A icterícia neonatal é geralmente benigna, mas desfechos desfavoráveis podem ocorrer e a identificação dos casos de maior risco seria muito útil. Alguns fatores de risco já conhecidos são prematuridade, desidratação, aleitamento materno, deficiência de G6PD e incompatibilidade sanguínea. As alterações na conjugação hepática de bilirrubina devido a polimorfismos da UGT1A1 também podem contribuir para esse maior risco. O objetivo deste estudo foi estimar a freqüência da deficiência de G6PD e/ou das variantes polimórficas da UGT1A1 como fatores de risco para hiperbilirrubinemia grave em neonatos com mais de 35 semanas de idade gestacional e peso superior a 2000g em uma Unidade Neonatal do Sul do Brasil. Estudo prospectivo, observacional, de casos e controles, que incluiu 243 recémnascidos admitidos para fototerapia no HCPA e 247 controles, entre março e dezembro de 2007. Foi realizada dosagem da atividade da G6PD e análises genético-moleculares do respectivo gene. Foi também realizado PCR para a UGT1A1 com eletroforese capilar em analisador genético ABI 3130xl e análise no programa GeneMapper®. Foram detectados genótipos polimórficos da UGT1A1 em 16% dos pacientes, com prevalência nos ictéricos de 13,5% e nos normais de 18,2%, diferença não significativa. Identificada maior prevalência dos polimorfismos em negros e pardos (25%) em relação aos brancos (13%) (p=0,014). A prevalência da deficiência de G6PD foi 4,6%, sem mostrar correlação com a icterícia. Concluímos que nesta amostra de recém-nascidos do sul do Brasil nem as variantes da UGT1A1, nem a deficiência de G6PD foram associadas à hiperbilirrubinemia grave, com prevalências semelhantes às verificadas em outras populações. Considerando a grande miscigenação presente nessa região, outros fatores e interações gênicas devem ser procurados, incluindo possivelmente o estudo de outros polimorfismos, identificando fatores de risco para explicar a doença, um importante problema de saúde a merecer a atenção dos pesquisadores. / Neonatal jaundice is usually benign, but unfavorable outcomes may happen; therefore, the identification of high-risk cases would be very useful. Some risk factors already known are prematurity, dehydration, breastfeeding, G6PD deficiency and blood incompatibility. Alterations in the hepatic conjugation of bilirubin due to UGT1A1 polymorphisms may also contribute to this higher risk. The objective of this study was to estimate the frequency of G6PD deficiency and the promoter region of UGT1A1 gene variants as risk factors to severe hyperbilirubinemia in newborns of over 35 weeks of gestational age and weighing above 2,000g in a Neonatal Service in Southern Brazil. This is a prospective and observational study of cases and controls which included 243 newborns admitted for phototherapy at HCPA and 247 controls, between March and December, 2007. G6PD activity was determined and the deficient cases were investigated by genetic analysis. PCR for the UGT1A1 variants was also performed, followed by capillary electrophoresis in genetic analyzer ABI 3130xl and the analysis in GeneMapper® program. Polymorphic genotypes were detected in 16% of the patients, prevalence in icteric patients was 13,5% and in normal individuals was 18,2%, a difference which was not significant. A higher prevalence of polymorphisms in blacks and mulattos (25%) was identified when compared to whites (13%) (p=0,014). A prevalence of 4,6% of G6PD deficiency was found, without association to jaundice. We concluded that in this sample of newborns from the South of Brazil, polymorphic variants of UGT1A1 were not associated to severe hyperbilirubinemia as well as G6PD deficiency; being the prevalence similar to those found in other populations. Considering the high miscegenation that occurs in this area of Brazil, perhaps other factors and genic interactions should be sought in order to identify genetic risk factors, possibly including the study of further polymorphisms, as neonatal jaundice remains an important health problem to be approached by investigators.

A deficiência da desidrogenase de acilas de cadeia média (MCAD) é o mais freqüente erro inato da oxidação de ácidos graxos. Os indivíduos afetados por esse distúrbio apresentam-se sintomáticos durante períodos de descompensação metabólica, caracterizado pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia média (AGCM), particularmente os ácidos octanóico (AO), decanóico (AD) e cis-4-decenóico (AcD). Durante as crises, os pacientes apresentam hipoglicemia hipocetótica, hipotonia, rabdomiólise, edema cerebral e, finalmente, entram em coma, podendo ter um desenlace fatal. O tratamento de urgência é baseado na infusão de glicose nos pacientes durante as crises, enquanto uma dieta rica em carboidratos e pobre em gorduras é recomendada nos períodos fora das crises. Uma parte considerável dos pacientes que sobrevivem às crises apresenta um grau variável de manifestações neurológicas. Entretanto, os mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos da deficiência de MCAD são praticamente desconhecidos. No presente estudo avaliamos a influência dos principais metabólitos acumulados na deficiência de MCAD, os ácidos AO, AD e AcD, e , em alguns casos, também de seus derivados de carnitina e glicina, sobre as atividades de enzimas importantes do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos Wistar de 30 dias de vida. AO, AD, AcD e octanoilcarnitina inibiram a atividade da Na+, K+-ATPase, com ênfase ao AcD, o inibidor mais potente da atividade da enzima. Além disso, verificamos que a co-incubação do AO com glutationa (GSH) ou trolox (vitamina E solúvel) evitou seu efeito inibitório sobre a atividade da enzima. A inibição da enzima pelo AcD foi também prevenida quando o mesmo foi co-incubado com as enzimas catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) juntas, mas não com GSH. Além disso, AO, AD e AcD aumentaram a lipoperoxidação em homogeneizados de córtex cerebral de ratos, medidos por quimioluminescência e TBA-RS. Tais resultados sugerem que esses metabólitos inibiram a atividade da Na+, K+-ATPase via radicais livres. Observamos ainda que somente AD e AcD inibiram atividades dos complexos da cadeia respiratória, ao contrário do AO que não teve qualquer ação sobre essas atividades. Enquanto o AD diminuiu somente a atividade do complexo IV a uma concentração muito alta (3 mM), o AcD diminuiu as atividades dos complexos II, II-III e IV dentro da faixa de concentrações encontrada na deficiência de MCAD (0,25-0,5 mM). Além disso, AO, AD e AcD inibiram a produção de CO2 a aprtir de glicose e acetato radiativos como substratos, indicando uma inibição do ciclo de Krebs. No entanto, somente AD e AcD reduziram a produção de CO2 a partir de citrato, enquanto AO não alterou a mesma. Além disso, nenhum dos três metabólitos testados alterou a atividade da citrato sintase. Demonstramos ainda que o AcD reduziu as atividades da creatinaquinase mitocondrial e citosólica, mas em uma concentração muito alta não encontrada na deficiência de MCAD. Este efeito não foi evitado por GSH, vitamina C+E ou L-NAME, sugerindo que o mesmo deve ter ocorrido via mecanismo distinto do estresse oxidativo. AcD foi o inibidor mais potente das atividades enzimáticas testadas neste trabalho, indicando que deve ser o metabólito de maior toxicidade nesta doença, ao menos no que se refere ao comprometimento do metabolismo energético. Espera-se que nossos resultados possam contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos envolvidos na deficiência de MCAD.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde. / Ethylmalonic acid (EMA) accumulates in tissues and biological fluids of patients affected by short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (SCADD) and ethylmalonic encephalopathy, illnesses characterized by neurological and muscular symptoms. Considering that the mechanisms responsible for the brain and skeletal muscle damage in these diseases are poorly known, in the present work we investigated the effects of acute EMA administration on oxidative stress parameters in cerebral cortex and skeletal muscle from 30-day-old rats. Animals received three subcutaneous injections of EMA (6 mol/g; 90 min interval between injections) and were killed 1 h after the last injection. Control animals received saline in the same volumes. EMA administration significantly increased thiobarbituric acid-reactive substances levels in cerebral cortex and skeletal muscle, indicating an increased lipid peroxidation. In addition, carbonyl content was increased in EMA-treated animal skeletal muscle when compared to the saline group. EMA administration also significantly increased DCFH oxidation and superoxide production (reactive species markers), and decreased glutathione peroxidase activity in cerebral cortex, while glutathione levels were decreased in skeletal muscle. The present results show that acute EMA administration elicits oxidative stress in rat brain and skeletal muscle, suggesting that oxidative damage may be involved in the pathophysiology of the brain and muscle symptoms found in patients affected by SCADD and ethylmalonic encephalopathy. / O ácido etilmalônico (EMA) se acumula em tecidos e fluidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da desidrogenase de acil-coenzima A de cadeia curta (SCADD) e pela encefalopatia etilmalônica (EE). Ambas as doenças caracterizam-se por sintomas neurológicos e musculares. O presente trabalho investigou os efeitos da administração aguda de EMA sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral e músculo esquelético de ratos de 30 dias de vida. Os animais receberam três injeções subcutâneas de EMA (6 μmol/g; 90 minutos de intervalo entre as injeções) e foram eutanasiados 1 hora após a última injeção. Os animais do grupo controle receberam solução salina nos mesmos volumes. A administração de EMA aumentou significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo de grupamentos carbonila em córtex cerebral e músculo esquelético, quando comparados ao grupo controle. A administração aguda de EMA também aumentou significativamente a oxidação de 2’,7’-diclorofluoresceína reduzida e a geração de ânion superóxido. Por outro lado, a atividade da enzima glutationa peroxidase em córtex cerebral foi inibida pela administração de EMA, em comparação ao grupo controle. Adicionalmente, os níveis de glutationa reduzidas encontraram-se diminuídos no músculo esquelético dos animais que receberam a administração aguda de EMA. Os resultados do presente estudo mostram que a administração aguda de EMA induz estresse oxidativo em córtex cerebral e músculo esquelético de ratos jovens, sugerindo que o dano oxidativo possa estar envolvido na fisiopatologia dos danos neurológicos e musculares encontradas em pacientes afetados por SCADD e EE.

Dissertação de Mestrado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD) é o mais comum defeito da oxidação de ácidos graxos. Esta doença é caracterizada bioquimicamente por níveis elevados de ácido octanoico (AO) em tecidos e fluidos corporais de pacientes acometidos por essa deficiência. Os principais sintomas incluem letargia, vômitos, hipoglicemia e paralisia cortical, podendo evoluir para coma e morte. Considerando-se que a fisiopatologia do dano cerebral apresentado por pacientes acometidos pela MCADD não está bem estabelecida, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade de enzimas mitocondriais em estruturas cerebrais de ratos submetidos à administração intracerebroventricular de AO. Ratos Wistar machos com 60 dias de vida foram divididos em dois grupos experimentais: grupo AO, cujos animais receberam uma administração intracerebroventricular de AO (1,66 μmol), e grupo controle, cujos animais receberam administração intracerebroventricular de líquido cefalorraquidiano artificial no mesmo volume. Uma hora após a administração, os animais sofreram eutanásia por decapitação e o córtex cerebral, o hipocampo, o estriado e o cerebelo foram retirados e limpos. Estas estruturas foram utilizadas para avaliar as atividades dos complexos I-IV da cadeia respiratória, bem como das enzimas creatina cinase (CK), citrato sintase (CS), succinato desidrogenase (SDH) e malato desidrogenase (MDH). Observou-se uma diminuição da atividade do complexo I da cadeia respiratória em estriado e hipocampo de ratos que receberam AO. Além disso, as atividades dos complexos II e II-III foram inibidas pela administração de AO em todas as estruturas cerebrais estudadas, enquanto que a atividade do complexo IV foi inibida em córtex cerebral, corpo estriado e cerebelo. Em adição, a atividade da SDH foi diminuída em córtex cerebral, estriado e cerebelo de animais do grupo AO. Por outro lado, a atividade da MDH encountrou-se aumentada apenas em córtex cerebral, ao passo que a atividade da CS foi aumentada no hipocampo destes animais em comparação ao grupo controle. Adicionalmente, a atividade da CK foi aumentada no córtex cerebral, mas se encontrou inibida em hipocampo e cerebelo. Estes resultados sugerem que a administração de AO induz disfunção mitocondrial em cérebro de ratos, o que poderia estar implicada na fisipatologia dos danos cerebrais encontrados em pacientes afetados pela MCADD.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD) é o mais frequente defeito da oxidação mitocondrial de ácidos graxos de cadeia média, caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual predominante do ácido graxo octanoico (AO) e seus metabólitos secundários. Os pacientes afetados apresentam disfunção neurológica, hipoglicemia hipocetótica, rabdomiólise, hepatomegalia, hiperamonemia, letargia e convulsões, podendo rapidamente evoluir para o coma e morte. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos dos danos neurológicos apresentados pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão bem esclarecidos. Assim, o propósito do presente estudo foi avaliar o efeito da administração intracerebroventricular (ICV) de AO sobre os testes comportamentais, sistema colinérgico, níveis de neurotrofinas e estado redox celular em cérebro de ratos. Ratos Wistar machos com 60 dias de vida foram divididos em dois grupos experimentais: grupo AO, cujos animais receberam uma administração ICV de AO (1,66 μmol/2 μL), e grupo controle, cujos animais receberam administração ICV de líquido cefalorraquidiano artificial (2 μL). Uma hora após a administração, os animais foram submetidos às tarefas comportamentais (esquiva inibitória simples, esquiva inibitória de treinos contínuos, habituação ao campo aberto, reconhecimento de objetos). Imediatamente após, foram submetidos a eutanásia por decapitação e o córtex cerebral, o hipocampo, o estriado foram isolados e utilizadas para avaliação da atividade das enzimas importantes para o sistema colinérgico, níveis de neurotrofinas e estado redox celular. Os resultados demonstraram que a administração aguda de AO ICV em ratos adultos induziu um déficit cognitivo. Ainda nesse contexto, observou-se uma diminuição dos níveis de neurotrofinas, onde o fator de crescimento neuronal (NGF) mostrou-se reduzidos em hipocampo e estriado após a administração aguda ICV de AO, nesse sentido os níveis do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) mostrou-se diminuído no estriado. Por outro lado a expressão de mRNA das proteínas NGF e BDNF não apresentou nenhuma alteração. Os resultados ainda demonstraram que a exposição aguda ao AO provoca um aumento da carbonilação de proteínas em córtex cerebral, hipocampo de ratos adultos, bem como uma peroxidação lipídica aumentada, onde os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) encontram-se elevados em córtex cerebral, estriado. Investigamos ainda as atividades antioxidantes,onde a atividade da enzima catalase (CAT) foi aumentada no córtex cerebral e no hipocampo, no entando a atividade da superóxido dismutase (SOD) não apresentou diferença significativa entre os grupos estudados. Esses resultados sugerem que o AO causa um desequilíbrio nos níveis de neurotrofinas, culminando em alterações cognitivas importantes. Além disso, sugerimos que o estresse oxidativo está diretamente ligado ao comprometimendo do SNC e pode ser considerado um importante mecanismo fisiopatológico subjacente ao dano cerebral observado na deficiência de MCAD.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-01-26Bitstream added on 2014-06-13T19:09:09Z : No. of bitstreams: 1 costa_bo_me_jabo.pdf: 5899495 bytes, checksum: c015de9c632910013a84b4f478dbde40 (MD5) / O conhecimento da atividade das enzimas hidrolíticas é essencial para compreender as transformações dos nutrientes no solo. O milho é uma das principais culturas sob o ponto de vista econômico. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do crescimento dos fungos em dois tipos de solos, na presença e ausência de glicose, no desenvolvimento das plântulas de milho, no padrão isoenzimático dos coleóptilos, nos teores de carboidratos totais residuais, nas atividades da desidrogenase e amilase. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado com esquema fatorial. A adição de glicose no meio de cultura aumentou a velocidade de crescimento de A. flavus e Penicillium sp., mas não de F. verticillioides. Na presença de glicose, a produção de esporos aumentou de 1,2 (F. verticillioides) e 8,2 vezes (A. flavus), e reduzido de 3,5 vezes com Penicillium sp. A redução dos teores de carboidratos totais ajustou-se significativamente às equações de 1º e 2º grau. A.flavus e Penicillium sp., apresentaram maior consumo de carboidratos totais que o solo sem inoculação ou inoculado com F. verticillioides. A adição de glicose no solo favoreceu o consumo de carboidratos residuais, provavelmente devido ao estímulo do crescimento dos fungos. Exceto com F. verticillioides, a atividade da desidrogenase aumentou em média de 1,5 a 1,8 vez (p<0,05) nos solos com glicose em relação aos solos sem glicose. À atividade da amilase, aumentou 1,3 a 1,5 vez por efeito da adição de glicose no solo. Maior atividade da amilase foi observada no solo Latossolo Vermelho distrófico (LVd) com glicose e inoculado com A.flavus e Penicillium sp. em relação ao controle. As dimensões das plântulas como altura dos coleóptilos, comprimento das raízes e massa seca das plântulas de milho dos solos adicionados de glicose e/ou inoculados com os fungos foram diminuídas. A expressão genética... / The knowledge about hydrolytic enzymes activity is essential to understand the nutrients transformations in soil. Corn is one of the main crops from the economic view in the whole world. The objective of this study was evaluate the fungi growth in two soil types, in the presence and absence of glucose, coleoptiles development, roots and weight of corn seedlings, coleoptiles isoenzyme pattern, content of total residual carbohydrates, enzymes dehydrogenase and amylase activity. Was used a completely randomized design with factorial arrangement. The glucose addition in culture medium increased the growth rate of A. flavus and Penicillium sp., but not F. verticillioides. In the presence of glucose, the spores number was increased from 1.2 (F. verticillioides) and 8.2 times (A. flavus), but was reduced 3.5 times with Penicillium sp. Reducing the levels of total carbohydrates, significantly adjusted to the equations of 1st and 2nd grade. A.flavus and Penicillium sp., showed higher carbohydrates consumption that the soil control or inoculated with F. verticillioides. The glucose addition in soil, favored the use of residual carbohydrates, probably due fungi growth stimulation. Except F. verticillioides, dehydrogenase activity increased in the range 1.5 to 1.8 times (p<0.05) in soils with glucose compared to glucose free soil. Amylase activity increased 1.3 to 1.5 times by glucose addition effect in soil. Increased amylase activity was observed in the Distrophic Red Latosol (DRL) with glucose and inoculated with A.flavus and Penicillium sp., compared to control. The seedlings dimensions as coleoptiles height, root length and dry weight of maize seedlings of the soils added with glucose and inoculated with fungi were decreased. Gene expression of maize seed was changed due probable by fungi inoculated infection in soil. The coleoptiles isoenzymes pattern was amended as early as 5 incubation... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-10-10T13:21:42Z No. of bitstreams: 1 TeseAM.pdf: 7680112 bytes, checksum: c8ecf6ee83f4312fa3be9569904c7b2f (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T19:45:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseAM.pdf: 7680112 bytes, checksum: c8ecf6ee83f4312fa3be9569904c7b2f (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T19:45:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseAM.pdf: 7680112 bytes, checksum: c8ecf6ee83f4312fa3be9569904c7b2f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T19:45:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseAM.pdf: 7680112 bytes, checksum: c8ecf6ee83f4312fa3be9569904c7b2f (MD5) Previous issue date: 2016-07-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / This study presents the development of a biosensor using a microcantilever stem and its detecting response through dynamic mode of atomic force microscopy (AFM). Responses of different methods for immobilization of alcohol dehydrogenase enzyme were investigated in order to accomplish a selective detection of ethanol, methanol and isopropanol, using as arrays: self-assembly monolayer (SAM) and others arrangements formed on Si and Si3N4 microcantilevers surface. In addition, we aimed to evaluate the influence of the biological element immobilization process in the analytical performance of the biosensor. The process to development of a biosensor began with the activation of its surface by means of thiols and silanes with different carbon length chains, however with the same amine terminal groups (NH2). The microcantilevers activation is only possible with the oxidation of its surface and to check this process, the "High-resolution Xray Photoelectron Spectroscopy (XPS)" technique was used. Activation of the surface was obtained using different methods for coating of microcantilevers made only with Si (100) and Si3N4. Subsequently to the oxidation process, the binding of the biomolecule to the surface activated was performed using the bifunctional agent glutaraldehyde. Microcantilevers with both sides coated by biomolecules were investigated and a tension effect of surface was observed at a 0,3 mL/L of the target analyte. By analyzing the performance of the biosensor for the determination of the target analyte, it was realized that APTES activation methodology for biosensors steam and self-assembled monolayers were the most suitable techniques for immobilizing the recognition biomolecule. With this preparation, the biosensor it showed less susceptible to humidity and the temperature variations, presenting a high quality factor, a faster response time, selectivity, sensitivity and durability. / Este trabalho apresenta o desenvolvimento de um biossensor, utilizando a haste de microcantilever e a detecção de sua resposta por intermédio do modo dinâmico da microscopia de força atômica (AFM). Foram investigadas as respostas de diferentes métodos para imobilização da enzima Álcool Desidrogenase, a fim de realizar a detecção seletiva de etanol, metanol e isopropanol, empregando como matrizes monocamadas auto-organizadas (SAM – Self Assembed Monolayer) e outros arranjos formados sobre a superfície de microcantilevers de Si e Si3N4. Além disso, objetivou-se a avaliação da influência do processo de imobilização do elemento biológico no desempenho analítico do biossensor. O processo de desenvolvimento do biossensor iniciou-se com a ativação de sua superfície por meio de deposição de tióis e silanos com diferentes comprimentos de cadeias carbônicas, mas com os mesmos grupos terminais amina (NH2). A ativação de microcantilevers somente é possível com a oxidação de sua superfície e para verificação desse processo foi empregada a técnica “High-resolution Xray Photoelectron Spectroscopy (XPS)”. A ativação da superfície foi obtida utilizando metodologias diferentes para o recobrimento dos microcantilevers construídos somente com Si (100) e Si3N4. Posteriormente ao processo de oxidação, segue-se a ligação da biomolécula à superfície ativada pela utilização do agente bifuncional Glutaraldeído. Foram investigados microcantilevers em que ambos os lados foram revestidos com as biomoléculas e, foi constatado o efeito da tensão superficial a partir de 0,3 mL/L do analito alvo. Ao analisar o desempenho do biossensor para a determinação do analito alvo, verificou-se que nos biossensores a metodologia de ativação por vapor de (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e com montagem em monocamadas auto-organizada foi a mais adequada para a imobilização da biomolécula de reconhecimento, com esta preparação o biossensor foi menos susceptível a umidade relativa e variações de temperatura apresentando elevado fator de qualidade, menor período de tempo de resposta, seletividade, durabilidade e sensibilidade.

Submitted by DANIELLY PEREIRA GARCIA null (daniellypgarcia@gmail.com) on 2016-05-31T13:02:05Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado Danielly P. Garcia.pdf: 1928934 bytes, checksum: 40dac212e7d7b6c4fb6e39b2972fc94f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-05-31T19:29:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 garcia_dp_me_sjrp.pdf: 1928934 bytes, checksum: 40dac212e7d7b6c4fb6e39b2972fc94f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-31T19:29:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 garcia_dp_me_sjrp.pdf: 1928934 bytes, checksum: 40dac212e7d7b6c4fb6e39b2972fc94f (MD5) Previous issue date: 2016-03-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Dentre os efeitos negativos da exposição a poluentes nos animais aquáticos podemos destacar o estresse oxidativo, uma produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio, consequentemente, uma cascata de eventos bioquímicos denominados peroxidação lipídica (PL) ocorrem tendo como principal produto o malondialdeído (MDA). Assim, ainda que o aumento dos níveis de MDA esteja relacionado a intoxicação por poluentes, alguns trabalhos têm mostrado uma diminuição do MDA frente a essa exposição, mesmo com alterações em enzimas antioxidantes. Deste modo, este trabalho teve por objetivo avaliar se possíveis decréscimos nos níveis de MDA em peixes Astyanax altiparanae expostos a contaminantes ambientais pode ter relação com aumentos na atividade de defesas antioxidantes, aumentos na atividade da ALDH ou excreção do MDA na água. Assim, os lambaris foram expostos a misturas de metais (cádmio e cobre) nas concentrações 40 e 100 μg/L e a biodiesel B5 nas concentrações de 0,001, 0,01 e 0,1 mL/L para verificar a relação entre MDA e as enzimas antioxidantes, em amostras de brânquia e fígado. Um segundo experimento, injetando MDA nos espécimes foi realizado, nestes organismos, foram injetados intraperitonealmente doses de 10 mg/kg e 100 mg/kg de MDA com coleta do material biológico após 5 dias para avaliar o efeito do MDA no fígado e na brânquia do lambari. Um terceiro experimento foi realizado para avaliar a metabolização do MDA em brânquia e fígado e sangue com coleta de material biológico e água nos tempos zero (logo após receber a dose), 1 e 12 horas. Nestes experimentos a metabolização do MDA foi observada pela atividade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH) e as enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glicose – 6- fosfato- desidrogenase (G6PDH) e a de biotransformação glutationa S-transferase (GST), peróxidos lipídicos (FOX), níveis de glutationa total (GSH-t) e ensaio do MDA. Por fim foi realizado um experimento in vitro para avaliar o efeito do MDA nas enzimas (CAT, GPx, G6PDH, GST e ALDH). Nossos resultados mostraram que o MDA tem vias de metabolização e que o aumento das enzimas antioxidantes não é responsável por sua diminuição. Sugerimos que o B5 foi capaz de induzir a atividade da ALDH e esta diminuiu a quantidade de MDA nos dois grupos de maior concentração de B5. O MDA não foi capaz de induzir a atividade da ALDH, entretanto observamos uma forte correlação entre o MDA e a ALDH. O experimento in vitro mostrou que em concentrações elevadas o MDA pode até mesmo inibir a atividade da ALDH, sugerindo que esta enzima atue na manutenção dos níveis basais deste aldeído. Por fim, o trabalho mostrou que o lambari foi capaz de eliminar o MDA em excesso por meio da excreção, fortalecendo nossa hipótese de que o organismo dos peixes utiliza vias de excreção e da ALDH para eliminar o excesso deste aldeído toxico produzido na PL por estressores ambientais / Among the adverse effects of exposure to pollutants in aquatic animals, we can highlight oxidative stress, which can be caused due to an exacerbated production of reactive oxygen species along with a cascade of biochemical events. During this cascade, one of oxidative consequences we can observe is called lipid peroxidation (LPO) with its main product malondialdehyde (MDA). Thus, although the increase in MDA levels is related to intoxication by pollutants, some studies have shown a decrease in MDA levels in aquatic organisms exposed to pollutants, even with significant improvment in antioxidant enzymes. Thus, this study aimed to assess the relationship among the reduced MDA levels in Astyanax altiparanae fish exposed to environmental contaminants, and increased antioxidant defenses and aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, or excretion of MDA in the water. In this way, the fishes were exposed to mixtures of metals (cadmium or copper) at concentrations of 40 g/L and 100 g/L and to B5 biodiesel in concentrations of 0.001 mL/L, 0.01 mL/L and 0.1 mL/L in order to verify the relation between MDA and antioxidant enzymes in the liver, and gill samples. We performed a second experiment by injecting MDA in the fish specimens. We intraperitoneally injected doses of 10 mg/kg and 100 mg/kg of MDA. After 5 days, we collected the liver and gill in order to evaluate the effect of MDA in the fishes. A third experiment was conducted to investigate MDA metabolization in blood, gill and liver samples, through collection of biological material and water at zero time (shortly after receiving the same intraperitoneal injections as in the second experiment), 1 and 12 hours after the injections. In these experiments, the MDA metabolization was monitored by the activity of ALDH and by the antioxidant enzymes such as catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and glutathione-S-transferase biotransformation (GST), lipid peroxides by ferrous ion oxidation xylenol orange (FOX) assay, the total glutathione (GSH-t) and MDA assay. Finally, an experiment was conducted in vitro to evaluate the effect of enzymes on MDA (CAT, GPx, G6PDH, GST and ALDH). Our results showed that the MDA levels have metabolizing pathways and increased antioxidant enzymes are not responsible for their decrease. We suggest that the B5 was able to induce the ALDH activity, Moreover, ALDH was related to reduced amount of MDA in both groups of higher B5 concentration. The MDA was not able to induce the activity of ALDH, despite we found a strong correlation between the MDA levels and ALDH activity. In the in vitro experiment, we observed that high concentrations of MDA could even inhibit the activity of ALDH, suggesting that this enzyme acts in the maintenance of basal levels of this aldehyde. Finally, the study showed that the Astyanax altiparanae have been able to eliminate the MDA excess by excretion. This fact reinforces our hypothesis that the fish uses excretion routes and ALDH to eliminate excess of this toxic aldehyde produced during LPO cased by stressors environmental.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA11MA068.pdf: 13593 bytes, checksum: bb2118cc19310d22381d61f71c63aee7 (MD5) Previous issue date: 2011-06-01 / The mitochondrial enzyme Glutamate Dehydrogenase (GDH: EC 1.4.1.2) catalyzes the reversible deamination of the L-glutamate for 2-oxoglutarate (&#945;-ketoglutarate) using NAD+ and NADP+ as coenzymes. It is a complex allosteric enzyme that consists of six identical subunits being its activity influenced by both, the ADP its positive modulator, and by the GTP, its negative modulator.It is one of the most important liver enzymes found in hepatocytes of cattle, sheep and goats. Infections by Fasciola spp or severe acute intoxication by toxins of plants such as Xanthium spp and Senecio spp as well as intoxication by copper result in the release of this enzyme in blood. The increase of the GDH indicates damage or hepatic necrosis in cattle and sheep. This is an enzyme of choice to evaluate the function of the ruminants. In the present study the cDNA, that codifies the GDH enzyme of the hepatocyte of sheep, was synthesized by means of the RT-PCR making use of mRNA extracted from the liver of sheep. Part of the region where the cDNA of the GDH of the ovine is codified was amplified by PCR from primers synthesized through the comparison of the aligned sequences of Ovis aries with those of the Bos taurus,. Homo sapiens, Rattus norvegicus and Mus musculus available in the database, where highly conserved regions, as well as variable regions were identified.The cDNA was cloned in the vector pGEM®-T Easy Vector Systems and inserted in competent cells of the Escherichia coli DH10B by means heat shock. The plasmid DNA was purified and after sequencing, the presence of an insert of 1292 pb was confirmed. The alignment of the sequence deduced of amino acid with other species revealed high homology among the GDH / A enzima mitocondrial Glutamato Desidrogenase (GDH : EC 1.4.1.2) catalisa a desaminação reversível do L- glutamato para 2-oxoglutarato (&#945;-cetoglutarato) usando o NAD+ e NADP+ como coenzimas . É uma enzima alostérica complexa que consiste em seis subunidades idênticas sendo sua atividade influenciada tanto pelo ADP, seu modelador positivo, como pelo GTP, seu modelador negativo. É uma das mais importantes enzimas hepáticas encontradas em hepatócitos de bovinos, ovinos e caprinos. Infecções por Fasciola spp ou intoxicação grave aguda por toxinas de plantas tais como Xanthium spp e Senecio spp e intoxicação por cobre resultam na liberação dessa enzima no sangue. O aumento da GDH indica danos ou necrose hepática em bovinos e ovinos. Esta é a enzima de escolha para avaliar a função hepática dos ruminantes. No presente trabalho o cDNA que codifica a enzima GDH do hepatócito de ovino foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando mRNA extraído do fígado de ovino. Parte da região de codificação do cDNA da GDH de ovino foi amplificada por PCR a partir de oligonucleotídeos iniciadores sintetizados através da comparação das sequências alinhadas de Ovis aries com de Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus e Mus musculus disponíveis em banco de dados, onde foram identificadas regiões bastante conservadas e regiões variáveis. O cDNA foi clonado no vetor pGEM® -T Easy Vector Systems e inserido em células competentes de Escherichia coli DH10B através de choque térmico. O DNA plasmidial foi purificado e após o sequenciamento a presença de um inserto de 1292 pb foi confirmado. O alinhamento da sequência deduzida de aminoácidos com outras espécies revelou alta homologia entre as GDH

Estudamos a homeostase energética no cérebro (córtex cerebral, estriado e hipocampo) e tecidos periféricos (coração e músculo esquelético) de camundongos selvagens (WT) e nocaute para a enzima glutaril-CoA desidrogenase (Gcdh-/-), modelo animal genético para estudo da acidemia glutárica tipo I (AG I), com 15 e 30 dias de vida. Esses animais também foram submetidos a uma sobrecarga de lisina através de uma injeção intraperitoneal (8 μmol/g) desse aminoácido ou de uma dieta rica em lisina (4,7 %) por 60 horas. Os parâmetros da homeostase energética analisados foram as atividades dos complexos I-III, II, II-III e IV da cadeia respiratória, das enzimas do ciclo do ácido cítrico (CAC) citrato sintase (CS), aconitase, isocitrato desidrogenase (IDH), α- cetoglutarato desidrogenase, sucinato desidrogenase e malato desidrogenase, da creatina quinase (CK) e da Na+, K+ - ATPase, bem como a liberação de lactato, os parâmetros respiratórios mitocondriais estados 3 e 4, razão de controle respiratório e o estado desacoplado, além do potencial de membrana mitocondrial na presença ou ausência de Ca2+. Estudos histológicos também foram conduzidos no córtex cerebral e estriado dos camundongos WT e Gcdh-/- de 30, 60 e 90 dias de vida submetidos por um pequeno (60 horas) ou longo (30 dias) período com dieta com alta concentração de lisina (4,7 %). Verificamos leves alterações nas atividades dos complexos da cadeia respiratória no cérebro, coração e músculo esquelético dos animais Gcdh-/- quando comparados aos WT com 15 e 30 dias de vida. Além disso, demonstramos uma diminuição significativa das atividades da CS e IDH em preparações mitocondriais de estriado de camundongos Gcdh-/- submetidos a uma sobrecarga de lisina associada a um pequeno aumento na liberação de lactato. No entanto, não encontramos alterações nos parâmetros respiratórios e no potencial de membrana em mitocôndrias de estriado dos camundongos Gcdh-/-quando comparados aos WT. Por outro lado, as atividades da Na+, K+-ATPase (cérebro) e CK (cérebro e músculo esquelético) foram significativamente menores em camundongos Gcdh-/- com 15 dias de vida quando submetidos a uma injeção intraperitoneal de lisina. Além disso, encontramos uma redução na atividade da Na+, K+-ATPase associada com uma diminuição da sua expressão em córtex cerebral, mas não em estriado e hipocampo, de camundongos Gcdh-/- com 30 dias de vida submetidos ou não a uma dieta rica em lisina. Finalmente, a análise histológica revelou a presença de vacúolos no córtex cerebral dos camundongos Gcdh-/- com 60 e 90 dias de vida, bem como no estriado dos animais Gcdh-/- com 90 dias de vida que foram alimentados com uma dieta rica em lisina por 30 dias. Concluindo, presumimos que uma redução das atividades da Na+, K+-ATPase e CK possa contribuir para o dano neurológico encontrado nos camundongos Gcdh-/- e possivelmente nos pacientes com AG I. / We studied energy homeostasis in the brain (cerebral cortex, striatum and hippocampus) and peripheral tissues (heart and skeletal muscle) from 15 and 30- day-old wild type (WT) and glutaryl-CoA dehydrogenase deficient (Gcdh-/-) mice, which is a genetic animal model to study glutaric academia type I (GA I). These animals were also submitted to lysine overload through an intraperitoneal injection (8 μmol/g) of this amino acid or supplementing the mice with a high lysine (4.7 %) diet for 60 hours. The energy homeostasis parameters evaluated were the activities of the respiratory chain complexes I-III, II, II-III and IV, of the citric acid cycle (CAC) enzymes citrate synthase (CS), aconitase, isocitrate dehydrogenase (IDH), α-ketoglutarate dehydrogenase, succinate dehydrogenase and malate dehydrogenase, creatine kinase (CK) and Na+, K+ - ATPase, as well as the lactate release, the mitochondrial respiratory parameters states 3 and 4, respiratory control ratio and uncoupled state, besides the mitochondrial membrane potential in the presence or absence of Ca2+. Histological studies were also conducted in the cerebral cortex and striatum from 30, 60 and 90-day-old WT and Gcdh-/- mice submitted for a short (60 hours) or long (30 days) period to a high lysine (4.7 %) diet. We verified mild alterations in the respiratory chain activity in the brain, heart and skeletal muscle from Gcdh-/- animals when compared to 15 and 30-day-old WT mice. Furthermore, we demonstrated a reduction in the activities of CS and IDH in striatum mitochondrial preparations from Gcdh-/- mice submitted to a lysine overload associated with a mild increase of lactate release. However, we did not find alterations in the respiratory parameters and membrane potential in striatum mitochondria from Gcdh-/- mice when compared to WT. On the other hand, the activities of Na+, K+-ATPase (brain) and CK (brain and skeletal muscle) were significantly reduced in 15-day-old Gcdh-/- mice when received an intraperitoneal injection of lysine. Moreover, a reduction in the Na+, K+-ATPase activity associated with a diminution of its expression was observed in the cerebral cortex, but not in striatum and hippocampus, from 30-day-old Gcdh-/- mice submitted or not to a high lysine diet. Finally, the histological analyses revealed the presence of vacuoles in the cerebral cortex from 60 and 90-day-old Gcdh-/- mice, as well as in the striatum from 90-day-old Gcdh-/- animals that were fed a high Lys chow for 30 days. In conclusion, we presume that a reduction in the activities of Na+, K+- ATPase and CK may contribute to the brain damage found in Gcdh-/- mice and possibly in GA I patients.