In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Valproinsäure (VPA) auf Keimzelltumoren des Hodens in vivo und in vitro untersucht. Keimzelltumoren des Hodens (TGCT) sind die häufigsten soliden malignen Tumoren des Mannes zwischen dem 15. und 34. Lebensjahr. Nach therapeutischen und histogenetischen Kriterien werden die TGCT in Seminome und Nicht-Seminome unterteilt. VPA gilt seit 2001 als weiterer Wirkstoff der Gruppe der Histondeacetylaseinhibitoren die über die Wirkung auf die Chromatinstruktur und epi-gentische Modifikation unterschiedliche Effekte in den Zellen erzielen können. VPA führt in unterschiedlichen malignen Tumoren zu einer Proliferationshemmung, Apoptoseinduktion und kann den Differenzierungsgrad in Tumorzellen beeinflussen. Im In-vivo-Mausmodell konnte gezeigt werden, dass VPA eine antitumoröse Potenz auch auf TGCT besitzt. Es zeigte sich in vitro eine Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion sowie eine Differen-zierungsinduktion unter VPA-Behandlung. Konkordant zu anderen Tumor konnte eine verstärkte Histonacetylierung unter VPA gezeigt werden. In einer Mikroarray-expressionsanalyse zeigten sich für die Zelllinie TCam-2 als Modell eines seminomatösen Keimzelltumors eine differentielle Expression von 1810 Genen unter VPA-Behandlung und eine differentielle Expression von 1061 Genen für die Zelllinie NTERA-2 als Modell eines embryonalen Karzinoms (Nicht-Seminom). Hierunter fanden sich eine Reihe von differentiell exprimierten Kandidatengenen, deren Regulation Einfluss auf die o.g. Proliferations-hemmung und Apoptoseinduktion haben können. In beiden Zelllinien wurde das Stammzell-genmuster durch Behandlung mit VPA verändert und vermehrt Differenzierungsmarker exprimiert. Insbesondere supprimierte VPA die Expression von NANOG, OCT3/4 in beiden Zelllinien und in der Nicht-seminomatösen Zelllinie NTERA-2 zusätzlich SOX2 als Schlüsselgene zur Erhaltung der Pluripotenz. Beides konnte mittels Mikroarray und q-RT-PCR gezeigt werden.

Embryonic stem (ES) cells offer a valuable source for generating insulin-producing cells. However, current differentiation protocols often result in heterogeneous cell populations of various developmental stages. Here we show the activin A-induced differentiation of mouse ES cells carrying a homologous dsRed-IRES-puromycin knock-in within the Sox17 locus into the endoderm lineage. Sox17-expressing cells were selected by fluorescence-assisted cell sorting (FACS) and characterized at the transcript and protein level. Treatment of ES cells with high concentrations of activin A for 10 days resulted in up to 19% Sox17-positive cells selected by FACS. Isolated Sox17-positive cells were characterized by defini- tive endoderm-specific Sox17/Cxcr4/Foxa2 transcripts, but lacked pluripotency-associated Oct4 mRNA and protein. The Sox17-expressing cells showed downregulation of extraembryonic endoderm (Sox7, Afp, Sdf1)-, mesoderm (Foxf1, Meox1)- and ectoderm (Pax6, NeuroD6)-specific transcripts. The presence of Hnf4α, Hes1 and Pdx1 mRNA demonstrated the expression of primitive gut/foregut cell-specific markers. Ngn3, Nkx6.1 and Nkx2.2 transcripts in Sox17-positive cells were determined as properties of pancreatic endocrine progenitors. Immunocytochemistry of activin A-induced Sox17-positive embryoid bodies revealed coexpression of Cxcr4 and Foxa2. Moreover, the histochemical demonstration of E-cadherin-, Cxcr4-, Sox9-, Hnf1β- and Ngn3-positive epithelial-like structures underlined the potential of Sox17-positive cells to further differentiate into the pancreatic lineage. By reducing the heterogeneity of the ES cell progeny, Sox17-expressing cells are a suitable model to evaluate the effects of growth and differentiation factors and of culture conditions to delineate the differentiation process for the generation of pancreatic cells in vitro. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

We isolated and expanded stem cells from dental pulp from extracted third molars using an innovative culture method consisting of low serum-containing medium supplemented with epidermal growth factor and platelet-derived growth factor BB. We evaluated the differentiation potential of these cells when they were growing either adherently or as micromass/spheroid cultures in various media. Undifferentiated and differentiated cells were analyzed by flow cytometry, immunocytochemistry and immunoblotting. The flow cytometry results showed that the dental pulp stem cells (DPSCs) were positive for mesenchymal stromal cell markers, but negative for hematopoietic markers. Immunocytochemical and/or immunoblotting analyses revealed the expression of numerous stem cell markers, including nanog, Sox2, nestin, Musashi-1 and nucleostemin, whereas they were negative for markers associated with differentiated neural, vascular and hepatic cells. Surprisingly, the cells were only slightly positive for α-smooth muscle actin, and a heterogeneous expression of CD146 was observed. When cultured in osteogenic media, they expressed osteonectin, osteopontin and procollagen I, and in micromass cultures, they produced collagen I. DPSCs cultured in TGF-β1/3-supplemented media produced extracellular matrix typical of cartilaginous tissue. The addition of vascular endothelial growth factor to serum-free media resulted in the expression of endothelial markers. Interestingly, when cultured in neurogenic media, DPSCs exhibited de novo or upregulated markers of undifferentiated and differentiated neural cells. Collectively, our data show that DPSCs are self-renewing and able to express markers of bone, cartilage, vascular and neural tissues, suggesting their multipotential capacity. Their easy accessibility makes these cells a suitable source of somatic stem cells for tissue engineering. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Access to primary human corneal endothelial cells (HCEC) is limited and donor-derived differences between cultures exacerbate the issue of data reproducibility, whereas cell lines can provide sufficient numbers of homogenous cells for multiple experiments. An immortalized HCEC population was adapted to serum-free culture medium and repeated cloning was performed. Clonally grown cells were propagated under serum-free conditions and growth curves were recorded. Cells were characterized immunocytochemically for junctional proteins, collagens, Na,K-ATPase and HCEC-specific 9.3.E-antigen. Ultrastructure was monitored by scanning and transmission electron microscopy. Two clonal cell lines, HCEC-B4G12 and HCEC-H9C1, could be isolated and expanded, which differed morphologically: B4G12 cells were polygonal, strongly adherent and formed a strict monolayer, H9C1 cells were less adherent and formed floating spheres. The generation time of B4G12 cells was 62.26 ± 14.5 h and that of H9C1 cells 44.05 ± 5.05 h. Scanning electron microscopy revealed that B4G12 cells had a smooth cell surface, while H9C1 cells had numerous thin filopodia. Both cell lines expressed ZO-1 and occludin adequately, and little but well detectable amounts of connexin-43. Expression of HCEC-specific 9.3.E-antigen was found commensurately in both cell lines, while expression of Na,K-ATPase α1 was higher in H9C1 cells than in B4G12 cells. B4G12 cells expressed collagen IV abundantly and almost no collagen III, while H9C1 cells expressed both collagens at reasonable amounts. It is concluded that the clonal cell line B4G12 represents an ideal model of differentiated HCEC, while H9C1 may reflect features of developing or transitional HCEC. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Die progrediente, muskuloskelettale Erkrankung Ostheoarthrose wird aufgrund der immer älter werdenden Weltbevölkerung im Jahre 2020 einer der häufigsten Invaliditätsgründe sein. Koelling et al. beschrieb 2009 eine migrierende, chondrogene Progenitorzelllinie (CPC) im Reparaturgewebe der fortgeschrittenen Gonarthrose des Menschen, die Stammzelleigenschaften besitzt. Sie sind multipotent, klonal und besitzen ein osteochondrogenes Expressionsmuster, wodurch sie sich für neue Behandlungsmöglichkeiten bei der Ostheoarthrosetherapie eignen könnten. In dieser Arbeit wurden in vitro drei Klone einer humanen CPC-Population aus osteoarthrotisch verändertem Knorpel hinsichtlich ihrer multipotenten Eigenschaften, Proliferationsgeschwindigkeit und unterschiedlicher Phänotypen gegenübergestellt, da sich bei anderen Stammzelllinien Zusammenhänge zwischen diesen Eigenschaften zeigen, die mit fortgeschrittener Ausdifferenzierung der Stammzellen begründet wird. Die drei Klone IF-8, IIB-6 und IID-4 wurden 12 Tage unter Standardbedingungen in 2D-Flaschenkultur gehalten und anschließend ihr normaler Phänotyp ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass IF-8 und IIB-6 eher einen fibroblastenartigen Phänotyp ausbildeten, während sich bei IID-4 erst kugelige Zellen bildeten, die später teils in eine längliche Form übergingen. Die fibroblastenartige Form entsprach der von CPCs aus heterogenen Kulturen, wohingegen der Phänotyp von IID-4 auf Dedifferenzierung oder fortgeschrittenere Differenzierung schließen ließ. Die Klone für die Differenzierungsversuche wurden mit zwei verschiedenen Zelldichten ausgesät, um auch eventuelle Einflüsse der Zelldichte mit in die Untersuchung einzubeziehen. Es wurde pro Well einmal die Anfangskonzentration von 1000 Zellen gewählt und einmal 3000 Zellen pro Well. Nach sechs Tagen wurden morphologische Veränderungen unter dem Mikroskop ausgewertet. Die Differenzierung in Adipozyten und Osteoblasten erfolgte insgesamt über zehn Tage mit anschließendem Differenzie- rungsnachweis mittels Oil-Red-Färbung von Adipozyten, bzw. der Alkalischen-Phosphatase-Reaktion der Osteoblasten. Es wurde zusätzlich mit der Immunfluoreszenzzytochemie kontrolliert, ob in den differenzierten Zellen auch spezifische Proteine exprimiert wurden und sich zwischen den Klonen ein quantitativer Unterschied ergibt, der auf einen veränderten Differenzierungsgrad der Klone schließen konnte. Für die Adipozyten wurden Antikörper gegen dieLipoproteinlipase und PPARγ gewählt, bei den Osteoblasten kamen Antikörper gegen Osteocalcin und den osteogenen Transkriptionsfaktor runx-2 zum Einsatz. Allen Differenzierungsversuchen wurden jeweils Kontrollgruppen gegenübergestellt. Die Ergebnisse zeigten morphologische Unterschiede zwischen den Klonen und den verschiedenen Zelldichten, die bei der osteogenen Differenzierung nicht so stark ausgeprägt waren wie bei der adipogenen. Der Klon-IID-4 zeigte auch hier die am Stärksten ausgeprägtesten morphologischen Unterschiede zwischen den Zellen selber und der verschiedenen Dichtegrade. Die quantitative Auswertung mittels Oil-Red und Alkalischer-Phosphatase, bzw. die Ergebnisse der Immunzytochemie ergaben hingegen keine Abweichungen zwischen den Klonen und keine Veränderung in Abhängigkeit zur Zelldichte. Dadurch konnte gezeigt werden, dass bei den CPCs ein veränderter Phänotyp kein Hinweis auf eine fortgeschrittene Zellalterung und verminderte Differenzierbarkeit ist. Auch die Zelldichte nimmt auf die Differenzierung in andere Zelllinien keinen positiven oder negativen Einfluss. Deutliche Unterschiede zwischen den Klonen zeigten sich hinsichtlich ihrer Proliferationsgeschwindigkeit und ihres osteochondrogenen Grundmusters. Für das Proliferationsassay wurden über den Zeitraum von sieben Tagen die Zellzahlen gemessen. Dabei wurde festgestellt, dass sich Klon-IF-8 am langsamsten teilte, danach folgte IID-4 und am Ende IIB-6. Im Zusammenhang mit dem Western-Blot, bei dem der osteogene Transkriptionsfaktor runx-2 und der chondrogene Transkrip-tionsfaktor sox-9 miteinander verglichen wurden, konnte eine Beziehung zwischen Proliferationsgeschwindigkeit und der Ausprägung der Transkriptionsfaktoren festgestellt werden. Mit Abnahme der Proliferationsgeschwindigkeit nimmt die Expression von runx-2 zu, während die Expression von sox-9 abnimmt. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass die CPCs mit abnehmender Zellteilung in einen vermehrt osteogenen Zustand übergehen und ihren osteochondrogenen Charakter verlieren. Dieser Übergang hat jedoch keinen Einfluss auf ihre multipotenten Eigenschaften. Mit den Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass sich CPCs, ähnlich wie andere Progenitorzellen auch, in ihrer Entwicklung weiter ausdifferenzieren und sich dadurch innerhalb einer Population verschiedene Entwicklungszustände ergeben, die eine genauere Charakterisierung der CPCs weiter erschweren.

Freie Univ., Diss--Berlin, 1999.

Interleukin-10 ist ein Paradebeispiel eines immunhemmenden Zytokins. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe von Tumoren Interleukin-10 produziert, um einer Antitumor-Immunantwort zu entgehen. Viele Studien haben sich mit dem Einfluss von Interleukin-10 auf die antigenpräsentierenden Fähigkeiten der Dendritischen Zellen beschäftigt. Es gibt eindeutige Hinweise, dass der Effekt von tumorproduziertem Interleukin-10 nicht nur in einer hemmenden Wirkung auf die Ausreifung Dendritischer Zellen besteht, sondern dass Interleukin-10 zu einer Reduktion der Anzahl an Dendritischen Zellen führen kann. Ziel dieser Arbeit ist es daher, den Mechanismus für eine solche depletierende Wirkung auf die Dendritischen Zellen zu analysieren. Hierzu wurden die Effekte von Interleukin-10 auf die frühe Differenzierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten untersucht. Die Zugabe von Interleukin-10 zu einem Differenzierungscocktail aus Interleukin-4 und Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierendem-Faktor führt zu einer nachhaltigen Hemmung des Differenzierungsprozesses von Monozyten zu Dendritischen Zellen. Bereits 48h nach Beginn der Zellkultur konnte mit Hilfe von cDNA-Microarray-Analysen gezeigt werden, dass Interleukin-10 nicht nur einen Differenzierungs-hemmenden Effekt ausübt, sondern auch die Entstehung aberranter Zellphänotypen bewirkt. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Effekte des Interleukin-10 in der frühen Differenzierungsphase weitgehend irreversibel sind. Zusammenfassend können die Ergebnisse zur Erklärung beitragen, wie es bei Patienten mit Tumoren unter dem Einfluss von Interleukin-10 zu einer Reduktion der absoluten Zahl Dendritischer Zellen kommen kann.:1. Verzeichnis der Abkürzungen 5 2. Einleitung 7 Fragestellung 11 3. Material und Methoden 12 3.1 Verwendete Materialien 12 3.1.1 Reagenzien für Zellseparation und Zellkultur 12 3.1.2 Stimulatoren 12 3.1.3 Reagenzien für FACS-Analysen 12 3.1.4 Molekularbiologische Reagenzien und Puffer 13 3.1.4.1 RNA-Isolierung 13 3.1.4.2 RT-PCR 13 3.1.4.3 cDNA Microarrays 14 3.2 Zellen und Kulturbedingungen 15 3.2.1 Isolierung von Monozyten aus dem peripheren Blut 15 3.2.2 Ausreifung von Monozyten zu Dendritischen Zellen 16 3.3 Durchflusszytometrie 17 3.4 RNA Isolierung 18 3.4.1 Prinzip und Protokoll der RNA-Isolierung 18 3.4.2 Quantifizierung der RNA und Bestimmung der Reinheit 19 3.4.2.1 Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration 19 3.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 20 3.4.2.3 RNA-Fällung 21 3.5 cDNA Expressions-Ansätze 22 3.5.1 mRNA-Amplifikation 22 3.5.2 Membranmarkierung 23 3.5.2.1 Prinzip des cDNA-Array 23 3.5.2.2 Probensynthese 24 3.5.2.3 Aufreinigung 25 3.5.2.4 Hybridisierung der Nylonmembran 25 3.5.2.5 Auswertung der Ergebnisse 27 3.6 Statistische Auswertung 27 4. Ergebnisse 28 4.1 Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen unter dem Einfluss von IL-4 und GM-CSF 28 4.2 Ermittlung der wirksamen hemmenden Konzentration von IL-10 29 4.3 Einfluss von IL-10 während der Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen 30 4.3.1 Oberflächenexpression nach 7 Tagen 30 4.3.2 Oberflächenexpression nach 2 Tagen 32 4.3.3 Oberflächenexpression nach 24 Stunden und 48 Stunden für die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR7 33 4.4 Ausreifung von unreifen Dendritischen Zellen zu reifen Dendritischen Zellen unter dem Einfluss von KLH, TNF-α und GM-CSF 36 4.5 Kann eine adäquate Ausreifung die hemmenden Effekte von IL-10 überwinden? 37 4.6 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen 38 4.7 Genexpressionsmuster in der frühen Phase der Differenzierung Dendritischer Zellen 40 5. Diskussion 49 5.1 Hintergrund 49 5.2 Einfluss von IL-10 auf die Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen 51 5.3 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen 53 5.4 Genexpression 55 5.4.1 Übersicht 55 5.4.2 Regulation von CCR1 und CCR2 durch IL-10 56 5.4.3 Regulation von IL-1ß und IL-1R1 durch IL-10 58 5.4.4 Regulation von S100A8 und S100A9 durch IL-10 59 5.5 Biologische Bedeutung 61 6. Zusammenfassung 63 7. Literaturverzeichnis 67

Einleitung: Die Pathogenese chronisch entzündlicher Atemwegserkrankungen ist mit zunehmender Schädigung und fibrotischen Umbauvorgängen und daraus resultierenden Einschränkungen physiologischer Funktionen verbunden. Bei der Recurrent Airway Obstruction (RAO) des Pferdes sind solche strukturellen Veränderungen häufig assoziiert mit Verdickung der Atemwegswand, subepithelialer Fibrose und Obstruktion der Atemwege. Bei RAO besteht die Standardtherapie darin, die Bronchokonstriktion mit β2-Agonisten und die Entzündung mit Glucocorticoiden aufzuhalten. In den letzten Jahrzehnten konnte jedoch gezeigt werden, dass nicht alle Patienten mit der empfohlenen Therapie ausreichend behandelt werden können und neue Ansatzpunkte der Therapie gefunden werden müssen. Daher konzentrieren sich neuere Forschungsarbeiten auf strukturelle Alterationen in den Atemwegen, das sogenannte Airway-Remodelling. Zielsetzung: In der vorliegenden Arbeit sollen zunächst primäre equine Bronchialfibroblasten (EBF) isoliert, charakterisiert und kultiviert werden. Im nächsten Schritt sollen in diesen Zellen die β2-Rezeptorexpression und –eigenschaften charakterisiert werden. Anschließend soll die Eignung dieser Zellen als Zellmodell zur Untersuchung der zellulären Proliferation und Transformation sowie der Regulation der de-novo-Synthese von extrazellulärer Matrix und deren Beeinflussung durch β2-Agonisten und Glucocorticoide allein oder in Kombination sowie TGF-β überprüft werden. Material und Methoden: Mittels enzymatischer Verdauung mit 0,25 % Trypsin werden die EBF aus den Bronchien von 10 gesunden Schlachtpferden isoliert und in DMEM kultiviert. Diese Zellen werden morphologisch, immunzytochemisch und funktionell in deren Eigenschaften in An- oder Abwesenheit von fetalem bovinem Serum (FBS) oder Pferdeserum (HS) charakterisiert. Die Dichte und Subtypverteilung von β-Adrenozeptoren wird mittels Radioligandbindungsstudien mit [125I]-(-)-Iodocyanopindolol in Gegenwart von Rezeptorsubtyp-selektiven β-Antagonisten (β2: ICI 118,551 und β1: CGP 20712A) in EBF untersucht. Der Einfluss von β2-Agonisten auf die Proliferation und Differenzierung der EBF sowie die Kollagensynthese wird mittels [3H]-Thymidineinbauassay, Bestimmung von Gesamtprotein und α-Smooth Muscle Aktin (α-SMA) mit Lowrymethode und Western Blot-Analyse bzw. [3H]-Prolininkorporationsassay ermittelt. Die statistische Signifikanz wird über einen t-Test für verbundene Stichproben oder eine One-Way-ANOVA mit nachfolgendem Dunnett’s Test ermittelt und das Signifikanzniveau wird P ≤ 0,05 festgelegt. Ergebnisse: EBF können im DMEM-Medium nur in Gegenwart von Serum langfristig wachsen und kultiviert werden. In serum-freiem Medium und unter vorübergehendem Serumentzug können EBF nicht anhaften bzw. lösen sie sich ab. Die Effekte von FBS und HS auf EBF sind allerdings unterschiedlich. FBS fördert die Zellproliferation und -verdopplungsrate sowie die Zellpassage bis zur Passage 20 signifikant besser als HS (max. 9 Passagen). Unter FBS entwickeln EBF eine für Fibroblasten charakteristische spindelförmige Morphologie aber eine schwache α-SMA-Expression, während unter HS die Zellen eine atypische, polygonale Morphologie zeigen, jedoch mit signifikant hohem α-SMA und Proteingehalt. Radioligandenbindungsstudien zeigen, dass EBF lediglich den β2-Adrenozeptorsubtyp mit einer maximalen Rezeptorendichte (Bmax) von 5037 ± 494 Bindungsstellen/Zelle exprimieren. Die Behandlung der EBF mit β-Agonisten (Clenbuterol, Salbutamol, Isoproterenol) führt konzentrationsabhängig zur Abnahme dieser Anzahl der Rezeptoren mit unterschiedlicher Wirkungsstärke (Clenbuterol > Salbutamol > Isoproterenol), wobei Dexamethason diese nicht verändert. Diese Agonisten sowie auch Dexamethason hemmen die Proliferation der EBF, und dies kann in Gegenwart von ICI 118,551 aber nicht von CGP 20712A gehemmt werden, was auf den Einfluss des β2-Adrenozeptors hinweist. β2-Agonisten und Dexamethason gemeinsam resultieren in einer verstärkten Hemmung der EBF-Proliferation. Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) stimuliert die Transformation von EBF zu Myofibroblasten mit einer erhöhten Expression von α-SMA in EBF, welches eher durch Dexamethason als durch Clenbuterol gehemmt wird. Die Kollagensynthese wird nur durch Dexamethason signifikant gehemmt. Schlussfolgerung: Das erstmalig etablierte EBF-Kulturmodell dient der Erforschung von Signalwegen und neuen Arzneimitteltargets im Zusammenhang mit der Pathogenese der equinen RAO insbesondere dem Atemwegs-Remodelling. So kann gezeigt werden, dass die Verwendung von β2-Agonisten allein oder in Kombination mit Glucocorticoiden eine Hemmung der Proliferation und Transformation von EBF in vitro bewirkt. Dies deutet auf einen zusätzlichen therapeutischen Nutzen von Clenbuterol und Glucocorticoiden hin und impliziert die Notwendigkeit eines frühzeitigen Einsatzes dieser Pharmaka bei der RAO des Pferdes.

We isolated and expanded stem cells from dental pulp from extracted third molars using an innovative culture method consisting of low serum-containing medium supplemented with epidermal growth factor and platelet-derived growth factor BB. We evaluated the differentiation potential of these cells when they were growing either adherently or as micromass/spheroid cultures in various media. Undifferentiated and differentiated cells were analyzed by flow cytometry, immunocytochemistry and immunoblotting. The flow cytometry results showed that the dental pulp stem cells (DPSCs) were positive for mesenchymal stromal cell markers, but negative for hematopoietic markers. Immunocytochemical and/or immunoblotting analyses revealed the expression of numerous stem cell markers, including nanog, Sox2, nestin, Musashi-1 and nucleostemin, whereas they were negative for markers associated with differentiated neural, vascular and hepatic cells. Surprisingly, the cells were only slightly positive for α-smooth muscle actin, and a heterogeneous expression of CD146 was observed. When cultured in osteogenic media, they expressed osteonectin, osteopontin and procollagen I, and in micromass cultures, they produced collagen I. DPSCs cultured in TGF-β1/3-supplemented media produced extracellular matrix typical of cartilaginous tissue. The addition of vascular endothelial growth factor to serum-free media resulted in the expression of endothelial markers. Interestingly, when cultured in neurogenic media, DPSCs exhibited de novo or upregulated markers of undifferentiated and differentiated neural cells. Collectively, our data show that DPSCs are self-renewing and able to express markers of bone, cartilage, vascular and neural tissues, suggesting their multipotential capacity. Their easy accessibility makes these cells a suitable source of somatic stem cells for tissue engineering. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Access to primary human corneal endothelial cells (HCEC) is limited and donor-derived differences between cultures exacerbate the issue of data reproducibility, whereas cell lines can provide sufficient numbers of homogenous cells for multiple experiments. An immortalized HCEC population was adapted to serum-free culture medium and repeated cloning was performed. Clonally grown cells were propagated under serum-free conditions and growth curves were recorded. Cells were characterized immunocytochemically for junctional proteins, collagens, Na,K-ATPase and HCEC-specific 9.3.E-antigen. Ultrastructure was monitored by scanning and transmission electron microscopy. Two clonal cell lines, HCEC-B4G12 and HCEC-H9C1, could be isolated and expanded, which differed morphologically: B4G12 cells were polygonal, strongly adherent and formed a strict monolayer, H9C1 cells were less adherent and formed floating spheres. The generation time of B4G12 cells was 62.26 ± 14.5 h and that of H9C1 cells 44.05 ± 5.05 h. Scanning electron microscopy revealed that B4G12 cells had a smooth cell surface, while H9C1 cells had numerous thin filopodia. Both cell lines expressed ZO-1 and occludin adequately, and little but well detectable amounts of connexin-43. Expression of HCEC-specific 9.3.E-antigen was found commensurately in both cell lines, while expression of Na,K-ATPase α1 was higher in H9C1 cells than in B4G12 cells. B4G12 cells expressed collagen IV abundantly and almost no collagen III, while H9C1 cells expressed both collagens at reasonable amounts. It is concluded that the clonal cell line B4G12 represents an ideal model of differentiated HCEC, while H9C1 may reflect features of developing or transitional HCEC. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.