22 bekannten FA-Gene (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U, -V, -W) oder in noch unbekannten FA-Genen zu finden. Die FA-Gendefekte werden mit Ausnahme von FANCR (dominant-negative de novo Mutationen) und FANCB (X-chromosomal) autosomal rezessiv vererbt. Die FA-Genprodukte bilden zusammen mit weiteren Proteinen den FA/BRCA-Signalweg. Das Schlüsselereignis dieses Signalwegs stellt die Monoubiquitinierung von FANCD2 und FANCI (ID2-Komplex) dar. Ausgehend davon lässt sich zwischen upstream- und downstream-gelegenen FA-Proteinen unterscheiden. Letztere sind direkt an der DNA-Schadensreparatur beteiligt. Zu den upstream-gelegenen Proteinen zählt der FA-Kernkomplex, der sich aus bekannten FA-Proteinen und aus FA-assoziierten-Proteinen (FAAPs) zusammensetzt und für die Monoubiquitinierung des ID2-Komplexes verantwortlich ist. Für FAAPs wurden bisher keine pathogenen humanen Mutationen beschrieben. Zu diesen Proteinen gehört auch FAAP100, das mit FANCB und FANCL innerhalb des FA-Kernkomplexes den Subkomplex LBP100 bildet. Durch die vorliegende Arbeit wurde eine nähere Charakterisierung dieses Proteins erreicht. In einer Amnion-Zelllinie konnte eine homozygote Missense-Mutation identifiziert werden. Der Fetus zeigte einen typischen FA-Phänotyp und auch seine Zellen wiesen charakteristische FA-Merkmale auf. Der zelluläre Phänotyp ließ sich durch FAAP100WT komplementieren, sodass die Pathogenität der Mutation bewiesen war. Unterstützend dazu wurden mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems weitere FAAP100-defiziente Zelllinien generiert. Diese zeigten ebenfalls einen typischen FA-Phänotyp, welcher sich durch FAAP100WT komplementieren ließ. Die in vitro-Modelle dienten als Grundlage dafür, die Funktion des FA-Kernkomplexes im Allgemeinen und die des Subkomplexes LBP100 im Besonderen besser zu verstehen. Dabei kann nur durch intaktes FAAP100 das LBP100-Modul gebildet und dieses an die DNA-Schadensstelle transportiert werden. Dort leistet FAAP100 einen essentiellen Beitrag für den FANCD2-Monoubiquitinierungsprozess und somit für die Aktivierung der FA-abhängigen DNA-Schadensreparatur. Um die Funktion von FAAP100 auch in vivo zu untersuchen, wurde ein Faap100-/--Mausmodell generiert, das einen mit anderen FA-Mausmodellen vergleichbaren, relativ schweren FA-Phänotyp aufwies. Aufgrund der Ergebnisse lässt sich FAAP100 als neues FA-Gen klassifizieren. Zudem wurde die Rolle des Subkomplexes LBP100 innerhalb des FA-Kernkomplexes weiter aufgeklärt. Beides trägt zu einem besseren Verständnis des FA/BRCA-Signalweges bei. Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von FAAP100138, einer bisher nicht validierten Isoform von FAAP100. Durch dieses Protein konnte der zelluläre FA-Phänotyp von FAAP100-defizienten Zelllinien nicht komplementiert werden, jedoch wurden Hinweise auf einen dominant-negativen Effekt von FAAP100138 auf den FA/BRCA-Signalweg gefunden. Dies könnte zu der Erklärung beitragen, warum und wie der Signalweg, beispielsweise in bestimmtem Gewebearten, herunterreguliert wird. Zudem wäre eine Verwendung in der Krebstherapie denkbar. / Fanconi Anemia (FA) is a rare heterogeneous hereditary disease. It shows a highly variable clinical presentation including congenital malformations, bone marrow failure and increased risk for cancer and endocrine pathologies. The disease is classified as one of the genomic instability disorders that are characterized by failure of DNA damage repair processes. FA shows a typical hypersensitivity toward DNA crosslinking agents (e.g. Mitomycin C, cisplatin). There is an increased rate of chromosomal breakage and cell cycle arrest in the G2 phase. These characteristics are present spontaneously and after incubation with DNA crosslinking agents. The genetic defect can be found in one of the 22 reported FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U, -V, -W) or yet unknown FA genes. FA gene defects are inherited in an autosomal recessive way with the exceptions of FANCR (dominant negative de novo mutations) and FANCB (X-linked). Together with other proteins, the FA gene products establish the FA/BRCA pathway. The key event of this pathway is the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI (ID2 complex). From this point it is possible to differentiate between upstream and downstream FA proteins. The latter are directly involved in FA-dependent DNA repair processes. The upstream positioned FA proteins form the FA core complex that includes FA and FA-associated proteins (FAAPs). The FA core complex is responsible for the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI. To date no pathogenic human mutations of the FAAPs have been described. Among these proteins is FAAP100 which together with FANCB and FANCL forms the subcomplex LBP100 within the FA core complex. In the present thesis a closer characterization of this protein has been achieved. In an amniotic cell line a homozygous missense mutation could be identified. The affected fetus displayed a typical FA phenotype and the cells also showed characteristics of FA. The cellular phenotype was complemented by FAAP100WT, thus proving the pathogenicity of the mutation. Supporting this result, additional FAAP100-deficient cell lines have been generated using the CRISPR/Cas9 system. These also exhibited a typical FA cellular phenotype which could be complemented by FAAP100WT. In vitro models served as a basis for better understanding the function of the FA core complex in general and of the LBP100 subcomplex in particular. Only in the presence of an intact FAAP100 the LBP100 module can be formed and transported to sites of DNA interstrand crosslinks. There, FAAP100 significantly contributes to the FANCD2 monoubiquitination process and thus to the activation of FA-dependent DNA damage repair. In order to also examine the function of FAAP100 in vivo, an Faap100-/- mouse model has been generated which shows a relatively severe FA phenotype comparable to other FA mouse models. Because of these results FAAP100 can be categorized as a new FA gene. Moreover, the role of the LBP100 subcomplex within the FA core complex was further elucidated and a better understanding of the FA/BRCA pathway was achieved. Another part of this thesis deals with the characterization of FAAP100138, a hitherto not validated isoform of FAAP100. The cellular FA phenotype of FAAP100-deficient cell lines could not be complemented by this isoform. However, there are clues pointing to a dominant negative effect of FAAP100138 on the FA/BRCA pathway. This finding could serve as a potential explanation of how and why the FA signaling pathway is downregulated in certain tissues. A therapeutic application for cancer of FAAP100138 appears possible.

Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive or X-chromosomal inherited disorder, which is not only phenotypically but also genotypically very heterogeneous. While its hallmark feature is progressive bone marrow failure, many yet not all patients suffer additionally from typical congenital malformations like radial ray defects and growth retardation. In young adulthood the cumulative risk for developing hematological or other malignancies is compared to the general population several hundred-fold increased. The underlying molecular defect is the deficiency of DNA interstrand crosslink (ICL) repair. ICLs are deleterious lesions, which interfere with crucial cellular processes like transcription and replication and thereby can lead to malignant transformation, premature senescence or cell death. To overcome this threat evolution developed a highly complex network of interacting DNA repair pathways, which is conserved completely only in vertebrates. The so called FA/BRCA DNA damage response pathway is able to recognize ICLs on stalled replication forks and promotes their repair through homologous recombination (HR). Today we know 15 FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O and -P) whose products are involved in this pathway. Although more than 80% of FA patients carry biallelic mutations in either FANCA, FANCC or FANCG, there are still some who cannot be assigned to any of the known complementation groups. This work aimed to indentify the di¬sease causing mutations in a cohort of those unassigned patients. Initial screens of the candidate genes FAN1, MHF1 and MHF2 did not reveal any pathogenic alterations. Moreover, FAN1 could be excluded as FA candidate gene because patients carrying a homozygous microdeletion including the FAN1 locus did not show a phenotype comparable to FA patients. In the case of MHF1 and MHF2 the reason for the negative screening result is not clear. Mutation carriers might be rare or, regarding the diverse and also FA pathway independent protein functions, phenotypically not comparable to FA patients. Nevertheless, this study contri¬buted to the identification and characterization of the most recent members of the FA pathway - RAD51C (FANCO), SLX4 (FANCP) and XPF (FANCQ). FANCO is one of the RAD51 paralogs and is involved in crucial steps of HR. But since the only reported FA-O patient has so far not developed any hematological anomalies, FANCO is tentatively designated as gene underlying an FA-like disorder. In contrast, patients carrying biallelic mutations in FANCP do not only show hematological anomalies, but as well congenital malformations typical for FA. The distinct role of FANCP in the FA pathway could not be determined, but it is most likely the coordination of structure-specific nucleases during ICL excision. One of these nucleases is the heterodimer XPF/ERCC1. XPF is probably disease causing in the complementation group FA-Q and is the first FA gene, which was identified by Next Generation Sequencing (NGS). Extraordinarily is that mutations in this gene had previously been reported to cause two other disorders, xeroderma pigmentosum and segmental progeria. Despite some overlaps, it was shown that the divergent phenotypes could clearly be distinguished and are caused by distinct functional defects of XPF. Additionally, this work aimed to improve and accelerate the genotyping process of FA patients in general. Therefore, classical approaches should be complemented or fully replaced by approa¬ches using NGS. Massively parallel sequencing of the whole exome proved to be most appro¬priate and the establishment of an FA-specific analysis pipeline facilitated improved molecular diagnostics by combining complementation group assignment and mutation analysis in one step. Consequently two NGS studies revealed the pathogenic defect in several previously unassigned FA patients and thereby added another patient to one of the most recent subtypes, FA-P. In summary, this work contributed not only to further completion of the FA/BRCA DNA repair network by adding three novel genes, it also showed that classical molecular approaches for re¬search as well as for diagnostics could be replaced by NGS. / Die Fanconi Anämie (FA) ist eine autosomal rezessiv oder X-chromosomal vererbte Erkrankung, deren charakteristisches diagnostisches Merkmal das progressive Versagen des Knochenmarks darstellt. Viele, jedoch nicht alle Patienten leiden zusätzlich an kongenitalen Fehlbildungen, wie Radialstrahl-Anomalien oder Minderwuchs. Im Vergleich zur normalen Bevölkerung steigt zu¬dem im jungen Erwachsenenalter das Risiko für hämatologische und auch solide Tumoren um ein Vielfaches. Verantwortlich hierfür ist sehr wahrscheinlich der zugrunde liegende Defekt in der Reparatur von DNA-Interstrang-Quervernetzungen. Diese Art der Läsion blockiert wich¬tige zelluläre Prozesse wie Transkription und Replikation, und kann daher nicht nur zur Ent¬artung oder vorzeitigen Alterung der Zellen, sondern auch zu stark erhöhten Apoptose-Raten führen. Zur Entfernung dieser Quervernetzungen hat die Evolution ein komplexes Netzwerk an verschiedenen Reparaturwegen hervorgebracht, das nur in Vertebraten vollständig konserviert ist. Der sogenannte FA/BRCA-Reparaturweg ist in der Lage Quervernetzungen an stagnierten Replikationsgabeln zu erkennen und zu entfernen. Heute kennen wir 15 Gene (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O und -P), deren Produkte in diesem Weg involviert sind und deren pathogene Veränderung zur Ausprägung des FA-Phänotyps führen. Rund 80% aller Fälle können durch biallelische Mutationen in FANCA, FANCC und FANCG erklärt werden. Pa¬thogene Varianten in anderen Genen werden weitaus seltener gefunden und ein kleiner Anteil der Patienten kann keiner der bekannten Komplementationsgruppen zugeordnet werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, den ursächlichen genetischen Defekt in diesen Patienten aufzudecken. Untersuchungen an den Kandidatengenen FAN1, MHF1 und MHF2 konnten keine pathoge¬nen Veränderungen identifizieren. FAN1 konnte darüber hinaus gänzlich als Kandidatengen aus¬geschlossen werden, da Patienten mit einer homozygoten FAN1-Deletion keinen FA-Phänotyp zeigten. Im Fall von MHF1 und MHF2 sind Mutationsträger wahrscheinlich sehr selten oder unterscheiden sich in ihrem Phänotyp von den bisher bekannten FA Patienten. Nichtsdestotrotz trug diese Arbeit maßgeblich zur Aufklärung der genetischen Ursache in den Untergruppen FA-O, FA-P und FA-Q bei. Ursächlich für den Subtyp FA-O sind biallelische Mutationen in RAD51C, einem Paralog der Rekombinase RAD51, mit offenbar entscheidender Funktion in der homolo¬gen Rekombinationsreparatur. Da der einzige bislang beschriebene Patient zum Zeitpunkt der Veröffentlichung zwar charakteristische Fehlbildungen, aber weder hämatologische Auffälligkei¬ten, noch maligne Veränderungen zeigte, wird RAD51C (FANCO) bisher als zugrunde liegendes Gen einer FA-ähnlichen Krankheit bezeichnet. Bei der Identifizierung von SLX4 als ursächliches Gen der Untergruppe FA-P gab es hingegen keine Zweifel; alle Patienten zeigten einen sehr ty¬pischen Phänotyp. SLX4 (FANCP) scheint eine entscheidende Rolle bei der Exzision von DNA-Quervernetzungen zu spielen, indem es die Funktion oder richtige Positionierung von Struktur-spezifischen Nukleasen koordiniert. Eine dieser Nukleasen ist das Heterodimer XPF/ERCC1. XPF liegt wahrscheinlich der Komplementationsgruppe FA-Q zugrunde und ist das erste FA-Gen, das mittels Next Generation Sequencing (NGS) identifiziert wurde. Interessanterweise wurde es zuvor bereits als genetische Ursache von Xeroderma pigmentosum und segmentärer Progerie beschrieben. Diese Studie konnte jedoch belegen, dass die jeweiligen Mutationen die Proteinfunktion derart unterschiedlich beeinflussen, dass es tatsächlich zur Ausprägung von drei divergenten Phänotypen kommen kann. Neben der Kandidatengensuche war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Implementierung neuer Techniken für die FA-Genotypisierung. Klassische Methoden der Molekulargenetik sollten hier¬für durch Anwendungen des NGS ergänzt oder gänzlich ersetzt werden. Die Hochdurchsatz- Sequenzierung des gesamten Exoms erwies sich als geeignet und kann Komplementationsgrup¬pen-Zuordnung und Mutationsanalyse in einem Schritt vereinen. Durch die Etablierung einer FA-spezifischen bioinformatischen Datenanalyse konnte im Rahmen dieser Arbeit der genetische Defekt bereits mehrerer Patienten aufgeklärt werden. Im Besonderen konnte ein weiterer Patient der neuen, noch wenig charakterisierten Untergruppe FA-P zugeordnet werden. Insgesamt trug diese Arbeit also nicht nur zur weiteren Vervollständigung des FA/BRCA-Re-paraturweges bei, indem drei neue FA-Gene hinzugefügt wurden; sie zeigte außerdem, dass klas¬sische Methoden der Molekulargenetik sowohl in Forschung als auch Diagnostik künftig durch das NGS ersetzt werden könnten.

Loss of heterozygosity (LOH) is detectable in many forms of cancer including leukaemia. It contributes to tumorigenesis through the loss of one of the two alleles of one tumor suppressor gene at a given locus, caused by deletion or uniparental disomy (UPD). UPD can only be the result of homologous recombination. Little is known about the mechanisms of UPD and what connection this aberration has with the outcome of this disease. In this study, 146 patients with primary AML were analysed using a novel technique based on single nucleotide polymorphisms (SNPs). Leukaemic cells and healthy T-cells from each patient were obtained using FACS-Vantage cell sorting. In cases with very few sorted cells whole genome preamplification was done. Genome-wide SNP analysis was carried out according to the standard GeneChip Mapping Assay protocol (Affymetrix, USA) using the Human Mapping 10K Arrays. Moreover, the impact of the FLT3-ITD mutation on the homologous recombination using pmHPRT-DRGFP /pCbASce vectors system and yHA2x assay was investigated. Of 146 patients with normal karyotype LOH was found in 30 cases. The potential LOH regions, were confirmed by microsatellite analysis of short tandem repeat (STR) markers. In 21 of these cases STR-analysis of T-cells, representing the corresponding tumor-free material, confirmed the regions of partial UPD. This aberration affected different chromosomes, but most commonly chr. 2, 6, 11, 21, 13, and 7, and covered between 11.5 and 88 Mb. Interestingly, in 6 LOH cases, long stretches of homozygosity present at the same positions as in the healthy cells and in the blasts were found. The impact of this phenomenon is unknown. Additionally, chromosome losses were detected in 3 patients classified with normal karyotype according to current methods. These 9 cases were not included in the UPD positive group. No differences were observed regarding any clinical factors including age, WBC-counts and sex. The FAB M1 subtype was observed in 47.6% of the UPD positive patients, compared to only 19.2% of the UPD negative patients (P=0.04, n=146). In addition, no correlation between FLT3-ITD, MLL-PTD and NPM1 mutations in the UPD patients was found, but the data indicate that patients with UPD have a higher rate of treatment failure. Moreover, in this study the relationship between UPD and gene aberrations was able to be confirmed. In some cases, UPD found on chromosomes 21, 19 and 11 was correlated with mutations in the RUNX1, CEBPA and WT genes, respectively. Furthermore, AML cases with and without UPD showed different but specific gene expression profiles, revealing different expression levels for genes involved in double strand break repairs. Furthermore, it was found that different mutations could be responsible for the increase in efficiency of HR, such as FLT3-ITD or BCR-ABL. Moreover, cells with a FLT3-ITD mutation (without wt expression) rapidly increased the HR efficiency compared with heterozygous (FLT3-ITD/wt) cells. Preliminary results showed that the high repair efficiency was mainly dependent on the translocation of RAD51. In conclusion, SNP array technology allow the identification and mapping of LOH in AML patients with normal karyotype. The obtained data also point out the necessity of analysing tumour-free material to confirm the somatic origin of the alteration. Furthermore, the available results indicate that compared to patients without UPD, patients with UPD have a higher relapse rate, which might be used as a prognostic marker in the future. Also, it could be hypothesized that downregulation of RAD51 (for example by FLT3 inhibition) might be beneficial DNA damage occurs through the genotoxic agent by reducing the relapse risk of AML.

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Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Mechanismen hormoninduzierter Ca2+-oszillationen, und wie diese von Konzentrationsschwankungen des Ca2+-freisetzenden Botenstoffes Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) beinflusst werden. Wir konnten zeigen, dass IP3-Oszillationen die Frequenzkodierung des äußeren Stimulus durch Ca2+-Ozillationen deutlich verstärken. Zwei Mechanismen für das Entstehen der IP3-Oszillationen wurden untersucht: es zeigte sich, dass die Aktivierung der Phospholipase C durch Ca2+ der wahrscheinlichste Mechanismus ist. Um die Rolle der IP3-Oszillationen genauer zu verstehen, wurde ein Modell für den Stoffwechsel des IP3-Vorläufers Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) entwickelt. Es zeigt sich, dass die scheinbar nutzlosen Phosphorylierungs/Dephosphorylierungszyklen eine wichtige Rolle für den PIP2-Haushalt spielen. Durch Nachliefern von PIP2 während der Stimulierung ermöglichen sie anhaltende Ca2+-signale. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit einem DNS-Reparaturweg, der Reparatur mittels Entfernung von Nukleotiden (NER). Dieser Reparaturmechanismus ist äußerst vielseitig und entfernt Pyrimidinpaare, die durch UV-Strahlung erzeugt wurden, oder Schäden, die durch chemische Agentien erzeugt wurden. Es wurde ein mathematisches Model erarbeitet, das die Grundeigenschaften der NER beschreiben soll. Erstens wurde untersucht, wie die Bindungs- und Freisetzungskinetik der Reparaturfaktoren mit den strukturellen Eigenschaften des Systems, beispielsweise der Bindungsreihenfolge, zusammenhängt. Zweitens wurden anhand von in vivo gemessenen Rekrutierungskinetiken dreier Proteinfaktoren die Modellparameter bestimmt. Das so angepasste Modell sagt unter anderem eine Sättigung der NER durch den Verbrauch des Erkennungsfaktors vorher. Die theoretischen Untersuchungen deuten darauf hin, dass ein sequentieller Anlagerungsmechanismus im Hinblick auf Effizienz und auf Spezifität gegenüber den beschädigten Substrat große Vorteile bringen kann. / The first part of this thesis focuses on the mechanisms of hormone induced Ca2+ oscillations and how these depend on fluctuations in the concentration of the Ca2+-releasing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3). We were able to show that IP3 oscillations greatly enhances the ability to frequency encode the hormone stimulus by Ca2+ oscillations. Two mechanisms for the generation of IP3-oscillations have been investigated, we could show that Ca2+-activation of phospholipase C is the most probable mechanism. To better understand the role of IP3-oscillations a detailed model for the phosphoinositide pathway has been developed. The model illustrates the importance of futile (de)phosphorylation cycles for regenerating phosphatidylinositol-4,5-bisphophat during stimulation, an essential property to support long-lasting Ca2+ signals. The second part of the thesis is devoted to nucleotide excision repair (NER). It is a versatile DNA repair mechanism that can remove lesions such as UV light induced pyrimidine dimers and bulky adducts caused by chemical agents. To understand the mechanisms underlying the protein assembly during NER and the performance of repair, a mathematical model, delineating hallmarks and general characteristics of NER, has been developed. First, the binding and dissociation kinetics of repair factors are related to the structural properties of the system, such as the sequential order in which the factors enter repair. Second, using in vivo kinetic data for the recruitment of three different proteins at local damaged nuclei, the model parameters are determined and the dynamic behavior of the repair process is scrutinized in detail. The observed saturation of NER is predicted to rely on the high engagement of the recognition factor in repair. The theoretical analysis of repair performance indicates that a sequential assembly process is remarkably advantageous in terms of repair efficiency and can show a marked selectivity for the damaged substrate.

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Background: Therapy resistance is a great challenge in cancer treatment. Among numerous factors, cell adhesion to extracellular matrix is a well-known determinant of radiochemo-resistance. It has been shown that targeting focal adhesion proteins (FAPs), e.g. β1 integrin, enhances tumor cell radio(chemo)sensitivity in various entities such as head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), lung carcinoma, glioblastoma, breast carcinoma and leukemia. Previous studies demonstrated a functional crosstalk between specific FAPs and DNA repair processes; however, the molecular circuitry underlying this crosstalk remains largely unsolved. Hence, this study in HNSCC aimed to identify alternative FAPs associated with DNA damage repair mechanisms and radioresistance. Materials and Methods: A novel 3D High Throughput RNAi Screen (3DHT-RNAi-S) using laminin-rich extracellular matrix (lrECM) was established to determine radiation-induced re-sidual DNA double strand breaks (DSBs; foci assay) and clonogenic radiation survival. In the screen, we used UTSCC15 HNSSC cells stably expressing the DSB marker protein 53BP1 tagged to pEGFP. Validations were performed in 10 additional HNSCC cell lines (Cal33, FaDu, SAS, UTSCC5, UTSCC8, UTSCC14, UTSCC15, UTSCC45 and XF354fl2) grown in 3D lrECM. Immunofluorescence staining, immunoblotting, chromatin fractionation were utilized to evaluate protein expression, dynamics and kinetics post irradiation. Investigations of molecular mechanisms of DNA repair and radio(chemo)resistance employed DSB repair reporter assays for non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR), cell cycle analysis, chromatin fractionation levels evaluation and kinase activity profiling (PamGene) upon protein knockdown in combination with/-out X-ray exposure. Foci assay and clonogenic survival assay were performed after single or multiple knockdowns of synemin and associated proteins such as DNA-PKcs and c-Abl. Protein-protein interactions between synemin and associated proteins were determined using immunoprecipitation and proximity ligation assay. Mutant/depletion constructs of synemin (ΔLink-Tail, ΔHead-Link, Synemin_301-961, Synemin_962-1565, S1114A and S1159A) were generated in order to identify essential synemin’s sites controlling DNA repair functions. Results: Among the targets found in the 3DHT-RNAi-S, synemin was one of the most promising FAP candidates to determine HNSCC cell survival and DNA damage repair. Synemin silencing radiosensitized HNSCC cells, while its exogenous overexpression induced radio-protection. Radiation induced an increased synemin/chromatin interaction and a marked ac-cumulation of synemin in the perinuclear area. Intriguingly, synemin depletion elicited a 40% reduction in NHEJ activity without affecting HR or Alt-EJ. In line, ATM, DNA-PKcs and c-Abl phosphorylation as well as Ku70 expression strongly declined in synemin depleted and irra-diated cells relative to controls, whereas an opposite effect was observed under synemin overexpression. Single, double and triple depletion of synemin, DNA-PKcs and c-Abl resulted in a similar radiosensitizing effect and DSB levels as detected upon single knockdown of synemin, describing its upstream role. In kinome analysis, tyrosine kinases showed signifi-cantly reduced activity after synemin silencing relative to controls. Furthermore, immunoprecipitation assays revealed a protein complex formed between synemin, DNA-PKcs and c-Abl under pre- and post-irradiation conditions. This protein complex dispersed when ATM was pharmacologically inhibited, implying synemin function to be dependent on ATM kinase activity. By means of the different mutation/deletion constructs of synemin, the phosphorylation site at serine 1114 located on the distal portion of synemin’s tail was identified as essential protein-protein interaction site for synemin’s function in DNA repair. Conclusions: The established 3DHT-RNAi-S provides a robust screening platform for identifying novel targets involved in therapy resistance. Based on this screen and detailed mechanistic analyses, the intermediate filament synemin was discovered as a novel important determinant of DNA repair, tyrosine kinase activity and radiochemoresistance of HNSCC cells. These results further support the notion that DNA repair is controlled by cooperative interactions between nuclear and cytoplasmic proteins.