Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Marcus_Cristian_Muniz_Conde.pdf: 970527 bytes, checksum: a12676103871857eca97235b488f90c1 (MD5) Previous issue date: 2010-04-30 / Isolate high quality RNA form dental tissues is a most critical step to perform gene expression analysis. In some situations it is impossible to achieve the RNA isolation after tooth extraction, which leads to tooth discarding. Since, the aim of this experiment was to verify the effect of different teeth storage methods in the quality of RNA obtained from freshly extracted third molars. The teeth were randomly divided in five groups according to the temperature and storage time conditions. In control group RNA was isolated immediately after tooth extraction in room temperature. Experimental storage conditions evaluated were: liquid nitrogen, -80°C, -20°C (24h) and 4°C (6h). To RNA isolation, teeth were longitudinally sectioned and then pulp and pre-dentin were submerged in TRIzol®. Semi-quantitative RT-PCR was used to analyze the expression of odontoblast makers (DSPP, DMP1, and MEPE), which were normalized against the GAPDH gene. DSPP, DMP1 and MEPE were amplified in all storage conditions evaluated, regardless of storage method or tissue analyzed. Was possible to obtaining high quality RNA from pulp and dentin in all storage conditions appraised, increasing the RNA available to be used as positive control in cell differentiation studies / Extrair RNA de qualidade dos tecidos dentais é um passo crítico para a realização da análise de expressão gênica. Em algumas situações não é possível realizar o isolamento do material genético dos tecidos dentários logo após a exodontia, o que conduz ao descarte do dente. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de diferentes formas de armazenamento dos dentes na qualidade do RNA odontoblástico isolado de terceiros molares recém extraídos. Os dentes foram separados de forma aleatória em cinco grupos de acordo com o tempo e a temperatura de armazenamento. No grupo controle o RNA foi isolado imediatamente após o procedimento cirúrgico em temperatura ambiente.As condições experimentais avaliadas foram: armazenamento dos dentes em nitrogênio líquido, -80°C e -20°C durante 24h e armazenamento 4°C durante 6h. Para a extração do RNA os dentes foram seccionados e então o tecido pulpar e a pré-dentina foram imersos, separadamente, em TRIzol. RT-PCR foi utilizado para analisar a efetividade dos métodos de armazenamento através da amplificação dos marcadores da diferenciação odontoblástica (DSPP, DMP1, e MEPE), que foram normalizados contra o gene constitutivo GAPDH. DSPP, DMP1, e MEPE foram amplificados de forma clara em todas as condições avaliadas, independentente do método de armazenamento, ou do tecido avaliado. Foi possível obter RNA de qualidade em polpa e dentina, em todas as condições de armazenamento avaliadas, aumentando assim a disponibilidade de RNA para ser utilizado como controle positivo em estudos de diferenciação celular

O propósito do presente estudo foi avaliar o comportamento de células pulpares humanas expostas ao TGFβ1 e ao aFGF, em cultura, nas seguintes concentrações: TGFβ1 a 1ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL, TGFβ1 a 1ng/mL + aFGF a 5ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL e aFGF a 5ng/mL. Foi avaliada a morfologia celular, a atividade da fosfatase alcalina, através de ensaio com pNPP como substrato e a expressão das proteínas osteocalcina, sialoproteína óssea e sialofosfoproteína de dentina, através de RT-PCR. Após quatro dias, verificou-se que a média do número de nucléolos no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com aFGF a 5ng/mL. A média da atividade da fosfatase alcalina no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL. Foi observada a expressão de osteocalcina em todas as células pulpares humanas que proliferaram em cultura. Entretanto, no grupo em que foi utilizado o aFGF a 5ng/mL houve diminuição da expressão da osteocalcina. A exposição dos fatores não induziu a expressão de componentes da matriz de dentina tais como BSP e DSPP. Sugere-se que as células expostas ao TGFβ1 1ng/mL foram estimuladas, apresentando uma maior atividade celular e as células expostas ao aFGF 5ng/mL foram inibidas, apresentando uma menor atividade celular. / The aim of the present work was to evaluate the behavior of human dental pulp cells exposed to TGFβ1 and aFGF in culture, at the following concentrations: TGFβ1 1ng/mL, TGFβ1 5ng/mL, TGFβ1 1ng/mL + aFGF 5ng/mL, TGFβ1 5ng/mL + aFGF 5ng/mL e aFGF 5ng/mL. We assessed the cellular morphology, alkaline phosphatase activity, using pNPP as substrate, and expression of osteocalcin, bone sialoprotein, dentin sialophosphoprotein proteins by RT-PCR. After four days, the nucleolus media in the group treated with TGFβ1 1ng/mL was significantly higher than the group treated with aFGF 5ng/mL The alkaline phosphatase activity in the TGFβ1 1ng/mL treated group was significantly higher than the media observed in TGFβ1 5ng/mL + aFGF 5ng/m treated group. Osteocalcin expression was observed in all human dental pulp cell cultures. However, in the aFGF 5ng/mL treated group the osteocalcin expression decreased. The exposure to growth factors did not induced the expression of dentin matrix components such as BSP or DSPP. Our data suggest that the cells exposed to TGFβ1 1ng/mL were stimulated and had a higher cell activity, and that cells exposed to aFGF 5ng/mL were inhibited having a cell activity decrease.

O propósito do presente estudo foi avaliar o comportamento de células pulpares humanas expostas ao TGFβ1 e ao aFGF, em cultura, nas seguintes concentrações: TGFβ1 a 1ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL, TGFβ1 a 1ng/mL + aFGF a 5ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL e aFGF a 5ng/mL. Foi avaliada a morfologia celular, a atividade da fosfatase alcalina, através de ensaio com pNPP como substrato e a expressão das proteínas osteocalcina, sialoproteína óssea e sialofosfoproteína de dentina, através de RT-PCR. Após quatro dias, verificou-se que a média do número de nucléolos no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com aFGF a 5ng/mL. A média da atividade da fosfatase alcalina no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL. Foi observada a expressão de osteocalcina em todas as células pulpares humanas que proliferaram em cultura. Entretanto, no grupo em que foi utilizado o aFGF a 5ng/mL houve diminuição da expressão da osteocalcina. A exposição dos fatores não induziu a expressão de componentes da matriz de dentina tais como BSP e DSPP. Sugere-se que as células expostas ao TGFβ1 1ng/mL foram estimuladas, apresentando uma maior atividade celular e as células expostas ao aFGF 5ng/mL foram inibidas, apresentando uma menor atividade celular. / The aim of the present work was to evaluate the behavior of human dental pulp cells exposed to TGFβ1 and aFGF in culture, at the following concentrations: TGFβ1 1ng/mL, TGFβ1 5ng/mL, TGFβ1 1ng/mL + aFGF 5ng/mL, TGFβ1 5ng/mL + aFGF 5ng/mL e aFGF 5ng/mL. We assessed the cellular morphology, alkaline phosphatase activity, using pNPP as substrate, and expression of osteocalcin, bone sialoprotein, dentin sialophosphoprotein proteins by RT-PCR. After four days, the nucleolus media in the group treated with TGFβ1 1ng/mL was significantly higher than the group treated with aFGF 5ng/mL The alkaline phosphatase activity in the TGFβ1 1ng/mL treated group was significantly higher than the media observed in TGFβ1 5ng/mL + aFGF 5ng/m treated group. Osteocalcin expression was observed in all human dental pulp cell cultures. However, in the aFGF 5ng/mL treated group the osteocalcin expression decreased. The exposure to growth factors did not induced the expression of dentin matrix components such as BSP or DSPP. Our data suggest that the cells exposed to TGFβ1 1ng/mL were stimulated and had a higher cell activity, and that cells exposed to aFGF 5ng/mL were inhibited having a cell activity decrease.

O propósito do presente estudo foi avaliar o comportamento de células pulpares humanas expostas ao TGFβ1 e ao aFGF, em cultura, nas seguintes concentrações: TGFβ1 a 1ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL, TGFβ1 a 1ng/mL + aFGF a 5ng/mL, TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL e aFGF a 5ng/mL. Foi avaliada a morfologia celular, a atividade da fosfatase alcalina, através de ensaio com pNPP como substrato e a expressão das proteínas osteocalcina, sialoproteína óssea e sialofosfoproteína de dentina, através de RT-PCR. Após quatro dias, verificou-se que a média do número de nucléolos no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com aFGF a 5ng/mL. A média da atividade da fosfatase alcalina no grupo tratado com TGFβ1 a 1ng/mL foi significativamente maior que no grupo tratado com TGFβ1 a 5ng/mL + aFGF a 5ng/mL. Foi observada a expressão de osteocalcina em todas as células pulpares humanas que proliferaram em cultura. Entretanto, no grupo em que foi utilizado o aFGF a 5ng/mL houve diminuição da expressão da osteocalcina. A exposição dos fatores não induziu a expressão de componentes da matriz de dentina tais como BSP e DSPP. Sugere-se que as células expostas ao TGFβ1 1ng/mL foram estimuladas, apresentando uma maior atividade celular e as células expostas ao aFGF 5ng/mL foram inibidas, apresentando uma menor atividade celular. / The aim of the present work was to evaluate the behavior of human dental pulp cells exposed to TGFβ1 and aFGF in culture, at the following concentrations: TGFβ1 1ng/mL, TGFβ1 5ng/mL, TGFβ1 1ng/mL + aFGF 5ng/mL, TGFβ1 5ng/mL + aFGF 5ng/mL e aFGF 5ng/mL. We assessed the cellular morphology, alkaline phosphatase activity, using pNPP as substrate, and expression of osteocalcin, bone sialoprotein, dentin sialophosphoprotein proteins by RT-PCR. After four days, the nucleolus media in the group treated with TGFβ1 1ng/mL was significantly higher than the group treated with aFGF 5ng/mL The alkaline phosphatase activity in the TGFβ1 1ng/mL treated group was significantly higher than the media observed in TGFβ1 5ng/mL + aFGF 5ng/m treated group. Osteocalcin expression was observed in all human dental pulp cell cultures. However, in the aFGF 5ng/mL treated group the osteocalcin expression decreased. The exposure to growth factors did not induced the expression of dentin matrix components such as BSP or DSPP. Our data suggest that the cells exposed to TGFβ1 1ng/mL were stimulated and had a higher cell activity, and that cells exposed to aFGF 5ng/mL were inhibited having a cell activity decrease.