Vid låga mängder av DNA, vilket det ofta är vid forensiska prover, är en lyckad DNA-analys beroende av ett effektivt DNA-extraktionsprotokoll. Bland flera kommersiellt tillgängliga extraktionsmetoder för DNA har tidigare studier visat att Chelex 100 resin, som idag används på Nationellt Forensiskt Centrum i Linköping, är en snabb och enkel metod utan toxiska ämnen, långa väntetider eller större kostnader och som även ger ett högt DNA-utbyte. På teknisk mikrobiologi i Lund har olika chelex-baserade protokoll för spårsäkring och extraktion tagits fram för att optimera det aktuella protokollet på Nationellt Forensiskt Centrum. I detta arbete kombinerades spårsäkringsteknik och DNA-extraktionsprotokoll från tidigare studier med olika rör och tops, med syftet att i bästa fall generera ett protokoll som är optimalt för de vanligast förekommande brottsplatsproverna. I resultatet observerades högre DNA-utbyte med reducerade volymer lyseringsbuffert, vilket användning av rör-i-rörsystem tillät. När rör-i-rörsystem sedan kombinerades med extraktionsprotokoll innehållande SDS, observerades en ökning i DNA-utbytet. När dessa två faktorer vidare kombinerades med en tops vars skaft kan klippas rakt av ökade DNA-utbytet ytterligare. Ett byte från mikrofugrör, som används på Nationellt Forensiskt Centrum idag, till ett rör-i-rörsystem reducerar lyseringsvolymen från ca. 600 µl till 200 µl vilket är en avgörande faktor för effektivare extraktioner. / When handling low amounts of DNA, which often is the case with forensic samples, a successful DNA analysis is dependent on an effective DNA extraction protocol. Among many commercially available extraction methods for DNA, previous research has proved Chelex 100 resin, which is used at National Forensic Center in Linkoping, to be a quick and simple method without toxic substances, long waiting time or large costs, which in addition provides a high DNA exchange. At Applied Microbiology, Lund´s University, different chelex-based protocols for sampling and DNA extraction have been developed to optimize the present protocol at the National Forensic Center. In this study, sampling techniques and DNA extraction from previous studies was further combined with different tubes and swabs with the aim to, in best case, generate a protocol that is optimal for the most common crime scene samples. The results showed improved DNA yields with less extraction volume, which the tube in tube system made possible. When tube in tube system was combined with extraction protocols containing SDS, a higher DNA yield was observed. When these two factors were further combined with a cotton swab, whose shaft can be cut straight of, the DNA yield improved even more. A change from microfuge tubes, which is used at the National Forensic Center, to tube in tube system, the lysis volume could be reduced from approximately 600 µl to 200 µl which is a deciding factor for higher DNA yield.

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På huden lever en sammansättning av olika mikroorganismer såsom bakterier, svampar och virus. Dessa mikroorganismer kallas hudens mikrobiom. Sammansättningen av en individs mikrobiom kan ge mycket information om en individens hälsa. För att undersöka sammansättningen av bakterier på hudytan med exempelvis qPCR, behöver bakterier samlas in och DNA extraheras. Bakteriekoncentrationen på hudens torrare områden som exempelvis armar har normalt en relativt låg bakteriekoncentration vid 102-104 bakterier per cm2. Huden koloniseras till stor del av grampositiva bakterier. Grampositiva bakterier är i regel svårare att lysera än andra bakterier och kräver därför hårdare lysering. En bra extraktionsmetod ska erhålla mycket DNA utan att påverka dess kvalité. I detta arbete utvärderades initialt fem olika extraktionsmetoder på bakteriesuspension med Staphylococcus aureus (S. aureus), både direkt på bakteriesuspension men också från svabb. Utvärdering gjordes på PureLink Microbiome DNA Purification Kit, QlAamp PowerFecal Pro, QlAamp DNA Mini Kit och KOH-EDTA. Metoden med QlAamp DNA Mini Kit testades med två olika protokoll och räknades som två separata metoder. Metoderna som gav bäst resultat vid initial utvärdering var PureLink Microbiome och KOH-EDTA. Därefter utvärderades dessa två metoderna på prov insamlat med svabb från huden på 10 frivilliga deltagare.

Im urbanen Abwasser findet sich eine Vielzahl pathogener Mikroorganismen, welche ein Risiko für Tier, Mensch und Umwelt darstellen. Um die Integration dieser und vieler weiterer Schadstoffe in den öffentlichen Wasserkreislauf zu verhindern, ist deren Eliminierung durch Klärwerke und die Überwachung dieser Abläufe von besonderer Relevanz. Obwohl die Präsenz mikrobiologischer Parameter dabei bisher lediglich akzessorisch betrachtet wird, sollten besonders Zoonosen im Abwasser aufgrund ihrer hohen Gesundheitsgefahr für Tiere und Menschen Beachtung in den vorgeschriebenen Kontrollen finden. Hierfür eignen sich besonders molekularbiologische Methoden, wie beispielsweise die zeiteffiziente real-time PCR, welche eine hohe Sensitivität und Spezifität garantiert. Eine Grundvoraussetzung für diesen DNA-basierten Pathogennachweis ist eine schnelle und effiziente Nukleinsäuren-Extraktion am Point-of-Need. Viele existierende Extraktionsverfahren werden diesem Anspruch jedoch aufgrund zeitintensiver und komplexer Protokolle nicht gerecht. Ziel dieser Studie war es, eine Extraktionsmethode für mikrobielle DNA aus Abwasser zu entwickeln, mit welcher Pathogene mittels molekularer Detektionsmethoden wie beispielsweise real-time PCR nachgewiesen werden können. Die Extraktion der DNA des grampositiven Bakteriums S. aureus, des gramnegativen Bakteriums E. coli und des Parasiten C. parvum basierte auf einer „Reverse Purification“. Um einen effizienten Zellaufschluss und DNA-Nachweis zu garantieren, wurde das Verfahren um a) mechanische (Bead Beating), b) chemische (alkalische Inkubation bei Raumtemperatur oder 95 °C) und/oder c) enzymatische (Proteinase K) Vorbehandlungen ergänzt. Das Bead Beating-Protokoll wurde anschließend durch die Variation der Kugelgrößen und den Einsatz von Vortexer oder Hulamixer anstelle eines komplexen Bead Beaters adaptiert. Mithilfe einer Verdünnungsreihe der Pathogene in experimentell kontaminiertem Abwasser wurde das Detektionslimit bestimmt und bei 95 %-iger Wahrscheinlichkeit durch das Wilrich&Wilrich Modell kalkuliert. Zusätzlich dazu wurden die Nukleinsäurekonzentrationen der einzelnen Protokolle mittels NanodropTM (Spektralphotometer) und QubitTM (Fluorometer) gemessen. Die Resultate wurden denen einer Silica-Säulen-basierten Referenzmethode gegenübergestellt. Die effizienteste Methode zum Zellaufschluss der Bakterien steigerte die Extraktionseffizienz gegenüber der Referenzmethode um das Vierfache und beinhaltete eine Kombination aus Bead Beating (mit 0,1mm Glaskugeln und einem Vortexer) und Proteinase K bei 60°C für 10 Minuten. Im Fall von C. parvum erwies sich Proteinase K als effektivste Vorbehandlung (siebenfacher Anstieg der Extraktionsmenge). Basierend auf der etablierten Extraktionsmethode wurde bis zu 0,74 Zellen pro Reaktion von S. aureus, 9,94 Zellen von E. coli und 13,55 Oozysten von C. parvum in experimentell kontaminiertem Abwasser extrahiert und detektiert. Zwischen den detektierten Nukleinsäurekonzentrationen und den ermittelten Extraktionseffizienzen in der real-time PCR wurde keine Korrelation festgestellt. Zur Extraktion mikrobieller DNA aus Abwasser wurde eine Methode für grampositive Bakterien (S. aureus), gramnegative Bakterien (E. coli) und Protozoen (C. parvum) entwickelt, welche eine schnelle und sensitive Erregerdetektion mittels real-time PCR garantiert. Diese Vorteile ermöglichen ein mobil einsetzbares Abwassermonitoring am Point-of-Need.:1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Mikrobielle Risiken im Abwasser 2.1.1 Staphylococcus aureus 2.1.2 Escherichia coli 2.1.3 Cryptosporidium parvum 2.2 Ablauf der Abwasseraufbereitung in Deutschland 2.3 Abwassermonitoring 2.3.1 Aktuelle Gesetzeslage und Empfehlungen 2.3.2 Zusätzliche Einsatzmöglichkeiten 2.4 Nachweismethoden im Abwasser: der Vergleich zwischen Kultur und real-time PCR 2.5 Extraktionsverfahren mikrobieller DNA 2.5.1 Konventionelle Extraktionsverfahren 2.5.2 Festphasen-Nukleinsäurenextraktion 3 PUBLIKATION 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil der Publikation 3.2 Publikation 4 DISKUSSION UND SCHLUSSFOLGERUNG 5 ZUSAMMENFASSUNG 6 SUMMARY 7 REFERENZEN 8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9 TABELLENVERZEICHNIS 10 ANHANG 11 DANKSAGUNG

Die Rindertuberkulose ist eine chronische Erkrankung, die von Mycobacterium (M.) bovis und M. caprae, Mitgliedern des Mycobacterium-tuberculosis-Komplex (MTC), ausgelöst wird. Tuberkulose-Erregern werden sowohl mittels kultureller als auch molekulare Untersuchungsmethoden nachgewiesen. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Sensitivität des DNA-Nachweises von Tuberkulose-Erregern zu steigern. Dafür wurden drei Fragestellung im Bereich der molekularen Mykobakterien-Diagnostik bearbeitet. I) Zur Verbesserung der Lyse der mykobakteriellen Zellwand als Voraussetzung für eine Zunahme der Freisetzung von DNA wurden im Vergleich zu einer standardisierten DNA-Isolierungsmethode vier verschiedene Lyseprotokolle (thermische, enzymatische, thermo-enzymatische und mechanische Lyse) entwickelt und mit M. bovis BCG durchgeführt. Die Verbesserung wurde anhand der cycle threshold (Ct)-Werte einer MTC-spezifischen Real-Time (rt) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geprüft. Zwei Lyseprotokolle (thermische und mechanische Lyse) wurden bei zehn Gewebeproben (Lymphknoten, Leber und Lunge) von zehn Tieren (acht Rinder, ein Lama und ein Luchs) mit nachgewiesener Tuberkulose ange-wendet. II) Ausserdem, wurde eine rt-PCR mit dem 16S rRNA Gen als Zielgen (16S-rt-PCR) für den direkten Nachweis von Erregern der Gattung Mycobacterium im Gewebe entwickelt. III) Ein neu entwickelter Spoligotyping-Microarray wurde mit der konventionellen Spoligoty-ping-Methode verglichen, um die neue Methode in Bezug die Sensitivität des Nachweises und des diskriminatorischen Potenzials direkt bei infizierten Gewebeproben zu analysieren. Bei der konventionellen Methode erfolgt die Hybridisierung des PCR-Produktes auf einer Nylon Membran, auf der spezifische Oligonukleotide fixiert sind. Bei der Microarray-Methode sind diese auf einem Microarray-Chip fixiert. Die Ergebnisse der Untersuchungen (I) zur Lyse der Zellwand bei M. bovis BCG zeigten, dass bei der mechanischen Lyse eine Zunahme um 14 % und bei der thermischen Lyse eine Zunahme an PCR-Produkt von 6 % im Vergleich zur Standardlyse erbrachte. Bei beiden Lyseprotokollen wurde eine statistische Signifikanz von α = 1 % (Mann-Whitney-Test) im Vergleich zur Standardlyse errechnet. Bei den tuberkulösen Gewebeproben wurde bei der mechanischen Lyse eine durchschnitliche Zunahme an PCR-Produkt um circa 9 % im Vergleich zur Standardlyse erzielt. Dieser Unterschied war jedoch auf Grund der geringen Probeanzahl nicht statistisch signifikant. II) Bei der Untersuchung von 43 Mykobakterien-Spezies, sechs Mitgliedern des MTC (unter anderen M. bovis BCG) und 37 Non Tuberculous Mycobacteria (NTM) Spezies, konnten alle mit der entwickelten Real-Time PCR (16S-rt-PCR) nachgewiesen werden. DNA-Extrakte von acht nicht zur Gattung Mycobacterium gehörenden Spezies wurden mit der 16S-rt-PCR nicht erfasst. Ein Erreger der Gattung Gordonia und ei-ner der Gattung Rhodococcus wurden auf Grund ihres engen Verwandtschaftsgrades jedoch ebenfalls mit der 16S-rt-PCR detektiert. Die oben erwähnten mittels MTC-spezifischer rt-PCR (Zielgen IS 1081) als infiziert identifizierten zehn Gewebeproben, wurden mittels 16S-rt-PCR untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass beiden rt-PCR Systeme eine vergleichbare Sensitivität aufwiesen. III) Bei dem Vergleich zwischen den Spoligotyping-Methoden zeigte sich die neue Methode um einen Faktor von 100 bei der M. bovis BCG-Reinkultur und um einen Fak-tor von 10 bei DNA-Extrakten aus tuberkulösen Gewebeproben sensitiver als die konventionelle Methode. Im Rahmen dieser Arbeit hat sich der Einsatz der mechanischen Lyse für die Verbesserung der Freisetzung von mykobakterieller DNA als routinefähig erwiesen. Die entwickelte 16S-rt-PCR erwies sich als brauchbare Methode für den Nachweis von Erregern der Gattung Mycobacterium. Die Microarray-Methode stellte sich wesentlich einfacher, sensitiver und schneller dar als die konventionelle Methode. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass alle drei Ansätze dieser Arbeit einen Beitrag zur Verbesserung der molekularen Labordiagnostik der Tuberkulose leisten. / Bovine tuberculosis is a chronic disease, that results from infection of Mycobacterium (M.) bovis and M. caprae, members of Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), respectively. The laboratory diagnosis of bovine tuberculosis is possible with culture as well as considerate fast molecular methods. The aim of this study was to improve the sensitivity of DNA detec-tion of tuberculosis-causing pathogens. Therefore, three different issues were addressed in the complex molecular procedure targeted. I) four different lytic protocols (thermal, enzymatic, thermo-enzymatic and mechanical lysis) were developed and compared to a standardized DNA isolation protocol that was performed on pure culture of Mycobacterium (M.) bovis BCG in order to improve the mycobacterial cell wall lysis leading to an increase of DNA release. The efficiencies of the lysis protocols were assessed by the resulting cycle threshold (Ct) values of a MTC-specific real time (rt) Polymerase Chain Reaction (PCR). Two lysis protocols (thermal and mechanical) were selected to fur-ther testing of ten tuberculosis-infected tissue samples (lymph nodes, liver and lungs) from ten animals (eight cattle, one lama and one lynx). II) In addition, a real time PCR using the 16S rRNA gene as target sequence was developed, which is also suitable to detect pathogens of Genus Mycobacterium on tissue samples. III) A comparison of a newly developed microarray and the conventional spoligotyping method was realised, to analyse the applicability of the microarray in relation of the sensitivity of the method and to analyse discriminatory potential directly from infected tissue samples. During the conventional spoligotyping method, the PCR product is hybridized with specific oligonucleotides, fixed on a nylon membrane. Using the newly developed method these oligonucleotides are fixed on a microarray-chip. The results I) of the mycobacterial cell wall lysis experiment with pure culture of M. bovis BCG showed an increase of 14 % by using mechanical lysis and an increase by 6 % of the PCR product by using thermal lysis compared to the standard protocol. Using the mechanical lysis as well as the thermal lysis a statistically significant (α = 1 % (Mann-Whitney-Test)) im-provement compared to the standard lysis was achieved. Mechanical lysis was performed on tuberculous tissue samples and the results of the lysis were improved by 9 % compared to the standard lysis. However, the difference between mechanical and standard lysis was not statistically significant due the small sample number. II) Forty-three different mycobacterial species, six members of MTC (among them M. bovis BCG) and 37 Non Tuberculous Mycobacteria (NTM), were detected using the newly developed real time PCR (16S-rt-PCR). Eight non-mycobacterial species were not detected using this rt-PCR, whereas one of genus Rhodococcus and one of genus Gordonia were detected by the 16S-rt-PCR due to their close genetic similarity to the genus Mycobacterium. The ten tuberculosis-infected tissue samples (see above) testing positive using a MTC-specific real time rt-PCR (target gene IS 1081) were sub-jected to the 16S-rt-PCR. Both rt-PCR systems showed a comparable sensitivity. III) By comparing the two spoligotyping-methods, the ArrayStrip™–format method was more sensitive than the conventional method by a factor of 100 applied to pure culture and by a factor of 10 when applied to DNA extracts from infected tissue samples. In conclusion, the mechanical lysis proved to be a practical method to liberate mycobacterial DNA. The newly developed rt-PCR was suitable to detect members of the genus Mycobacterium. The spoligotyping ArrayStrip™–format method appeared to be substantially easier to perform, more sensitive, and less time-consuming than the conventional method. The three methods described were suitable to improve the molecular laboratory diagnosis of tuberculosis.

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Die Rindertuberkulose ist eine chronische Erkrankung, die von Mycobacterium (M.) bovis und M. caprae, Mitgliedern des Mycobacterium-tuberculosis-Komplex (MTC), ausgelöst wird. Tuberkulose-Erregern werden sowohl mittels kultureller als auch molekulare Untersuchungsmethoden nachgewiesen. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Sensitivität des DNA-Nachweises von Tuberkulose-Erregern zu steigern. Dafür wurden drei Fragestellung im Bereich der molekularen Mykobakterien-Diagnostik bearbeitet. I) Zur Verbesserung der Lyse der mykobakteriellen Zellwand als Voraussetzung für eine Zunahme der Freisetzung von DNA wurden im Vergleich zu einer standardisierten DNA-Isolierungsmethode vier verschiedene Lyseprotokolle (thermische, enzymatische, thermo-enzymatische und mechanische Lyse) entwickelt und mit M. bovis BCG durchgeführt. Die Verbesserung wurde anhand der cycle threshold (Ct)-Werte einer MTC-spezifischen Real-Time (rt) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geprüft. Zwei Lyseprotokolle (thermische und mechanische Lyse) wurden bei zehn Gewebeproben (Lymphknoten, Leber und Lunge) von zehn Tieren (acht Rinder, ein Lama und ein Luchs) mit nachgewiesener Tuberkulose ange-wendet. II) Ausserdem, wurde eine rt-PCR mit dem 16S rRNA Gen als Zielgen (16S-rt-PCR) für den direkten Nachweis von Erregern der Gattung Mycobacterium im Gewebe entwickelt. III) Ein neu entwickelter Spoligotyping-Microarray wurde mit der konventionellen Spoligoty-ping-Methode verglichen, um die neue Methode in Bezug die Sensitivität des Nachweises und des diskriminatorischen Potenzials direkt bei infizierten Gewebeproben zu analysieren. Bei der konventionellen Methode erfolgt die Hybridisierung des PCR-Produktes auf einer Nylon Membran, auf der spezifische Oligonukleotide fixiert sind. Bei der Microarray-Methode sind diese auf einem Microarray-Chip fixiert. Die Ergebnisse der Untersuchungen (I) zur Lyse der Zellwand bei M. bovis BCG zeigten, dass bei der mechanischen Lyse eine Zunahme um 14 % und bei der thermischen Lyse eine Zunahme an PCR-Produkt von 6 % im Vergleich zur Standardlyse erbrachte. Bei beiden Lyseprotokollen wurde eine statistische Signifikanz von α = 1 % (Mann-Whitney-Test) im Vergleich zur Standardlyse errechnet. Bei den tuberkulösen Gewebeproben wurde bei der mechanischen Lyse eine durchschnitliche Zunahme an PCR-Produkt um circa 9 % im Vergleich zur Standardlyse erzielt. Dieser Unterschied war jedoch auf Grund der geringen Probeanzahl nicht statistisch signifikant. II) Bei der Untersuchung von 43 Mykobakterien-Spezies, sechs Mitgliedern des MTC (unter anderen M. bovis BCG) und 37 Non Tuberculous Mycobacteria (NTM) Spezies, konnten alle mit der entwickelten Real-Time PCR (16S-rt-PCR) nachgewiesen werden. DNA-Extrakte von acht nicht zur Gattung Mycobacterium gehörenden Spezies wurden mit der 16S-rt-PCR nicht erfasst. Ein Erreger der Gattung Gordonia und ei-ner der Gattung Rhodococcus wurden auf Grund ihres engen Verwandtschaftsgrades jedoch ebenfalls mit der 16S-rt-PCR detektiert. Die oben erwähnten mittels MTC-spezifischer rt-PCR (Zielgen IS 1081) als infiziert identifizierten zehn Gewebeproben, wurden mittels 16S-rt-PCR untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass beiden rt-PCR Systeme eine vergleichbare Sensitivität aufwiesen. III) Bei dem Vergleich zwischen den Spoligotyping-Methoden zeigte sich die neue Methode um einen Faktor von 100 bei der M. bovis BCG-Reinkultur und um einen Fak-tor von 10 bei DNA-Extrakten aus tuberkulösen Gewebeproben sensitiver als die konventionelle Methode. Im Rahmen dieser Arbeit hat sich der Einsatz der mechanischen Lyse für die Verbesserung der Freisetzung von mykobakterieller DNA als routinefähig erwiesen. Die entwickelte 16S-rt-PCR erwies sich als brauchbare Methode für den Nachweis von Erregern der Gattung Mycobacterium. Die Microarray-Methode stellte sich wesentlich einfacher, sensitiver und schneller dar als die konventionelle Methode. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass alle drei Ansätze dieser Arbeit einen Beitrag zur Verbesserung der molekularen Labordiagnostik der Tuberkulose leisten. / Bovine tuberculosis is a chronic disease, that results from infection of Mycobacterium (M.) bovis and M. caprae, members of Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), respectively. The laboratory diagnosis of bovine tuberculosis is possible with culture as well as considerate fast molecular methods. The aim of this study was to improve the sensitivity of DNA detec-tion of tuberculosis-causing pathogens. Therefore, three different issues were addressed in the complex molecular procedure targeted. I) four different lytic protocols (thermal, enzymatic, thermo-enzymatic and mechanical lysis) were developed and compared to a standardized DNA isolation protocol that was performed on pure culture of Mycobacterium (M.) bovis BCG in order to improve the mycobacterial cell wall lysis leading to an increase of DNA release. The efficiencies of the lysis protocols were assessed by the resulting cycle threshold (Ct) values of a MTC-specific real time (rt) Polymerase Chain Reaction (PCR). Two lysis protocols (thermal and mechanical) were selected to fur-ther testing of ten tuberculosis-infected tissue samples (lymph nodes, liver and lungs) from ten animals (eight cattle, one lama and one lynx). II) In addition, a real time PCR using the 16S rRNA gene as target sequence was developed, which is also suitable to detect pathogens of Genus Mycobacterium on tissue samples. III) A comparison of a newly developed microarray and the conventional spoligotyping method was realised, to analyse the applicability of the microarray in relation of the sensitivity of the method and to analyse discriminatory potential directly from infected tissue samples. During the conventional spoligotyping method, the PCR product is hybridized with specific oligonucleotides, fixed on a nylon membrane. Using the newly developed method these oligonucleotides are fixed on a microarray-chip. The results I) of the mycobacterial cell wall lysis experiment with pure culture of M. bovis BCG showed an increase of 14 % by using mechanical lysis and an increase by 6 % of the PCR product by using thermal lysis compared to the standard protocol. Using the mechanical lysis as well as the thermal lysis a statistically significant (α = 1 % (Mann-Whitney-Test)) im-provement compared to the standard lysis was achieved. Mechanical lysis was performed on tuberculous tissue samples and the results of the lysis were improved by 9 % compared to the standard lysis. However, the difference between mechanical and standard lysis was not statistically significant due the small sample number. II) Forty-three different mycobacterial species, six members of MTC (among them M. bovis BCG) and 37 Non Tuberculous Mycobacteria (NTM), were detected using the newly developed real time PCR (16S-rt-PCR). Eight non-mycobacterial species were not detected using this rt-PCR, whereas one of genus Rhodococcus and one of genus Gordonia were detected by the 16S-rt-PCR due to their close genetic similarity to the genus Mycobacterium. The ten tuberculosis-infected tissue samples (see above) testing positive using a MTC-specific real time rt-PCR (target gene IS 1081) were sub-jected to the 16S-rt-PCR. Both rt-PCR systems showed a comparable sensitivity. III) By comparing the two spoligotyping-methods, the ArrayStrip™–format method was more sensitive than the conventional method by a factor of 100 applied to pure culture and by a factor of 10 when applied to DNA extracts from infected tissue samples. In conclusion, the mechanical lysis proved to be a practical method to liberate mycobacterial DNA. The newly developed rt-PCR was suitable to detect members of the genus Mycobacterium. The spoligotyping ArrayStrip™–format method appeared to be substantially easier to perform, more sensitive, and less time-consuming than the conventional method. The three methods described were suitable to improve the molecular laboratory diagnosis of tuberculosis.

Das Afrikanische Schweinepest-Virus (ASPV) verursacht eine tödliche Viruserkrankung bei Schweinen. Dieses hat sich weltweit fortlaufend verbreitet und wurde im September 2020 erstmalig in Deutschland nachgewiesen. Der Ausbruch der Seuche kann schwere wirtschaftliche Verluste nach sich ziehen. Bis heute ist kein Impfstoff zugelassen, daher sind Überwachung der epidemiologischen Situation und der frühzeitige Erregernachweis unerlässlich für die Bekämpfung der Afrikanischen Schweinepest als Tierseuche. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gilt als Goldstandard für den Nachweis von ASPV und zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus. Allerdings erfordert die PCR gut ausgestattete Testlabore und ist zeitintensiv. Point-of-Need-Tests können schnelle und zuverlässige direkt vor Ort liefern und stellen somit eine Alternative zum Goldstandard PCR dar. Ziel dieser Studie war es, einen Point-of-Need-Test zum Nachweis von ASPV zu entwickeln. Dieser beruht auf der Grundlage der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und sollte vor Ort einsatzfähig sein. Es wurden drei Primersätze und eine Sonde auf der Grundlage des B646L-Gens, welches für das virale Kapsidprotein p72 vom ASP-Virus kodiert, entwickelt. Alle möglichen Kombinationen wurden getestet. Die analytische Sensitivität wurde mit acht Wiederholungen von Verdünnungsreihen des molekularen Standards (102-100 DNA-Kopien pro µl) ermittelt. Die Nachweisgrenze wurde anhand einer Probit-Analyse dieser Durchläufe berechnet. Die Spezifität wurde mit verschiedenen viralen Nukleinsäuren von anderen das Schwein infizierenden Erregern überprüft. Um den Test im Feld einsatzfähig zu gestalten, wurden mittels ASPV-RPA zwei verschiedene Extraktionsansätze mit allen 73 verfügbaren Schweineblutproben getestet: eine schnelle Hitze/Lysepuffer-Extraktionsmethode und ein standardisiertes Extraktionsverfahren auf Spin-Säule-Basis. Die diagnostische Sensitivität und Spezifität wurde für beide Testverfahren berechnet. Alle Ergebnisse wurden mit einer etablierten real-time PCR für ASPV verglichen. Eine kleine Pilotstudie zum Feldeinsatz des ASPV-RPA-Tests wurde in Uganda mit 20 Blutproben unter Verwendung des Kofferlabors durchgeführt. Die berechnete Nachweisgrenze von ASPV-RPA lag bei 3,5 DNA-Kopien pro µl. Alle untersuchten ASPV-Genotypen wurden detektiert, aber keine anderen viralen Nukleinsäuren. Bei Verwendung der standardisierten DNA-Extraktionsmethode mit anschließender Durchführung der ASPV-RPA lag die diagnostische Sensitivität und Spezifität bei 100%, wie auch mittels der real-time PCR. Auch das schnelle Hitze-/Lysepuffer Protokoll zeigte vielversprechende Ergebnisse und erreichte eine Positivrate von 97% mittels ASPV-RPA im Vergleich zu 38% bei der PCR. In Uganda wurden elf ASPV-RPA-Proben als positiv erkannt, darunter zwei fieberfreie asymptomatische Tiere. Der schnelle Erregernachweis stellt einen essenziellen Aspekt der ASP Seuchenbekämpfung dar. Die ASPV-RPA erwies sich als genauso empfindlich und spezifisch wie die Goldstandard-PCR zur Erregeridentifizierung. In Kombination mit dem Schritt der DNA-Extraktion durch Hitze/Lysepuffer benötigt der entwickelte Test etwa 25 Minuten von der Probenentnahme bis zum Ergebnis. Die Positivrate ist mit 97% vielversprechend, wobei die ASPV-RPA im Vergleich zur PCR eine höhere Toleranz gegenüber Inhibitoren aufwies. Wie die Pilot-Feldstudie in Uganda mit dem Kofferlabor zeigt, ist ASPV-RPA eine im Feld einsatzfähige Nachweismethode. Das Kofferlabor bedarf lediglich einer Grundausstattung und einer Solarbatterie. Somit stellt das Kofferlabor eine vielversprechende Diagnostikmethode dar, welche vor Ort in ressourcenarmen Umgebungen zum Nachweis des ASPV eingesetzt werden kann.:1. Introduction 2. Literature overview 2.1 African swine fever 2.1.1 Aetiology 2.1.1.1 Classification and taxonomy 2.1.1.2 Viral structure and genome 2.1.1.3 Genetic typing and antigenic variability 2.1.2 Epidemiology 2.1.2.1 Disease distribution 2.1.2.2 Host range and epidemiological cycles 2.1.2.2.1 Warthog-tick cycle 2.1.2.2.2 Domestic pig-tick cycle 2.1.2.2.3 Domestic pig cycle 2.1.2.2.4 Wild boar-environment cycle 2.1.2.3 Tenacity, transmission, and infectivity 2.1.3 Pathophysiology 2.1.3.1 Pathogenesis 2.1.3.2 Clinical signs and pathological findings 2.1.3.3 Differential diagnosis 2.2 Available diagnostic tools for ASFV 2.1.4 Diagnosis based on immune response 2.1.5 Diagnosis based on agent identification 2.3 Gaps in African swine fever diagnostics 3. Publication 3.1 Statement of contribution 3.1.1 Publication 4. Discussion 5. Summary 6. Zusammenfassung 7. References 8. Appendix 9. Acknowledgements / African swine fever virus (ASFV) causes a deadly viral disease in pigs. The virus has gradually spread throughout the world and was reported in Germany in September 2020. ASF outbreak can lead to huge economical loss. No vaccine is commercially available and thus, surveillance and early detection play a pivotal role to control an ASF outbreak. Polymerase Chain Reaction (PCR) is considered the gold standard for ASFV detection due to its superior sensitivity and specificity. However, it is time-consuming and requires well-equipped laboratories. Point-of-need tests can offer an alternative, delivering fast and reliable results directly in the field. The aim of this study was to establish a field-deployable point-of-need test based on Recombinase Polymerase Amplification (RPA) to detect ASFV. Material and Methods: Three sets of primers and one probe based on the B646L gene which encodes for the viral capsid protein p72 were designed. All possible combinations were screened. Analytical sensitivity was tested with eight replicates of serial dilutions of the molecular standard (102-10° DNA copies per µl). The limit of detection was calculated using probit analysis. ASFV-RPA’s specificity was tested using various viral nucleic acids of pathogens infecting pigs. To allow the deployment at point of need, two different extraction approaches were tested in ASFV-RPA with all 73 pig blood samples included in this study: a rapid heat/lysis buffer extraction method and a standardized spin-column based extraction kit. Diagnostic sensitivity and specificity were calculated for both test approaches. All results were compared to an established real-time PCR for ASFV. A small pilot study for ASFV-RPA assay deployment was done in Uganda with 20 blood samples of a suspected outbreak using the field-deployable suitcaselab. The calculated limit of detection of ASFV-RPA was 3.5 DNA copies per µl. All screened ASFV genotypes were detected while no other viral nucleic acids were identified. Using the standardized DNA extraction method in ASFV-RPA, and compared to real-time PCR, diagnostic sensitivity and specificity were 100%. The rapid heat/lysis buffer protocol showed very promising results, achieving 97% of positivity rate compared to a 38% of the real-time PCR. In Uganda, ASFV-RPA detected 11 samples as positive, including two known afebrile animals. Immediate agent detection is a key aspect of ASF outbreak control. ASFV-RPA is as sensitive and specific as a gold standard PCR for ASFV identification. Combined with the heat/lysis buffer DNA isolation step, the duration of the assay is around 25 minutes from sample collection to result readout, with a promising positivity rate of 97% which indicates tolerance against inhibitors. ASFV-RPA is a portable detection method, as revealed during the pilot field study in Uganda. Only requiring basic equipment and solar batteries, the suitcase lab is a promising tool for on-site diagnostics in resource limited settings to detect ASFV.:1. Introduction 2. Literature overview 2.1 African swine fever 2.1.1 Aetiology 2.1.1.1 Classification and taxonomy 2.1.1.2 Viral structure and genome 2.1.1.3 Genetic typing and antigenic variability 2.1.2 Epidemiology 2.1.2.1 Disease distribution 2.1.2.2 Host range and epidemiological cycles 2.1.2.2.1 Warthog-tick cycle 2.1.2.2.2 Domestic pig-tick cycle 2.1.2.2.3 Domestic pig cycle 2.1.2.2.4 Wild boar-environment cycle 2.1.2.3 Tenacity, transmission, and infectivity 2.1.3 Pathophysiology 2.1.3.1 Pathogenesis 2.1.3.2 Clinical signs and pathological findings 2.1.3.3 Differential diagnosis 2.2 Available diagnostic tools for ASFV 2.1.4 Diagnosis based on immune response 2.1.5 Diagnosis based on agent identification 2.3 Gaps in African swine fever diagnostics 3. Publication 3.1 Statement of contribution 3.1.1 Publication 4. Discussion 5. Summary 6. Zusammenfassung 7. References 8. Appendix 9. Acknowledgements