Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-06-21T18:51:44Z No. of bitstreams: 1 AntonioCarlosSilveiraMarcolinoDissertacao2016.pdf: 6156292 bytes, checksum: d429c57126e7bc2351ea9c3c48c300ab (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-06-21T18:51:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AntonioCarlosSilveiraMarcolinoDissertacao2016.pdf: 6156292 bytes, checksum: d429c57126e7bc2351ea9c3c48c300ab (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-21T18:51:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AntonioCarlosSilveiraMarcolinoDissertacao2016.pdf: 6156292 bytes, checksum: d429c57126e7bc2351ea9c3c48c300ab (MD5) Previous issue date: 2016-03-29 / The guanylate cyclase activator 2B, also known as uroguanylin, is part of the guanylin peptide family, which includes peptides such as guanylin and lymphoguanylin. The guanylin peptides are related to sodium absorption inhibition and water secretion induction. Uroguanylin may be related to various pathologies such as chronic renal failure, congestive heart failure and nephrotic syndrome. Uroguanylin mutations have already been associated with essential hypertension. However, there are no studies on the structural changes in the uroguanylin???s protein that used single nucleotide polymorphisms through the use of molecular dynamics simulations. This study used 16 in silico SNP impact prediction tools to evaluate non synonymous SNPs and to select mutations considered as convergent deleterious, which were further analyzed through long time molecular dynamics simulations of 1 microsecond of duration. The results of the molecular dynamics simulations suggest that all SNPs considered as convergent deleterious suffered some kind of structural change, however, four of these nsSNPs have also undergone flexibility changes, possibly resulting in functional changes. / O ativador guanilato ciclase 2B, tamb??m conhecido como uroguanilina, faz parte da fam??lia de pept??deos da guanilina, a qual inclui pept??deos como a guanilina e a linfoguanilina. Os pept??deos da guanilina est??o ligados ?? inibi????o da absor????o de s??dio e indu????o da secre????o de ??gua. A disfun????o da uroguanilina est?? relacionada ao desenvolvimento de v??rias patologias, como insufici??ncia renal cr??nica, insufici??ncia card??aca congestiva e s??ndrome nefr??tica. Muta????es na uroguanilina tamb??m j?? foram associadas ?? hipertens??o essencial. Entretanto, n??o existem estudos sobre a utiliza????o de simula????es por din??mica molecular para avaliar o impacto estrutural causado por nsSNPs presentes no gene codificador da prote??na uroguanilina. Este estudo utilizou 16 ferramentas in silico de predi????o de impacto de nsSNPs para filtrar nsSNPs convergentes delet??rios para posterior an??lise por simula????es por din??mica molecular de longa dura????o (1 microssegundo de dura????o). Os resultados das simula????es por din??mica molecular sugerem que todos os nsSNPs considerados como convergentes delet??rios sofreram algum tipo de altera????o estrutural, por??m, quatro destes SNPs tamb??m sofreram altera????es de flexibilidade, possivelmente resultando em altera????es funcionais.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-29T13:51:27Z No. of bitstreams: 1 DIS_CARLOS_EDUARDO_SEQUEIROS_BORJA_PARCIAL.pdf: 2369724 bytes, checksum: 0bcf4fe536f9f8fc084f08e3dc335db9 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-29T13:51:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DIS_CARLOS_EDUARDO_SEQUEIROS_BORJA_PARCIAL.pdf: 2369724 bytes, checksum: 0bcf4fe536f9f8fc084f08e3dc335db9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T13:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_CARLOS_EDUARDO_SEQUEIROS_BORJA_PARCIAL.pdf: 2369724 bytes, checksum: 0bcf4fe536f9f8fc084f08e3dc335db9 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Protein structure prediction from just the amino acid sequence continues to be a major challenge in structural bioinformatics. If at all possible, prediction needs to be accurate and fast. In this project, it is proposed and tested the effects of cotranslation within an ideal ribosomal channel model in protein structure prediction using classical molecular dynamics and replica-exchange molecular dynamics simulations. An ideal ribosomal channel model was built, different translation speeds were used and compared the results to control simulations. Different translation speeds were tested to verify their influence on predictions, and the best results were observed at translation speeds between 80 and 200 ps. The quality of the predicted models were as low as 0.3 ? and 1.0 for the RMSDs and GDT-TS parameters, respectively, for simulations of just 50 ns. Overall, the use of this approach to protein structure prediction has successfully produced native and near-native structures in three of the four proteins investigated, thus reaching accuracy and speed as expected. As a conclusion, using cotranslation within an IRCM is a promising approach to predict native-like 3D structures of mini-proteins successfully. Improvements to the methodology should allow the prediction of 3D structures of larger proteins of biological and biomedical interest. / A predi??o de estrutura 3D de prote?nas partindo apenas da sequ?ncia de amino?cidos ainda ? um grande desafio em bioinform?tica estrutural. Apesar da dificuldade, a predi??o precisa de ser acurada e r?pida. Nesta disserta??o, prop?e-se e mesuram-se os efeitos da co-tradu??o e o uso de um modelo ideal de canal ribossomal na predi??o da estrutura 3D de prote?nas, fazendo uso de din?mica molecular cl?ssica e din?mica molecular com intercambio de r?plicas. O modelo do canal ribosomal constru?do foi testado com diferentes velocidades de tradu??o, e os resultados foram comparados com simula??es padr?o. Foram testadas diferentes velocidades de tradu??o para verificar sua influ?ncia nas predi??es, e as velocidades que apresentaram os melhores resultados ficaram na faixa de 80 at? 200 ps. A qualidade dos modelos preditos foram boas, apresentando valores de GDT-TS de 1,0, assim como 0,3 ? para RMSD para simula??es de apenas 50 ns. No geral, demostra-se que o uso desta abordagem na predi??o da estrutura de prote?nas, produz satisfatoriamente estruturas nativas ou perto da nativa em tr?s de quatro prote?nas testadas, atingindo assim a acur?cia e velocidade esperadas. Como conclus?o, o uso da co-tradu??o com um modelo do canal ribosomal ? uma abordagem promissora para a predi??o de estruturas de mini prote?nas perto da estrutura nativa. Melhoras na metodologia e no modelo permitir?o uma predi??o de estruturas 3D de prote?nas maiores de interesse biol?gico e biom?dico.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 466225.pdf: 8821107 bytes, checksum: 29eac7664f9d5e8636f822b7baf681b7 (MD5) Previous issue date: 2015-03-04 / In this work, molecular dynamics (MD) simulations were carried out to study the ion-irradiation induced effects on ultrathin molecular films. The energy deposited by the ions is computationally simulated using a simple thermal spike with particles interacting via the Lennard-Jones potential. It was investigated the effect of thin and ultrathin (2 60 nm) films thickness variation in the dimensions of the defects created on the surface crater s diameter (Dc) and depth (Cd) and ridge (rim) volume. Crystalline and amorphous systems were modeled, and different radius and temperature combinations were investigated for the simulated cylindrical track. Qualitative and quantitative results obtained from crystalline and amorphous samples were compared. The analysis of the system s dynamics after the track energy got transferred into atomic motion allowed to identify the mechanisms responsible for the formation of the surface defects. Crater size is mostly determined by evaporation and melt flow from the hot track, while the rim size is determined both by melt flow and coherent displacement of particles due to the large pressure developed in the excited track. We find a large dependence on the dimensions of the surface defects, and in the number of sputtered particles, with the film thickness (h) below a critical value hcr?tico. The critical thickness for the rim volume, more sensitive to the confinement of the film, was found to be higher than the hcr?tico for Dc, since mechanisms involved in the formation of both effects are different. Also from a critical h on, the sputtering yield got smaller as the film thickness decreased. The sputtered particles depth of origin zorigem was obtained as a function of h. As a result from simulations with amorphous films it was obtained zorigem<h/2. Results from simulations were compared to recent experimental data. / Neste trabalho, simula??es por din?mica molecular (MD) foram empregadas para estudar efeitos induzidos pela irradia??o i?nica de alta energia em filmes moleculares ultrafinos. A energia depositada pelos ?ons ? computacionalmente simulada usando um modelo simples de thermal spike com part?culas interagindo pelo potencial de Lennard-Jones. Foi investigado o efeito da varia??o da espessura de filmes ultrafinos (2 60 nm) nas dimens?es dos defeitos criados na superf?cie - di?metro (Dc) e profundidade (Cd) da cratera e volume da protuber?ncia (rim). Foram modelados sistemas cristalino e amorfo, e investigadas diferentes combina??es de raio e temperatura da trilha de excita??o gerada pelos ?ons. Os resultados qualitativos e quantitativos obtidos usando os s?lidos cristalino e o amorfo foram comparados. A an?lise da din?mica do sistema ap?s a energia da trilha i?nica ser transferida para movimento at?mico permitiu identificar os mecanismos respons?veis pela forma??o dos defeitos de superf?cie. O tamanho da cratera ? determinado principalmente pela eje??o de material e pelo fluxo de material fundido da trilha superaquecida, enquanto o rim tem origem tanto no fluxo de material derretido quanto no deslocamento coerente de um pulso de press?o oriundo do centro da trilha excitada. Foi encontrada uma forte depend?ncia entre as dimens?es dos defeitos de superf?cie, e no n?mero de part?culas ejetadas (sputtering), quando a espessura do filme (h) ? menor que um valor cr?tico hcr?tico. A espessura cr?tica para o volume do rim, mais sens?vel ao confinamento do filme, foi maior que para o Dc, devido aos diferentes mecanismos envolvidos. O sputtering foi cada vez menor com a redu??o de h a partir tamb?m de um valor cr?tico de h. Tamb?m foram obtidas a profundidade de origem zorigem das part?culas ejetadas, e o sputtering em fun??o de h. Para os filmes amorfos se obteve zorigem<h/2. Resultados das simula??es foram comparados com dados experimentais recentes. Os melhores resultados das simula??es obtiveram ?tima correla??o qualitativa para Dc e para o volume do rim.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 391202.pdf: 2565991 bytes, checksum: a1f131e3f03bd916c91d19ddca5c04ff (MD5) Previous issue date: 2007-03-30 / O desenho de drogas assistido por computador (CADD) ? um processo que envolve a execu??o seq?encial de diferentes programas, no qual ? testado se um determinado ligante (pequena mol?cula) interage bem com um receptor (geralmente uma prote?na ou enzima). Esse processo geralmente ? executando com o aux?lio de shell scripts. Por?m a modifica??o dos par?metros de entrada e an?lise dos resultados nesse tipo de abordagem ? uma tarefa complexa e que consome muito tempo. Al?m disso, para considerar a flexibilidade do receptor durante experimentos de docking, ? necess?rio que se utilize milhares de snapshots do receptor. Neste trabalho, esses snapshots s?o obtidos da trajet?ria de simula??es por din?mica molecular do receptor. Devido aos desafios associados ? manipula??o desse grande n?mero de snapshots do receptor e ? necessidade de um melhor controle sobre os diferentes programas associados a esse processo, esse trabalho apresenta um workflow cient?fico para automa??o do processo de desenvolvimento de drogas assistido por computador, incluindo de forma expl?cita a flexibilidade do receptor. Os softwares JAWE e Shark foram utilizados para modelar e executar respectivamente o workflow. Mesmo com essa automa??o no processo, ainda h? problemas relacionados ao n?mero de snapshots do receptor que deve ser utilizado. O tempo necess?rio para a execu??o de experimentos de docking, considerando aproximadamente tr?s mil snapshots do receptor, ? em torno de 500 horas. Para simplificar e agilizar esse processo, foi desenvolvida uma forma de sele??o de snapshots baseado na energia livre de liga??o (FEB). Assim, durante os experimentos de docking, chamados de docking seletivo, somente uma parte dos snapshots s?o utilizados: aqueles que obtiveram os melhores resultados de intera??o em termos de FEB durante um experimento exaustivo com um determinado ligante. Para validar essa implementa??o e sele??o, foram executados experimentos de docking com a enzima InhA de M. tuberculosis como receptor e cinco ligantes diferentes. Os resultados desses experimentos ilustram a efici?ncia do workflow implementado e da forma de sele??o de snapshots do receptor que est? sendo realizada

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 401338.pdf: 18195711 bytes, checksum: 8003c4d1e35f169f386872ae3d70499f (MD5) Previous issue date: 2008-03-19 / Considerando que alguns fatores de transcri??o da fam?lia ETS regulam, crescimento, apoptose, angiog?nese e genes relacionados a met?stase em c?lulas tumorais, n?s propomos modelos tridimensionais de dom?nios ETS (ETV- 2, SPI-C and NERF) aplicando t?cnicas de modelagem molecular por homologia e utilizando estruturas de cristais de Ets humana-DNA como template. Estes modelos ser?o ?teis para estabelecer semelhan?as estruturais entre duas ou mais mol?culas relacionadas. A obten??o destes detalhes estruturais das intera??es entre prote?na e DNA fornecer? pistas sobre suas consforma??es dos complexos bin?rios Ets-DNA, que podem a vir tornar alvos moleculares para o desenvolvimento de f?rmacos seletivos para o tratamento de c?ncer no futuro

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 416580.pdf: 11493064 bytes, checksum: d98f0a91360e40632c453a5a2de9275f (MD5) Previous issue date: 2009-07-21 / Esta pesquisa refere-se a um estudo computacional via simula??o por din?mica molecular (DM) que investiga os efeitos da temperatura na InhA, enzima 2-trans-enoil-ACP (CoA) redutase do Mycobacterium tuberculosis (MTB). A temperatura pode interferir na estrutura e fun??o prot?icas, na habilidade de liga??o de uma prote?na, na distribui??o dos microestados, na conforma??o molecular m?dia e nas rea??es enzim?ticas. A partir do in?cio do s?culo XX, os experimentos in silico tem sido cada vez mais utilizados para auxiliar na compreens?o e comprova??o das hip?teses te?ricas elaboradas em diversas ?reas da ci?ncia. Neste contexto, a simula??o por din?mica molecular (DM) tem sido uma das t?cnicas da biof?sica molecular computacional utilizadas no estudo da varia??o das propriedades estruturais do estado nativo das prote?nas e no planejamento e design de f?rmacos. Esta pesquisa investigou o efeito da temperatura sobre a enzima 2-trans-enoil-ACP (CoA) redutase (InhA) atrav?s de um estudo por simula??o pela DM (SDM). A enzima InhA ? um importante alvo para a isoniazida (INH), um dos f?rmacos utilizados no tratamento da tuberculose (TBC). O complexo enzim?tico InhA-NADH foi submetido a uma SMD a 25 ?C (298 K) e outra a 37 ?C (310 K) durante um per?odo de 20 ns. A temperatura de 37 ?C foi escolhida por corresponder ? temperatura corporal humana. Por outro lado, 25 ?C representa a temperatura ambiente utilizada nos experimentos realizados em condi??es normais de temperatura e press?o (NTP). Alguns par?metros iniciais (desvio m?dio quadr?tico, raio de giro, superf?cie acess?vel ao solvente) foram obtidos a partir da an?lise dos dados das duas trajet?rias. Existem diferen?as conformacionais estatisticamente significativas entre as estruturas 3D resultantes das SDM a 25 ?C e 37 ?C. Tamb?m pesquisou-se o efeito da temperatura sobre a flexibilidade molecular. Enquanto observamos um importante aumento da flexibilidade na regi?o de liga??o do vi substrato (al?a A, al?a B e al?a de liga??o do substrato) aos 37 ?C, as h?lices &#945;6, &#945;7 e &#945;2 apresentaram Fatores-B menores na temperatura corporal humana. Na regi?o do s?tio de liga??o da coenzima, apenas tr?s res?duos (Ser20, Ile21 e Phe41) apresentaram uma menor flexibilidade com o aumento da temperatura. Pequenos aumentos de temperatura afetam significativamente a conforma??o de uma prote?na em regi?es importantes para o desempenho de suas fun??es. A eleva??o da temperatura aumenta a flexibilidade da estrutura prot?ica, por?m de forma heterog?nea, preservando regi?es que necessitam de maior estabilidade no aspecto funcional. As n?tidas modifica??es da enzima InhA e sua coenzima NADH durante um processo de altera??o de temperatura de 25 ?C para 37 ?C devem ser consideradas no decorrer do planejamento e design de qualquer f?rmaco. O conhecimento detalhado das estruturas alvo, portanto, deve levar em conta as condi??es ambientais (press?o, temperatura, pH) ?s quais ser?o submetidas em in vivo. Sugerem-se, para o futuro, pesquisas com temperaturas maiores e trabalhos com docking.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-06T11:52:23Z No. of bitstreams: 1 AllanPiresdaSilvaDissertacao2017.pdf: 4098983 bytes, checksum: 94ec346f3edc58586d44cec31a8597f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-06T11:52:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AllanPiresdaSilvaDissertacao2017.pdf: 4098983 bytes, checksum: 94ec346f3edc58586d44cec31a8597f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T11:52:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AllanPiresdaSilvaDissertacao2017.pdf: 4098983 bytes, checksum: 94ec346f3edc58586d44cec31a8597f4 (MD5) Previous issue date: 2017-03-14 / Currently, various bacteria can be harmful to human health. Moreover, with continued use of antibiotics and development of resistance by these microorganisms, many infections became worrying, with no effective treatments available generating the need for development of other fighting molecules. In this context, the antimicrobial peptides (AMPs) have been proposed as an alternative in the control of infections caused by resistant microorganisms. Despite the variation in sequence levels, AMPs may present high structural conservation in specific families, especially peptides stabilized by disulfide bonds. Canonically, the identification of PAMs is by exploitation of bioactive natural extracts and subsequent analysis and purification thereof. In the post genomics era, in turn, identifying PAMs could be made from databases using molecular modeling of peptides in direct search. In this work were selected AMPs without structure in PDB, from antimicrobial peptide database (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). The sequences were pre-filtered, being selected two AMPs (myticin B and MiAMP-2b) of classes described with modifications in disulfide bonds pattern arrangement. Additionally, the original bank was submitted to STPs identification. PredSTP was used as an additional evaluation. After prefiltering phases, a new potential STP (CRS4C-2b) with a new hypothetical structural topology was modelled by QUARK and simulated at 300 ns molecular dynamics, maintaining the initial structure. The methodology was then applied to identify PAMs in the Zantedeschia aethiopica transcriptome where two new potential PAMs were found that were predicted to be active by CAMP. Thus, the two methodologies developed here can be successfully applied in the identification of new PAMs and in the analysis of the structural diversity of antimicrobial families. / Atualmente, v??rias bact??rias podem ser prejudiciais ?? sa??de humana. Al??m disso, com o uso cont??nuo de antibi??ticos, e desenvolvimento de resist??ncia por parte desses microrganismos, muitas infec????es se tornaram preocupantes, sem tratamentos eficazes dispon??veis gerando a necessidade de desenvolvimento de outras mol??culas de combate. Nesse ??mbito, os pept??deos antimicrobianos (PAMs) t??m sido propostos como uma alternativa no controle de infec????es causadas por microrganismos resistentes. Apesar da variabilidade nas sequ??ncias, os PAMs podem apresentar grande conserva????o estrutural em fam??lias espec??ficas, principalmente em pept??deos estabilizados por pontes dissulfeto. De forma can??nica, a identifica????o de PAMs se d?? pela explora????o de extratos naturais bioativos e posterior an??lise e purifica????o dos mesmos. Na era p??s-gen??mica, por sua vez, a identifica????o de PAMs pode ser feita a partir de bancos de dados utilizando modelagem molecular na busca direta de pept??deos. Nesse trabalho foram selecionados PAMs sem estrutura no PDB, a partir do banco de dados de pept??deos antimicrobianos (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). Desta forma, as sequ??ncias foram pr??-filtradas, sendo selecionados dois PAMs (miticina B e MiAMP-2b) de classes descritas com varia????o na disposi????o ou padr??o de pontes dissulfeto. Al??m disso, o banco original foi submetido ?? identifica????o de STPs. Para tal, o servidor PredSTP foi utilizado como avalia????o adicional. Ao final das etapas de pr??-filtragem, um novo potencial STP (CRS4C-2b) com uma nova topologia estrutural foi modelado pelo QUARK e simulado em din??mica molecular, mantendo a estrutura inicial. A metodologia foi ent??o aplicada para identifica????o de PAMs no transcriptoma de Zantedeschia aethiopica onde foram encontrados dois novos potenciais PAMs que foram preditos como ativos pelo CAMP. Dessa forma, as duas metodologias desenvolvidas aqui podem ser aplicadas com sucesso na identifica????o de novos PAMs e na an??lise de diversidade estrutural de fam??lias antimicrobianas.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-09-28T14:16:27Z No. of bitstreams: 1 DIS_NATHAN_WILLIG_LIMA_COMPLETO.pdf: 3138188 bytes, checksum: 8747fa72c84172dbac724ce570075b26 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T14:16:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_NATHAN_WILLIG_LIMA_COMPLETO.pdf: 3138188 bytes, checksum: 8747fa72c84172dbac724ce570075b26 (MD5) Previous issue date: 2016-08-08 / In this work, molecular dynamics simulations of thin organic films irradiated by fast heavy ions were implemented. In order to represent the ion energy deposition, it was used a Thermal Spike Model, in which the ion track is represented as a cylindrical region with high temperature. Two papers were submitted for publication based on this study. In the first paper, it was studied the impact of film thickness and the ion energy in the topological effects of radiation (such as crater diameter, crater depth and rim volume) and in the sputtering, comparing the results for a crystalline and amorphous solids modeled by the Lennard-Jones potential. In the second paper, the FENE potential was implemented to build samples with molecular chains. The ionic radiation effects were then compared between films with molecular chains (modeled by the FENE potential) and without molecular chains (using the Lennard-Jones potential). In both works, the effects of radiation were explained by analyzing the different mechanisms of energy dissipation: evaporation, melt flow and plastic deformation. Our results show that radiation effects are strongly determined by film thickness. The simulations with FENE potential show that the presence of molecular chains reduces significantly the effects of radiation. In solids thinner than the mean gyration radius of the sample, there was not any radiation effect, indicating that the effect reduction is related not only to the decreasing of mobility but also to molecular conformation and entanglement. / Nesse trabalho foram realizadas simula??es computacionais por din?mica molecular de filmes finos org?nicos irradiados por ?ons pesados e r?pidos. Para representar a deposi??o de energia pelo ?on foi utilizado o Modelo de Thermal Spike, atrav?s do qual a trilha i?nica ? representada como uma regi?o cil?ndrica de alta temperatura ao longo do material. Dois artigos foram submetidos para publica??o a partir desse estudo. No primeiro artigo, o impacto da espessura do filme e da energia do ?on incidente nos efeitos topol?gicos da radia??o (como di?metro da cratera, profundidade da cratera e volume da protuber?ncia) e do sputtering foram investigados, comparando-se os resultados de s?lidos cristalinos e amorfos modelados pelo potencial de Lennard-Jones. No segundo artigo, o potencial FENE foi implementado para construir amostras com cadeias moleculares. Os efeitos da radia??o i?nica foram ent?o comparados entre os filmes com cadeias moleculares (modelados pelo potencial FENE) e filmes sem cadeias moleculares (modelados com o potencial de Lennard-Jones). Em ambos os trabalhos, os efeitos da radia??o foram explicados verificando-se os diferentes mecanismos de dissipa??o de energia: evapora??o, melt flow e deforma??o pl?stica. Nossos resultados mostram que os efeitos da radia??o s?o fortemente impactados pela espessura do filme. As simula??es com o potencial FENE mostram que a presen?a de cadeias moleculares reduz significativamente todos os efeitos da radia??o. Para s?lidos mais finos que o raio de gira??o m?dio das mol?culas, nenhum efeito da radia??o foi observado, indicando que a redu??o dos efeitos est? relacionada n?o s? ? diminui??o de mobilidade, mas tamb?m ? conforma??o e emaranhamento molecular.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 456553.pdf: 3406463 bytes, checksum: 401e17a9aecc3c36095588e483dd1282 (MD5) Previous issue date: 2014-03-12 / The causative agent of tuberculosis (TB), Mycobacterium tuberculosis, infects one-third of the world population. The World Health Organization estimates that 8.6 million new TB cases occurred in 2012, resulting in 1.3 million deaths worldwide. Thus, there is a continuous need to find promising molecular targets for the development of anti-TB agents and to identify pathogenic determinants associated with M. tuberculosis virulence aiming the development of attenuated mutant strains as new vaccine candidates against TB. Enzymes involved in purine and pyrimidine biosynthesis have important roles in cellular metabolism, as they provide nucleotides that are essential components of a number of essential biomolecules. Cytidine deaminase (CDA) catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine to uridine, and belongs to the pyrimidine salvage pathway. The CDA from M. tuberculosis (MtCDA) is a target for the development of attenuated strains of M. tuberculosis because it may be involved in mechanisms of pathogenicity such as latency. This work presents the crystal structures of MtCDA in complex with uridine (2.4 ? resolution) and deoxyuridine (1.9 ? resolution). Molecular dynamics (MD) simulation was performed to analyze the physically relevant motions involved in the protein ligand recognition process, showing that structural flexibility of some residues are important to product binding. In addition, MD simulations allowed the analysis of the stability of tetrameric MtCDA structure. The role of the conserved glutamate-47 (E47) residue was evaluated by construction of five mutant proteins (E47A, E47D, E47L, E47H, and E47Q). Mutants E47A and E47H were expressed in insoluble fraction, whereas E47D, E47L and E47Q were soluble and purified by HPLC. The E47D, E47L and E47Q mutants contained 1 mol of Zn2+ per mol of protein subunit. These mutations had no effect on oligomerization state of MtCDA. Steady-state kinetic results showed that KM values for the E47D and E47Q mutants were not significantly altered, whereas there was a decrease in kcat values of 37-fold for E47D and 19-fold for E47Q mutant. No activity could be detected for E47L mutant. The crystal structure of the E47D mutant was solved by X-rays diffraction, using synchrotron light. An essential role was proposed for the ?-carboxyl group of E47, and its involvement in the catalityc process. On the other hand, an important part of drug and vaccine development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this way the knockout of the cdd gene was performed in order to evaluate the importance of the cdd gene for mycobacteria growth in vitro and in vivo. Our results suggest that cdd gene is not an essential gene for in vitro growth under the employed experimental conditions. Infection in mice with the knockout strain of cdd gene has shown a significant reduction in the CFU s in lungs and spleen of the infected animals. Futher experiments are under way to confirm such findings. Finally, results from enzymatic characterization, site directed mutagenesis and gene replacement may be the starting point for a better understanding about the role of cytidine deaminase in M. tuberculosis metabolism and open up the possibility for a rational design of attenuated strain, that may be useful for future development of a new vaccine candidate against human TB. / O agente causador da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis, infecta um ter?o da popula??o mundial. A Organiza??o Mundial da Sa?de estima que 8,6 milh?es de novos casos de tuberculose ocorreram em 2012, resultando em 1,3 milh?es de mortes no mundo. Assim, existe uma necessidade cont?nua de encontrar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-tuberculose e identificar determinantes de virul?ncia associados com a patog?nese de M. tuberculosis, visando a obten??o de cepas mutantes atenuadas como candidatas a novas vacinas contra a tuberculose. As enzimas envolvidas na bios?ntese de purina e pirimidina t?m pap?is importantes no metabolismo celular, uma vez que proporcionam nucle?tidos, os quais s?o componentes essenciais de um grande n?mero de biomol?culas. A enzima Citidina deaminase (CDA) catalisa a desamina??o hidrol?tica da citidina a uridina, e faz parte da via de salvamento das pirimidinas. A CDA de M. tuberculosis (MtCDA) devido a sua n?o essencialidade pode ser um alvo interesante para a obten??o de cepas atenuadas para o desenvolvimento de vacinas auxotr?ficas contra a tuberculose, j? que pode estar envolvido nos mecanismos de invas?o e lat?ncia. No presente trabalho s?o apresentadas as estruturas cristalogr?ficas da MtCDA em complexo com uridina (2,4 ? de resolu??o) e deoxiuridina (1,9 ? de resolu??o). Simula??o da Din?mica Molecular (MD) foi realizada com o prop?sito de analisar os movimentos fisicamente relevantes envolvidos no processo do reconhecimento prote?na-ligante, e mostra que a flexibilidade estrutural de algumas regi?es da prote?na s?o importantes para a liga??o do produto. Al?m disso, simula??es MD permitiram a an?lise da estabilidade da estrutura tetram?rica da MtCDA. O papel do res?duo conservado glutamato 47 (E47) foi avaliado mediante a constru??o de cinco prote?nas mutantes (E47A, E47D, E47L, E47H, e E47Q). Os mutantes E47A e E47H foram expressos na fra??o insol?vel, enquanto E47D, E47L e E47Q foram expressas na fra??o sol?vel e purificadas por cromatografia l?quida de alta performance (HPLC). Os mutantes E47D, E47L e E47Q continham 1 mol de Zn2+ por mol de subunidade de prote?na. Estas muta??es n?o tiveram efeito sobre o estado de oligomeriza??o da MtCDA. Resultados cin?ticos em estado estacion?rio mostraram que os valores de KM para os mutantes E47D e E47Q n?o foram alterados significativamente, enquanto houve uma redu??o nos valores de kcat de 37 vezes para E47D e 19 vezes para a mutante E47Q. N?o foi detectada qualquer atividade para a mutante E47L. A estrutura cristalogr?fica do mutante E47D foi resolvida por cristalografia de raios-X o que nos permitiu propor um papel catal?tico para o grupo ?-carboxila do residuo E47, sugerindo o envolvimento de um pr?ton na cat?lise. Por outro lado, uma parte essencial para o desenvolvimento de novos f?rmacos e vacinas, ? a identifica??o de produtos de genes que s?o fundamentais para o crescimento e a sobreviv?ncia bacteriana in vitro e in vivo. Desta forma, foi realizado o nocaute do gene cdd a fim de avaliar a import?ncia deste gene para o crescimento do bacilo em vida livre e em condi??es de estresse (vida intracelular). Nossos resultados sugerem que o gene cdd n?o ? um gene essencial para o crescimento do bacilo in vitro sob as condi??es experimentais utilizadas. Experimentos de infec??o em camundongos com a cepa nocaute do gene cdd mostraram uma significativa redu??o nas UFC s determinadas no pulm?o e ba?o dos animais infectados. Con tudo, experimentos de crescimento in vitro e infec??o em camundongos est?o sendo realizados a fim de confirmar os resultados obtidos. Os resultados da caracteriza??o enzim?tica e substitui??o g?nica s?o o ponto de partida para o melhor entendimento sobre o papel da enzima no metabolismo de nucleot?deos em M. tuberculosis, al?m de abrirem a possibilidade para o desenho racional de uma cepa atenuada, ?til para o futuro desenvolvimento de uma nova candidata a vacina contra a tuberculose humana

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-05-26T17:50:16Z No. of bitstreams: 1 TES_MARIANE_ROTTA_PARCIAL.pdf: 2374056 bytes, checksum: 0b798c90ce9ab78e6edbfeb524d79d97 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-26T17:50:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_MARIANE_ROTTA_PARCIAL.pdf: 2374056 bytes, checksum: 0b798c90ce9ab78e6edbfeb524d79d97 (MD5) Previous issue date: 2016-12-19 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / The cellular milieu is a complex and crowded aqueous solution. It is thus expected that this large concentration of macromolecules causes deviations from solution ideality. To mimic the intracellular environment, crowding effects are commonly studied in vitro using crowding agents. The aim of the present study was to evaluate the effects of macromolecular synthetic crowding agents on the apparent steady-state kinetic parameters (Km, kcat, and kcat/Km) for the chemical reaction catalyzed by 2-trans-enoyl-ACP (CoA) from Mycobacterium tuberculosis (InhA). The results showed that ficoll 70, ficoll 400, and dextran 70 had negligible effects on InhA activity in the range of concentrations used. On the other hand, a complex effect was observed for PEG 6000. Sucrose, which was employed in control experiments, decreased both the kcat/Km values for NADH and kcat for 2-trans-dodecenoyl-CoA (DD-CoA) substrate in a concentration-dependent manner. Molecular dynamics results suggest that InhA adopts a more compact conformer in sucrose solution, which likely accounts for the steady-state kinetic results. The presence of crowding agents appears to alter the relative abundance of different conformers of InhA in solution. The effects of the crowding agents on the energy (Ea and E?), enthalpy (?H#), entropy (?S#), and Gibbs free energy (?G#) of activation were determined. The ?G# values for all crowding agents tested were similar to dilute buffer, suggesting that excluded volume effects did not facilitate stable activated ES# complex formation. Nonlinear Arrhenius plot for PEG 6000 suggests that "soft" interactions may play a role in macromolecular crowding effects. / O meio intracelular ? uma solu??o aquosa complexa, pois ? preenchida por diversos tipos de macromol?culas. Espera-se que essa grande concentra??o de macromol?culas resulte em um comportamento n?o ideal para a solu??o. Para mimetizar o ambiente intracelular, os efeitos do da ocupa??o macromolecular s?o comumente estudados in vitro utilizando agentes de crowding. O objetivo central do presente estudo ? avaliar os poss?veis efeitos de agentes de crowding macromolecular sint?ticos nos par?metros cin?ticos aparentes de estado-estacion?rio (Km, kcat e kcat/Km) para a rea??o qu?mica catalisada pela 2-trans-enoil-ACP(CoA) redutase de Mycobacterium tuberculosis (InhA). Os resultados mostraram que ficoll 70, ficoll 400 e dextran 70 t?m efeitos negligenci?veis na atividade da InhA na faixa de concentra??o utilizada. Por outro lado, um complexo efeito foi observado na presen?a do PEG 6000. A sacarose, que foi utilizada como controle nos experimentos, reduziu os valores de kcat/Km para o NADH e kcat para o 2-trans-dodecenoil-CoA de uma maneira concentra??o-dependente. Os resultados de din?mica molecular sugerem que a InhA adota uma forma mais compacta na presen?a de sacarose, o que provavelmente tem efeitos nos resultados de cin?tica de estado-estacion?rio. A presen?a dos agentes de crowding parece alterar a abund?ncia relativa dos diferentes conf?rmeros da InhA em solu??o. Os efeitos do crowding macromolecular na energia (Ea e E?), entalpia (?H#), entropia (?S#) e energia livre de Gibbs de ativa??o (?G#) foram determinados. Os valores de ?G# para todos os agentes de crowding testados foram similares ao tamp?o Pipes 100 mM, sugerindo que os efeitos do volume exclu?do n?o facilitam a forma??o do complexo ativado est?vel ES#. A n?o linearidade do gr?fico de Arrhenius para o PEG 6000 sugere que intera??es ?brandas? possam atuar nos efeitos do crowding macromolecular.