Utilizando uma bibioteca de expressão feita a partir do epitélio do intestino médio da larva de Diatraea saccharalis, nós clonamos e sequenciamos 3 cDNAs completos (DsβglyA, DsβglyB e DsβglyC), além de uma seqüência parcial que teoricamente codificam β-glicosidases. As sequências dos peptídeos obtidos após digestão por tripsina das β-glicosidases βgly1 e βgly2 de D. saccharalis mostraram que DsβglyA codifica a βgly1, caracterizada anteriormente. DsβglyB e DsβglyC provavelmente codificam duas β-glicosidases solúveis com massas moleculares teóricas de, respectivamente, 57,5 KDa e 56,2 KDa. Levando em consideração as semelhanças entre βgly1 e βgly3 e entre DsβglyA e DsβglyC, é razoável supor que DsβglyC codifique a βgly3. Os peptídeos produzidos após a hidrólise de βgly2 por tripsina não são codificados por nenhum dos cDNAs que nós sequenciamos. βgly2 provavelmente é codificada pelo cDNA cuja seqüência ainda está incompleta. A inativação da βgly2 por carbodiimida usando o tio-glicosídeo sinigrina e o O-glicosídeo p-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo resulta na mesma constante de inativação, indicando que o mesmo sítio ativo é responsável pela hidrólise dos dois substratos. A mesma conclusão é obtida calculando o Km de βgly2 para os dois substratos e o Ki da inibição que cada um deles causa na hidrólise do outro. Os resultados indicam que uma só enzima é responsável pela hidrólise de sinigrina e p-nitrofenil β-D-glicosídeo com atividade semelhante. Essa propriedade nunca foi descrita para outra tio- ou O-glicosidase. / We used an expression library made from Diatraea saccharalis midgut epithelium and succeeded in cloning and sequencing three complete cDNAs (DsβGlyA; DsβGlyB; DsβGlyC) plus a partial sequence that hypothetically code for β-glycosidases. The sequence of peptides obtained from the purified D. saccharalis β-glycosidases (βGly1 and βGly2) after trypsin digestion shows that DsβGlyA codes for βGly1, an enzyme that had already been characterized. DsβGlyB and DsβGlyC probably code for two soluble β-glycosidases with, respectively, 503 and 493 amino acid residues and theoretical molecular weighs of 57.5 kDa and 56.2 kDa. Taking into account the similarities of βGly1 and βGly3 and of DsβGlyA and DsβGlyC it is reasonable to suppose that DsβGlyC codes for βGly3. The peptides produced after βGly2 hydrolysis by trypsin could not coded by any of the complete sequenced cDNAs, although they might be code by the still partial sequence we have. We determined the chemical inactivation of βGly2 using the thio-glucoside sinigrin and the O-glycoside p-nitrophenyl-β-D-galactoside, and found the same inactivation constant, indicating that the same active site is responsible for the hydrolysis of the two substrates. The same conclusion is reached determining βGly2 Km for both substrates and the Ki for inhibition of the hydrolysis of one substrate using the other as inhibitor. These results indicated that only one enzyme is responsible for the hydrolysis of sinigrin and p-nitrophenyl-β-D-galactoside with similar activities, which is not a property reported before for any O- or S- β-glycosidase.

Existem poucas informações sobre exigências de energia de cervídeos brasileiros, dificultando o sucesso de manejo e reprodução em cativeiro. O conhecimento das exigências de energia também é importante para determinar os recursos necessários para sua conservação em parques e reservas. O primeiro objetivo deste experimento foi estudar as exigências nutricionais do veado catingueiro (Mazama gouazoubira) em cativeiro. O segundo objetivo foi observar o comportamento alimentar do veado-campeiro (Ozotoceros bezoarticus) no Parque Nacional das Emas (PNE), descrevendo qualitativamente e quantitativamente as principais espécies vegetais utilizadas para o aporte de nutrientes. A determinação das exigências de energia para mantença utilizou 8 veados-catingueiro de ambos os sexos em cativeiro e foi desenvolvida através de dois métodos: a)equilíbrio de peso e b)água duplamente marcada (2H2 18º). Os animais foram dosados com água duplamente marcada (111,8 mg/kgPV para 2H2O e 163,1 mg/kgPV para H2 18O) e amostras de sangue foram coletadas em intervalos de 3 dias, até que 3 ou 4 meias– vidas dos isótopos tenham decorrido (atingindo o limite de detecção em aproximadamente 30 dias após a dosificação). As curvas de desaparecimento dos isótopos em função do tempo foram utilizadas para calcular o “turnover” de CO2 e H2O. Os resultados obtidos pelos dois métodos foram semelhantes (111,4 e 112,0 kcal/kg.75.d) comprovando que a técnica da água duplamente marcada pode ser utilizada em estudos nutricionais de cervídeos. Informações de doses (mg/kgPV) e intervalo máximo entre aplicação e coleta de sangue (30 dias), permitem o uso desta metodologia em estudos futuros em vida livre. No PNE, veados-campeiro já monitorados com radio colares, permitiram a observação de seu comportamento alimentar. O experimento foi realizado em duas épocas distintas (inverno e verão). As espécies foram analisadas quanto à composição nutricional, para estimar valores energéticos assim como consumo de minerais e proteína. As contribuições das diferentes espécies que compõem a dieta dos cervídeos foram estimadas para duas populações em vida livre, uma com acesso apenas a espécies nativas (área central do parque) e outra com acesso às espécies cultivadas na periferia do PNE. Os sinais isotópicos do carbono 13 e os perfis de n-alcanos foram utilizados para quantificar a contribuição das diferentes espécies ingeridas. Os resultados indicaram que os veados-campeiro utilizam uma ampla gama de partes e espécies vegetais. Sua dieta é composta por aproximadamente 78 ítens, divididos em brotos (38,5%), folhas (15,4%), flores (17,9%), botões florais (12,8%), frutos e sementes (15,4%); de 55 diferentes espécies nativas e 7 culturas agrícolas. Há grande diferença no padrão de consumo entre as populações no interior do parque e aquelas que tem possibilidade de selecionar plantas cultivadas pelo homem. As espécies agrícolas podem contribuir com até 46,9% da dieta dos cervídeos da periferia do parque. Este trabalho determinou as exigências de energia de cervídeos brasileiros, validou o uso de uma técnica indireta para futuros estudos em vida livre e descreveu as espécies e partes utilizadas como aporte de nutrientes por cervídeos em vida livre. / There are limited data on energy requirements of brazilian cervids. Thus, it is difficult to succeed in their management and reproduction in captivity. Knowing the energy requirements is also important to determine the necessary nutritional resources for their conservation in parks and reserves. The first objective was to study the nutritional requirements of the grey-brocket deer (Mazama gouazoubira) in captivity. The second objective was to observe the feeding behavior of the pampas-deer (Ozotoceros bezoarticus) in the Emas National Park (ENP), describing qualitatively and quantitatively the main vegetal species used to supply these animals with nutrients. The determination of energy requirements for maintenance used 8 gray-brocket deer of both sexes in captivity and was carried through two methods: a)weight equilibrium and b)double-labeled water (2H2 18O). The animals were dosed with double-labeled water (111.8 mg/kgBW for 2H2O and 163.1 mg/kgBW for H2 18O) and blood samples were collected with 3 days interval, until 3 or 4 half lives of isotopes had occurred (reached limit of detection at approximately 30 days after the dosage). The curves of isotopes disappearance as a function of time were used to calculate the turnover of CO2 and H2O. The results obtained from the two methods were similar (111.4 and 112.0 kcal/kg.75.d) proving the double-labeled water technique may be used in nutritional studies of cervids. Information on doses (mg/kgBW) and maximum interval between injection and blood collection (30days), allow the use of this methodology in future studies with free ranging deer. In the national park, pampas-deer already monitored with radio colars, facilitated the observation of their feeding behavior. The experiment was conducted at two distinct seasons (winter and summer). The species were analyzed for the nutritional composition, to estimate energy values as well as mineral and protein consumption. The contributions of the different species to the diet of the cervids were estimated for two free ranging populations of the national park, one with access only to native species (central area of the park) and another with access to the crop species cultivated in the periphery of the park. The isotopic signals of carbon 13 and profiles of n-alkanes were used to quantify the contribution of different species to supply the energy demands. The results indicated that pampas-deer feeds on a broad spectrum parts and vegetal species. Its diet was composed of approximately 78 different parts, divided in sprouts (38.5%), leaves (15.4%), flowers (17.9%), floral buttons (12.8%), fruits and seeds (15.4%); from 55 different native species and 7 agricultural cultures. There is a great difference in the intake selection patterns between populations in the interior of the park and those that have access to cropland and the opportunity to choose feeding on native or cultivated plants. The agricultural species can contribute with up to 46.9% of deer diet of the park periphery. This work determined the requirements of energy of Brazilian cervids, validated the use of one indirect technique for use in free ranging animals and described the species and parts used to supply nutrients to cervids in the wild.

O presente trabalho teve o objetivo de avaliar fatores associados à ensilagem da cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.), com destaque para a aplicação de aditivos químicos e microbianos, sobre a composição químico-bromatológica, perdas fermentativas, digestão de nutrientes e desempenho de bovinos de corte. No primeiro experimento, avaliaram-se variedades de cana-de-açúcar, idades de colheita, tempos de armazenamento das silagens e inclusão de uréia como aditivo na ensilagem, sobre composição das silagens, perdas e parâmetros fermentativos. O experimento foi realizado em esquema fatorial 3x2x2x2, usando-se silos experimentais para confecção das silagens. A composição de nutrientes das silagens foi afetada pelos fatores testados. Silagens da variedade IAC86-2480 apresentaram menor teor de fração fibrosa e de matéria seca, e maior digestibilidade in vitro em relação à variedade IAC87-3184. Plantas colhidas aos 15 meses proporcionaram perdas reduzidas de MS. A aplicação de uréia nas ensilagens foi efetiva em reduzir as perdas totais de MS, e não alterou os teores de etanol ou ácido acético, e elevou o teor médio de ácido lático das silagens. Em um segundo experimento foram avaliados os aditivos químicos uréia e benzoato de sódio, e os microbianos Lactobacillus plantarum (LP) e L. buchneri (LB) na ensilagem da cana-de-açúcar, bem como a cana-de-açúcar ensilada sem aditivos, em rações para bovinos providos de cânula, em ensaio de digestão. Os aditivos aplicados alteraram a composição e as recuperações de MS das silagens. O consumo de MS, digestibilidade aparente de nutrientes e comportamento ingestivo dos animais não foram alterados pelos tratamentos testados. Os parâmetros ruminais foram afetados de forma moderada pelos tratamentos experimentais, com concentrações molares médias dos ácidos acético, propiônico e butírico de 60,9; 19,3 e 10,2 mM, respectivamente. Os tratamentos com uréia, LB e benzoato de sódio elevaram moderadamente a degradabilidade efetiva da MS das silagens. Em uma terceira fase, avaliou-se a silagem de cana sem aditivos e silagens contendo doses de LB em rações para bovinos de corte em confinamento. Foram usados 56 tourinhos Nelore e Canchim, alimentados com rações contendo 45% de volumoso. A inoculação com LB alterou de forma moderada a composição das silagens. A silagem controle apresentou teor de etanol três vezes superior aos tratamentos inoculados (1,53 vs 0,45% da MS). A adição de ingredientes concentrados às silagens foi efetiva em melhorar substancialmente as variáveis de estabilidade aeróbia. Silagens aditivadas proporcionaram elevação na ingestão (23,0%) e no ganho de peso dos animais (12,7%), em relação às rações com silagem controle. O comportamento ingestivo dos animais experimentais foi afetado pelos tratamentos, sendo que rações contendo silagem controle necessitaram de maior tempo para ingestão, ruminação e mastigação, em relação aos tratamentos inoculados. A presença de aditivos na ensilagem da cana-de-açúcar foi efetiva em controlar perdas e preservar o valor nutritivo da forragem conservada. / The goal of this trial was to evaluate ensiling associated factors influencing sugar cane (Saccharum officinarum L.)silages, mainly the use of chemical and microbial additives on the chemical composition, fermentative losses, nutrient digestion and performance of beef cattle. On the first trial, sugar cane varieties were evaluated across harvesting forage ages, storage time and the addition of urea over the chemical composition, fermentative parameters and losses. A factorial 3x2x2x2 design was applied upon experimental silos. The nutrient composition of silages was affected by the studied factors. The silages from IAC86-2480 variety showed lower fiber and dry matter contents and higher in vitro digestibility contents than the silage made of IAC87-3184 variety. Plants that were cut at the age of 15 months led to lower DM losses. The urea addition on ensiling was effective on decreasing total DM losses and did not change the ethanol or acetic acid contents, however increased the mean lactic acid content of silages. On a second trial, the chemical additives, urea and Na-benzoate, were evaluated and the microbial inoculants Lactobacillus plantarum (LP) and L. buchneri were also studied on sugar cane ensiling, compared to the control sugar cane silage, by using ruminally cannulated steers fed TMR rations in a digestion trial. The additives altered the composition and the DM recovery rate of the silages. Overall DM intake, apparent in vivo digestibilities and animal behavior were not affected by treatments. The ruminal parameters were slightly affected by treatments, which averaged molar concentrations of acetic, propionic and butyric acids of 60.9, 19.3 and 10.2 mM, respectively. The urea, LB and Na-benzoate treatments promoted moderate increase on DM effective degradabilities of silages. On the third trial, sugar cane silage without additives and LB added silages were studied on the feedlot beef cattle rations. Fifty six Nellore or Canchim beef bulls were assigned to treatments and fed with 45% forage rations. The LB silages had small changes on the chemical composition and the control silage showed a three times increased content of ethanol when compared to inoculated silages (1.53 vs 0.45% of DM). The concentrates added to silages were effective on improving the aerobic stability parameters. The rations containing LB added silages provided increase on the DM intake (23.0%) and daily weight gain of animals (12.7%), when compared to the control silage ration. The ingestive behavior of experimental bulls was affected by treatments, where control silage ration showed increased feeding, rumination and chewing time, when compared to the inoculated silages. The additives on sugar cane ensiling were effective to prevent losses and to preserve the nutritive value of ensiled forage.

Um enfoque analítico, envolvendo centrifugação diferencial de homogeneizados de cecos gástricos de Rhynchosciara americana preparados em condições brandas e vigorosas, suporta a asserção de que existe uma classe principal de aril-α- e β -glicosidases, aril-α- e β-galactosidases e celobiases que é ligada à membrana plasmática, e duas classes de maltases, aminopeptidases, carboxipeptidases e dipeptidases. Maltases ocorrem na membrana plasmática e no interior de lisossomos na forma solúvel, enquanto que as peptidases (amino-carboxi- e dipeptidase) são encontradas na membrana plasmática e citossol. A ocorrência das enzimas citadas acima na membrana plasmática das células cecais, foi confirmada por resultados obtidos em preparações de microvilosidades realizadas com técnica desenvolvida para enterocito de mamíferos. O tratamento de microvilosidades com solução hiperosmótica de Tris, seguido de centrifugação em gradiente de densidade, permitiu a separação de quatro frações de membrana e de uma fração que contém microvilosidades intactas e, provavelmente, microfilamentos isolados. Eletroferogramas do material recolhido do gradiente mostrou diferenças entre as frações de membrana e sugeriu a ocorrência de actina como componente majoritário dos microfilamentos das microvilosidades. Ensaios enzimáticos nas diferentes frações do gradiente confirmaram a ocorrência de celobiase e carboxipeptidase ligadas à membrana plasmática. Os resultados de distribuição intracelular de hidrolases nos cecos de R. americana permitiram propor que a digestão terminal de proteínas ocorre na membrana plasmática e no citossol, por ação de amino-, carboxi- e dipeptidases, enquanto que a digestão de carboidratos, com exceção da trealose, ocorre somente na superfície das microvilosidades. / An analytical approach involving differencial centrifugation of Rhynchosciara Americana midgut caeca homogenates prepared in mild and in vigorous conditions support the assumption there are one main class of aryl-α- e β-glucosidases, aryl-α - e β-galactosidases and cellobiases, which are plasma membrane bound, and two classes of maltases, aminopeptidades, carboxypeptidases and dipeptidases. Maltases, occur in plasma membrane and in lysosomes (as a soluble enzyme) and the others are found in plasma membrane and cytosol. A succeful purification of caeca cells brush-borders by tecniques used for mammal enterocytes confirmed the assumptions based on differential centrifugation data. Treatment of purified microvilli with a hyperosmotic solution of Tris, followed by density gradient centrifugation, resulted in the separation of four membrane fractions and one fraction containing intact microvilli and, probably, isolated microfilaments. Electropherograms of the material recovered from the gradient showed differences among the membrane fractions, and they permitted to propose that actin is a major component of microvilli microfilaments. Enzymatic assays in the different fractions from the gradient confirmed the occurrence of cellobiase and carboxypeptidase plasma membrana bound. The results permite to propose that the majority of the terminal digestion of proteins and carbohydrates, with the exception of trehalose, occurs on the surface of the insect midgut caeca cells microvilli.

Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito de fontes e teor de fibra no consumo voluntário, no comportamento ingestivo, na efetividade de fontes de fibra, na cinética digestiva e alguns aspectos do metabolismo ruminal de bovinos de corte. Foram utilizados seis bovinos machos castrados da raça Nelore contendo cânula no saco dorsal do rúmen, alojados em gaiolas metabólicas, em delineamento do tipo quadrado latino 6x6, contendo 19 dias de período experimental cada. Seis rações foram formuladas com diferentes teores e fontes de fibra: CN (controle negativo com 10% da fração FDN de silagem de milho); CP (controle positivo com 20% da fração FDN de silagem de milho); e quatro rações contendo 10% da fração FDN de silagem de milho e 10% da fração FDN de cada uma das seguintes fontes: bagaço in natura de cana-de-açúcar (BAG), cana-de-açúcar (CAN), casca de soja (CSOJ) e torta de algodão desengordurada (TALG). Comparado ao tratamento CP, observou-se CMS semelhante (P>0,05) entre os tratamentos CAN, CSOJ e TALG (9,20, 8,60, 8,83 e 9,52 kg.dia-1, respectivamente). Contudo, tratamento BAG promoveu depressão no CMS (6,97 kg.dia-1). Ração contendo menor teor de fibra (CN) apresentou resultado intermediário quanto ao CMS. Para estimar o fator de efetividade física (fef) ou fator de efetividade (fe) foram utilizados os métodos de bioensaio preconizado por Armentano e Pereira (1997). Além disso, foram utilizados métodos laboratoriais recomendados por Mertens (1997) e Lammers; Buckmaster; Heinrichs (1996) para estimar o fef de fontes de fibra (fef1,18 ou fef>8,0 mm, respectivamente). Ao calcular o fef das fontes de fibra utilizando métodos laboratoriais, foi possível evidenciar grande divergência entre estes e os valores calculados pelos métodos de bioensaio. Medidas de efetividade física calculadas por meio de métodos laboratoriais (fef1,18 ou fef>8,0 mm) apresentaram baixa ou nenhuma correlação (P>0,05) com tempo de ruminação, tempo de mastigação, pH ruminal e mat ruminal. Por outro lado, ao avaliar os fef calculados conforme Armentano e Pereira (1997), coeficientes de correlação adequados foram observados (P<0,05) quando relacionados com tempo de ruminação, tempo de mastigação e mat ruminal. Equações de regressão envolvendo cálculos de efetividade física utilizando métodos laboratoriais e bioensaio foram sugeridas para que se pudesse oferecer aplicabilidade em condições de campo. Os valores médios de pH ruminal foram influenciados pelo nível e fonte de fibra. A concentração total de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) foi significativamente alterada (P<0,05) em função dos diferentes tratamentos. Rações contendo fontes e teores de fibra não alteraram o tempo médio de digestão da MS e da fração FDN (P>0,05), como também, não provocaram alteração (P>0,05) nas frações A e U referente à MS avaliadas pelo ensaio de degradabilidade in situ. Teor e fontes de fibra alteraram (P<0,05) a taxa de passagem do pool de partículas escapáveis no rúmen retículo (ke), o TMRRp e o TMRTp. Não houve diferença (P>0,05) na taxa assintótica de líquidos (L, h-1), no tempo de trânsito da fase líquida (TTL, h), como também, no TMRRL e TMRTL entre os tratamentos avaliados (média de 0,11 h-1, 8,73, 20,6 e 29,6 horas respectivamente). / This study aimed to evaluate the effect of different sources of fiber on voluntary intake, ingestive behavior, on effectiveness fiber sources, on digestive kinetics and some aspects of the rumen metabolism in beef cattle. Six ruminally canulated Nellore steers, housed in tie-stall barns, were used in a 6 x 6 Latin square design with 19 days of experimental periods each. Each experimental period consisted of 10 days of adaptation to the experimental diet and 9 days of data collection. Six diets were formulated with different contents and sources of fiber: NC (negative control - with 10% of the NDF fraction from corn silage), PC (positive control - with 20% of the NDF fraction from corn silage) and four diets containing 10% of NDF fraction from corn silage and 10% of the NDF fraction from each the following sources: sugarcane (SC), sugarcane bagasse (SCB), soybean hulls (SH) and high oil cottonseed meal (HOCM). In comparison to the PC treatment, it was observed similar dry matter intake (DMI) (P>0.05) between the treatments SC, SH e HOCM (9.20, 8.60, 8.83 and 9.52 kg.day-1, respectively). However the SCB treatment decreased DMI (6.97 kg.day-1). The diet containing lower fiber level (NC) presented an intermediate result in relation to DMI. To estimate physical effectiveness factor (pef) or effectiveness factor (fe), bioassay methods recommended by Armentano and Pereira (1997) were used. Also, laboratory methods recommended by Mertens (1997) and Lammers; Buckmaster, Heinrichs (1996) to estimate the effectiveness factor of physical fiber sources (fef1,18 or pef>8.0mm, respectively) were used. There was a large discrepancy between physical effectiveness factor of fiber sources when calculated by laboratory or bioassay methods. Measurements of physical effectiveness calculated by laboratory methods (fef1.18 or fef>8.0mm) showed low or no correlation (P> 0.05) with rumination time, chewing time, rumen pH and ruminal mat. On the other hand, when pef was calculated according to Armentano and Pereira (1997), appropriate correlation coefficients were observed (P <0.05) between pef and rumination time, chewing time and ruminal mat. Regression equations involving calculations of physical effectiveness using laboratorial methods and bioassays have been proposed to provide applicability in field conditions. The mean ruminal pH levels were influenced by the content and source of fiber. The concentration of total short-chain fat acids (SCFA) were significantly altered (P<0.05) according to the different treatments. Diets containing different sources and contents of fiber did not change the average time of digestion from the DM and NDF fraction (P>0.05), also they did not cause changes (P>0.05) in the A and U fractions of the DM evaluated by the in situ degradability study. Content and fiber sources changed (P<0.05) the ke, the TMRRp and the TMRTp. No difference was observed (P>0.05) on asymptotic rate of fluid (L, h- 1), along the transit time of the fluid phase (TTL, h) and TMRRL and TMRTL between different treatments (average of 0.11 h-1, 8.73, 20.6 and 29.6 hours, respectively).

O milho sempre ocupou lugar de destaque na alimentação de vacas leiteiras no Brasil como principal fonte energética. Entretanto, é crescente o interesse por suplementos alternativos, dentre eles alguns subprodutos da agroindústria, como a polpa cítrica e a raspa de mandioca, com o objetivo de reduzir os custos de alimentação. Este trabalho avaliou a substituição do milho moído fino por polpa cítrica ou raspa de mandioca, variando os teores de amido total da dieta e de amido degradável no rúmen, para vacas no terço final de lactação. Os parâmetros avaliados foram consumo de alimento, produção e composição de leite e condição corporal.O experimento foi conduzido nas instalações do Departamento de Zootecnia da “Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz”. Foram utilizadas 24 vacas HPB no terço final de lactação, mantidas em free-stall. Os animais foram agrupados em oito Quadrados Latinos 3x3, de acordo com o número de lactações (primípara ou multípara), dias em lactação e a produção de leite, medida durante os 10 dias do período pré-experimental. Foram utilizados 3 lotes do free-stall, com 8 vacas em cada grupo. O experimento teve a duração de 60 dias, com 3 períodos de 20 dias cada. Os 10 primeiros dias de cada período foram utilizados para adaptação e os 10 dias restantes para coleta de dados. As dietas utilizadas foram isoprotéicas e continham silagem de milho, resíduo de cervejaria, farelo de soja, uréia, mistura mineral e vitamínica e os diferentes suplementos energéticos testados: T1 - milho moído fino; T2 - milho moído fino + polpa cítrica peletizada (50:50) e T3 raspa de mandioca + polpa cítrica peletizada (50:50). Houve tendência de redução de CMS (P<0,13) quando o milho (T1) foi substituído pela mistura de raspa de mandioca + polpa cítrica peletizada (T3). As produções de leite e LCG, os teores e produções de proteína e gordura, lactose e sólidos totais, a eficiência alimentar, o teor de N-uréico e a condição corporal das vacas não foram afetadas pelos tratamentos (P>0,05). / Corn is the major energy supplement for dairy cows in Brazil. However, its increasing price during the last years, has increased the interest for cheaper energy sources, especially by-products as citrus pulp and tapioca meal, to reduce feed costs. The objective of this trial was to evaluate the replacement of fine ground corn by peleted citrus pulp and/or tapioca meal, varying the total and rumen degradable starch levels in the diet for late lactation cows. Group dry matter intake and individual milk yield and composition and body condition score were measured. The trial was conducted at the dairy farm of the Animal Science Department of the Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiróz” - Universidade de São Paulo, in Brazil. Twenty four lote lactation Holstein cows, managed in a free-stall housing were grouped in eight 3x3 Latin Square, according to their number of lactation (primiparous x multiparous), days in milk and milk production measured during a 10 days pre- trial period. Three pens were used with 8 cows each. Total trial lasted 60 days, with three 20 days experimental periods. The first 10 days of each period were use for cows adaptation to treatments, and the last 10 days for data collection. As feed intake was measured for group and not individual cows, the DMI and feed efficiency were analyzed considering every group of 8 cows as an experimental unit (a single 3x3 Latin Square). All the others data were analyzed as eight 3x3 Latin Square design. Diets were isonitrogenous and were composed by corn silage, brewers grains, soybean meal, urea, mineral and vitamin mix and one of the energy sources: fine ground corn (T1); fine ground corn + citrus pulp (50:50) (T2) and citrus pulp + tapioca meal (50:50) (T3). There was a tendency (<0,13) for decrease in dry matter intake when fine ground corn (T1) was replaced by citrus pulp + tapioca meal (T3). Milk and 3,5% fat corrected milk, yields, content and yields of fat, protein, lactose and total solids, feed efficiency, milk urea-N and body condition score were not affected by treatments(P>0,05).

Lisozimas são enzimas que fazem parte do mecanismo de defesa contra bactérias, no entanto lisozimas com função digestiva também são encontradas no trato digestivo de vertebrados e no intestino médio de insetos. As lisozimas digestivas de insetos são do tipo c e assim compartilham semelhanças estruturais e mecanísticas com a lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL). Entretanto, para desempenhar sua função digestiva, as lisozimas de insetos apresentam algumas propriedades particulares entre as quais se destaca um pH ótimo mais ácido em relação às lisozimas não-digestivas. Para elucidar as bases moleculares dessa diferença no pH ótimo, duas lisozimas digestivas (lisozima 1 AAQ20048 e lisozima 2 AAQ20047) da larva de Musca domestica (mosca Diptera Cyclorrhapha), clonadas em Pichia pastoris e purificadas, foram caracterizadas estruturalmente e cineticamente com o substrato sintético (MUQ3) e natural (cápsulas de Micrococcus lysodeikticus). Foi observado que o efeito do pH na atividade das lisozimas 1 e 2 sobre o MUQ3 é uma curva com formato de sino e pH ótimo mais ácido que o da HEWL. Essas curvas foram reflexos da diminuição simultânea dos valores de pKas do nucleófilo e do doador de prótons. Estruturas cristalográficas das lisozimas digestivas de Musca domestica foram obtidas a 1,9 Å e análise comparativa com a estrutura terciária da HEWL revelou resíduos de aminoácidos no ambiente do nucleófilo (N46) e do doador de prótons (S106 e T107) que podem estar envolvidos na modulação das constantes de ionização dos resíduos essenciais à catálise. Esses resíduos foram substituídos via mutagênese sítio-dirigida por D, V e A respectivamente e três mutantes simples (N46D, S106V e T107A) e um triplo (N46DS106V- T107A) foram produzidos e purificados. Caracterização revelou que as contribuições individuais da N46, S106 e T107 foram pequenas e próximas do limite de detecção da técnica utilizada. Por outro lado, o conjunto dos 3 aminoácidos foi responsável pelo pH ótimo ácido frente ao substrato sintético, elevando os valores de pKas do nucleófilo e doador de prótons para valores muito semelhantes ao da HEWL. Diferentemente, essa tripla mutação não foi suficiente para elevar o pH ótimo da lisozima 2 sobre cápsulas de Micrococcus lysodeikticus para valores próximos àqueles de HEWL, sugerindo que as bases moleculares do pH ótimo frente ao substrato natural e sintético são diferentes. Uma comparação estrutural entre lisozima 1 e HEWL sugere que os resíduos de aminoácidos carregados na superfície dessas lisozimas sejam importantes para determinação do pH ótimo. A investigação dessa hipótese foi feita substituindo 5 aminoácidos neutros e 1 ácido, via mutagênese sítio-dirigida, por resíduos básicos. A caracterização do mutante sêxtuplo revelou um aumento significativo nos valores de pH ótimo da lisozima 1, indicando que a redução da basicidade da superfície das lisozimas digestivas é determinante para seus pHs ótimos ácidos. / Lysozymes are enzymes that are part of the defence mechanism against bacteria, however lysozymes with digestive function are also found in the digestive tract of vertebrates and in the insect midgut. The digestive lysozymes from insects are c type, so they share similar structural and mechanistic characteristics with hen egg-white lysozyme (HEWL). However, to perform their digestive function, insect lysozymes present some particular properties among them a more acidic pH optimum than that of non-digestive lysozymes. To elucidate the molecular basis of this pH optimum difference, two digestive lysozymes (lysozyme 1 AAQ20048 and lysozyme 2 AAQ20047) from Musca domestica larvae (housefly Diptera Cyclorrhapha), cloned in Pichia pastoris and purified, were structurally and kinecticly characterized with synthetic (MUQ3) and natural (lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus) substrates. It was observed that the pH effect on the activity of lysozymes 1 and 2 upon MUQ3 is a bell shaped curve exhibiting a more acidic pH optimum than that of HEWL. These curves result from simultaneous decrease of pKas values of the nucleophile and proton donor. Crystallographic structures of these digestive lysozymes from Musca domestica were obtained at 1.9 Å and comparative analysis with the terciary structure of HEWL revealed amino acid residues in the catalytic nucleophile (N46) and proton donor environment (S106 and T107) that may be involved in the modulation of ionization constants of those catalytic residues. N46, S106, and T107 were replaced via site-directed mutagenesis by D, V and A respectively and three simple (N46D, S106V and T107A) and one triple (N46D-S106V-T107A) mutants were produced and purified. Their characterization revealed that the individual contributions of N46, S106 and T107 were small and close to the detection borderline of the technique utilized. On the other hand, a set of these 3 amino acids was responsible by acidic pH optimum upon synthetic substrate, increasing the pKas values of nucleophile and proton donor to similar values to that of the HEWL. Differently, this triple mutation was not enough to increase the pH optimum of lysozyme 2 upon lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus to values close to those of HEWL, suggesting that the molecular bases of pH optimum upon natural and synthetic substrates are different. A structural comparison between lysozyme 1 and HEWL suggests that the charged amino acid residues on the surface of these lysozymes are important for pH optimum determination. The investigation of this hypothesis was done replacing 5 neutral and 1 acidic amino acids, via site-directed mutagenesis, by basic residues. The characterization of this mutant revealed a significant increase in the pH optimum values of lysozyme 1, suggesting that the reduction of basicity on the surface of the digestive lysozymes is a important factor in the determination of their acidic pH optimum.

Os estudos da função intestinal foram particularmente estimulados após a conscientização de que o tubo digestivo é uma enorme interface relativamente pouco protegida entre o inseto e o meio ambiente e pode ser usado como alvo para controle de pragas. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma &#945;-manosidase solúvel e a detecção de uma &#945;-manosidase de membrana. As &#945;-manosidases pertencem a uma família de exoglicosidases as quais hidrolisam resíduos de &#945;-D-manosil a partir de terminais não redutores de oligossacarídeos. Estas enzimas são implicadas no catabolismo de carboidratos e na via de N-glicosilação protéica em insetos, mas pouco se sabe sobre a bioquímica destas glicosidases. O Tenebrio molitor é um Coleoptera bastante estudado pelo nosso laboratório devido a sua relevância como praga agrícola e o seu posicionamento em um ponto estratégico da árvore filogenética de insetos. O estudo de distribuição desta enzima mostrou que a &#945;-manosidase encontra-se, principalmente, como uma enzima solúvel no conteúdo anterior e médio do intestino médio, mas também existe uma atividade significante na fração de membrana. Para confirmar a existência desta enzima de membrana, microvilosidades foram purificadas por precipitação diferencial com cálcio. A enzima aminopeptidase foi utilizada como marcadora, uma vez que sabe-se que esta enzima é uma típica de membrana microvilar. Como a &#945;-manosidase solúvel é majoritária demos início a sua purificação e posterior caracterização. A sua purificação foi realizada utilizando uma combinação de quatro passos de cromatografia: Uma de troca iônica em Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), duas filtrações em gel, uma em Superdex 75 e outra em Superdex 200 (Amersham/Bioscience) usando o sistema AKTA, e o último passo é uma hidrofóbica em Phenyl Superose. Nós observamos a presença de dois picos de atividade nomeados de Man 1 e Man 2, sugerindo a existência de duas &#945;- manosidases solúveis, que se diferem quanto a hidrofobicidade. O pH ótimo das &#945;-manosidases é de 5,6 e sua massa molecular, determinada por cromatografia de 8 filtração em gel, é de 123 kDa, e no SDS-PAGE observamos uma única banda de 70 KDa, indicando a existência de duas subunidades. Em um gel nativo revelado com o substrato fluorescente (metilumbelliferil-&#945;-D-manopiranosídeo) nota-se somente uma banda de atividade. A Man 2 possui pI de 3,38. &#945;-manosidases de T. molitor seguem a cinética de Michaelis-Menten com Km para o substrato p-nitrofenil-&#945;-D-manopiranosídeo de 0,84 mM para Man 1 e 0,62 mM para Man 2. Também foram feitos ensaios de inibição com dois inibidores que sabidamente inibem carboidrases, um é o deoximanojirimicina e o outro é a swainsonina. O Ki encontrado para o primeiro inibidor foi de 0,12 mM para Man 1 e 0,15 mM para Man 2 e o Ki para o segundo inibidor foi de 67,8 nM para Man 1 e 63 nM para Man 2, sendo ambos inibidores competitivos. O fato destas enzimas serem inibidas apenas por Swainsonina em concentrações razoáveis, permite a sua classificação como tipo II. Isso sugere que elas são derivadas da forma lisossômica, embora apresente pH ótimo alterado. / Studies of intestinal function were prompted after noticing that the gut is a huge and relatively unprotected interface between the insect and the environment and can thus be used as a target for pest control. In this context, our work involves the purification and characterization of an soluble alpha-mannosidase and detection of a membrane &#945;-mannosidase. &#945;-Mannosidases are a family of exoglycosidases which hydrolyse &#945;-D-mannosyl residues from terminal non-reducing end of oligossacharides. These enzymes are implicated in the catabolism of carbohydrates and N-linked protein glycosylations in insects, but little is known on this biochemistry. T.molitor is a Coleoptera studied in our laboratory because of its relevance as agricultural pest and its position at a strategic point in the phylogenetic tree of insects. &#945;-Mannosidase is more active in the anterior and middle midgut content of T.molitor larvae, although there is a significant activity in the membrane fraction. To confirm the existence of this membrane enzyme, microvilli were purified by differential precipitation with calcium. Aminopeptidase was used as a marker, since it is known that it is a typical microvilar membrane enzyme. Most &#945;-mannosidase activity is soluble. This led us to purify this enzyme for further characterization. The purification of T. molitor &#945;-mannosidase was attained by using a combination of four chromatographic steps: an anion-exchange chromatography in Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), two gel filtration chromatographies, one in Superdex 200 and another in Superdex 75 (Amersham/Bioscience) using an AKTA system, and the last step is a Hydrophobic cromatography in Phenyl Superose. Two peaks of activity were resolved: Man 1 and Man 2, suggesting the existence of two soluble &#945;-mannosidases, differing only in hydrophobicity. The optimum pH of the &#945;- mannosidases is 5.6 and the molecular mass is 123 KDa determined by gel filtration and 70 KDa in the case of SDS PAGE. This suggests that the holoenzyme has two subunits. In a native gel revealed with the fluorescent substrate (methylumbelliferyl-&#945;-D-mannopyranoside) only one band of activity is seen. Man 2 has pI 3.38. T. molitor &#945;-mannosidases followed Michaelis-Menten kinetics with a Km value of 0.84 mM for Man 1 and 0.62 mM for Man 2 using p-nitrophenyl-&#945;-D-mannopyranoside as substrate. Inhibition tests were made with typical inhibitors of &#945;-mannosidases: one is the 1-deoxymannojirimycin and the other is the Swainsonine. The Ki for the first was of 0.12 mM for Man 1 and 0.15 mM for Man 2 and for the second was 67.8 nM for Man 1 and 63 nM for Man 2. Both were competitive inhibitors. The fact that the enzymes are inhibited only by swainsonine in reasonable concentrations, allows us to classify them as type II. This suggests that they are derived from the lysosomal form, although they have an altered optimum pH.

Os estudos da função intestinal foram particularmente estimulados após a conscientização de que o tubo digestivo é uma enorme interface relativamente pouco protegida entre o inseto e o meio ambiente e pode ser usado como alvo para controle de pragas. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma &#945;-manosidase solúvel e a detecção de uma &#945;-manosidase de membrana. As &#945;-manosidases pertencem a uma família de exoglicosidases as quais hidrolisam resíduos de &#945;-D-manosil a partir de terminais não redutores de oligossacarídeos. Estas enzimas são implicadas no catabolismo de carboidratos e na via de N-glicosilação protéica em insetos, mas pouco se sabe sobre a bioquímica destas glicosidases. O Tenebrio molitor é um Coleoptera bastante estudado pelo nosso laboratório devido a sua relevância como praga agrícola e o seu posicionamento em um ponto estratégico da árvore filogenética de insetos. O estudo de distribuição desta enzima mostrou que a &#945;-manosidase encontra-se, principalmente, como uma enzima solúvel no conteúdo anterior e médio do intestino médio, mas também existe uma atividade significante na fração de membrana. Para confirmar a existência desta enzima de membrana, microvilosidades foram purificadas por precipitação diferencial com cálcio. A enzima aminopeptidase foi utilizada como marcadora, uma vez que sabe-se que esta enzima é uma típica de membrana microvilar. Como a &#945;-manosidase solúvel é majoritária demos início a sua purificação e posterior caracterização. A sua purificação foi realizada utilizando uma combinação de quatro passos de cromatografia: Uma de troca iônica em Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), duas filtrações em gel, uma em Superdex 75 e outra em Superdex 200 (Amersham/Bioscience) usando o sistema AKTA, e o último passo é uma hidrofóbica em Phenyl Superose. Nós observamos a presença de dois picos de atividade nomeados de Man 1 e Man 2, sugerindo a existência de duas &#945;- manosidases solúveis, que se diferem quanto a hidrofobicidade. O pH ótimo das &#945;-manosidases é de 5,6 e sua massa molecular, determinada por cromatografia de 8 filtração em gel, é de 123 kDa, e no SDS-PAGE observamos uma única banda de 70 KDa, indicando a existência de duas subunidades. Em um gel nativo revelado com o substrato fluorescente (metilumbelliferil-&#945;-D-manopiranosídeo) nota-se somente uma banda de atividade. A Man 2 possui pI de 3,38. &#945;-manosidases de T. molitor seguem a cinética de Michaelis-Menten com Km para o substrato p-nitrofenil-&#945;-D-manopiranosídeo de 0,84 mM para Man 1 e 0,62 mM para Man 2. Também foram feitos ensaios de inibição com dois inibidores que sabidamente inibem carboidrases, um é o deoximanojirimicina e o outro é a swainsonina. O Ki encontrado para o primeiro inibidor foi de 0,12 mM para Man 1 e 0,15 mM para Man 2 e o Ki para o segundo inibidor foi de 67,8 nM para Man 1 e 63 nM para Man 2, sendo ambos inibidores competitivos. O fato destas enzimas serem inibidas apenas por Swainsonina em concentrações razoáveis, permite a sua classificação como tipo II. Isso sugere que elas são derivadas da forma lisossômica, embora apresente pH ótimo alterado. / Studies of intestinal function were prompted after noticing that the gut is a huge and relatively unprotected interface between the insect and the environment and can thus be used as a target for pest control. In this context, our work involves the purification and characterization of an soluble alpha-mannosidase and detection of a membrane &#945;-mannosidase. &#945;-Mannosidases are a family of exoglycosidases which hydrolyse &#945;-D-mannosyl residues from terminal non-reducing end of oligossacharides. These enzymes are implicated in the catabolism of carbohydrates and N-linked protein glycosylations in insects, but little is known on this biochemistry. T.molitor is a Coleoptera studied in our laboratory because of its relevance as agricultural pest and its position at a strategic point in the phylogenetic tree of insects. &#945;-Mannosidase is more active in the anterior and middle midgut content of T.molitor larvae, although there is a significant activity in the membrane fraction. To confirm the existence of this membrane enzyme, microvilli were purified by differential precipitation with calcium. Aminopeptidase was used as a marker, since it is known that it is a typical microvilar membrane enzyme. Most &#945;-mannosidase activity is soluble. This led us to purify this enzyme for further characterization. The purification of T. molitor &#945;-mannosidase was attained by using a combination of four chromatographic steps: an anion-exchange chromatography in Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), two gel filtration chromatographies, one in Superdex 200 and another in Superdex 75 (Amersham/Bioscience) using an AKTA system, and the last step is a Hydrophobic cromatography in Phenyl Superose. Two peaks of activity were resolved: Man 1 and Man 2, suggesting the existence of two soluble &#945;-mannosidases, differing only in hydrophobicity. The optimum pH of the &#945;- mannosidases is 5.6 and the molecular mass is 123 KDa determined by gel filtration and 70 KDa in the case of SDS PAGE. This suggests that the holoenzyme has two subunits. In a native gel revealed with the fluorescent substrate (methylumbelliferyl-&#945;-D-mannopyranoside) only one band of activity is seen. Man 2 has pI 3.38. T. molitor &#945;-mannosidases followed Michaelis-Menten kinetics with a Km value of 0.84 mM for Man 1 and 0.62 mM for Man 2 using p-nitrophenyl-&#945;-D-mannopyranoside as substrate. Inhibition tests were made with typical inhibitors of &#945;-mannosidases: one is the 1-deoxymannojirimycin and the other is the Swainsonine. The Ki for the first was of 0.12 mM for Man 1 and 0.15 mM for Man 2 and for the second was 67.8 nM for Man 1 and 63 nM for Man 2. Both were competitive inhibitors. The fact that the enzymes are inhibited only by swainsonine in reasonable concentrations, allows us to classify them as type II. This suggests that they are derived from the lysosomal form, although they have an altered optimum pH.

Lisozimas são enzimas que fazem parte do mecanismo de defesa contra bactérias, no entanto lisozimas com função digestiva também são encontradas no trato digestivo de vertebrados e no intestino médio de insetos. As lisozimas digestivas de insetos são do tipo c e assim compartilham semelhanças estruturais e mecanísticas com a lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL). Entretanto, para desempenhar sua função digestiva, as lisozimas de insetos apresentam algumas propriedades particulares entre as quais se destaca um pH ótimo mais ácido em relação às lisozimas não-digestivas. Para elucidar as bases moleculares dessa diferença no pH ótimo, duas lisozimas digestivas (lisozima 1 AAQ20048 e lisozima 2 AAQ20047) da larva de Musca domestica (mosca Diptera Cyclorrhapha), clonadas em Pichia pastoris e purificadas, foram caracterizadas estruturalmente e cineticamente com o substrato sintético (MUQ3) e natural (cápsulas de Micrococcus lysodeikticus). Foi observado que o efeito do pH na atividade das lisozimas 1 e 2 sobre o MUQ3 é uma curva com formato de sino e pH ótimo mais ácido que o da HEWL. Essas curvas foram reflexos da diminuição simultânea dos valores de pKas do nucleófilo e do doador de prótons. Estruturas cristalográficas das lisozimas digestivas de Musca domestica foram obtidas a 1,9 Å e análise comparativa com a estrutura terciária da HEWL revelou resíduos de aminoácidos no ambiente do nucleófilo (N46) e do doador de prótons (S106 e T107) que podem estar envolvidos na modulação das constantes de ionização dos resíduos essenciais à catálise. Esses resíduos foram substituídos via mutagênese sítio-dirigida por D, V e A respectivamente e três mutantes simples (N46D, S106V e T107A) e um triplo (N46DS106V- T107A) foram produzidos e purificados. Caracterização revelou que as contribuições individuais da N46, S106 e T107 foram pequenas e próximas do limite de detecção da técnica utilizada. Por outro lado, o conjunto dos 3 aminoácidos foi responsável pelo pH ótimo ácido frente ao substrato sintético, elevando os valores de pKas do nucleófilo e doador de prótons para valores muito semelhantes ao da HEWL. Diferentemente, essa tripla mutação não foi suficiente para elevar o pH ótimo da lisozima 2 sobre cápsulas de Micrococcus lysodeikticus para valores próximos àqueles de HEWL, sugerindo que as bases moleculares do pH ótimo frente ao substrato natural e sintético são diferentes. Uma comparação estrutural entre lisozima 1 e HEWL sugere que os resíduos de aminoácidos carregados na superfície dessas lisozimas sejam importantes para determinação do pH ótimo. A investigação dessa hipótese foi feita substituindo 5 aminoácidos neutros e 1 ácido, via mutagênese sítio-dirigida, por resíduos básicos. A caracterização do mutante sêxtuplo revelou um aumento significativo nos valores de pH ótimo da lisozima 1, indicando que a redução da basicidade da superfície das lisozimas digestivas é determinante para seus pHs ótimos ácidos. / Lysozymes are enzymes that are part of the defence mechanism against bacteria, however lysozymes with digestive function are also found in the digestive tract of vertebrates and in the insect midgut. The digestive lysozymes from insects are c type, so they share similar structural and mechanistic characteristics with hen egg-white lysozyme (HEWL). However, to perform their digestive function, insect lysozymes present some particular properties among them a more acidic pH optimum than that of non-digestive lysozymes. To elucidate the molecular basis of this pH optimum difference, two digestive lysozymes (lysozyme 1 AAQ20048 and lysozyme 2 AAQ20047) from Musca domestica larvae (housefly Diptera Cyclorrhapha), cloned in Pichia pastoris and purified, were structurally and kinecticly characterized with synthetic (MUQ3) and natural (lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus) substrates. It was observed that the pH effect on the activity of lysozymes 1 and 2 upon MUQ3 is a bell shaped curve exhibiting a more acidic pH optimum than that of HEWL. These curves result from simultaneous decrease of pKas values of the nucleophile and proton donor. Crystallographic structures of these digestive lysozymes from Musca domestica were obtained at 1.9 Å and comparative analysis with the terciary structure of HEWL revealed amino acid residues in the catalytic nucleophile (N46) and proton donor environment (S106 and T107) that may be involved in the modulation of ionization constants of those catalytic residues. N46, S106, and T107 were replaced via site-directed mutagenesis by D, V and A respectively and three simple (N46D, S106V and T107A) and one triple (N46D-S106V-T107A) mutants were produced and purified. Their characterization revealed that the individual contributions of N46, S106 and T107 were small and close to the detection borderline of the technique utilized. On the other hand, a set of these 3 amino acids was responsible by acidic pH optimum upon synthetic substrate, increasing the pKas values of nucleophile and proton donor to similar values to that of the HEWL. Differently, this triple mutation was not enough to increase the pH optimum of lysozyme 2 upon lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus to values close to those of HEWL, suggesting that the molecular bases of pH optimum upon natural and synthetic substrates are different. A structural comparison between lysozyme 1 and HEWL suggests that the charged amino acid residues on the surface of these lysozymes are important for pH optimum determination. The investigation of this hypothesis was done replacing 5 neutral and 1 acidic amino acids, via site-directed mutagenesis, by basic residues. The characterization of this mutant revealed a significant increase in the pH optimum values of lysozyme 1, suggesting that the reduction of basicity on the surface of the digestive lysozymes is a important factor in the determination of their acidic pH optimum.