Glucosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas liberando unidades monossacarídicas de um terminal não redutor de um oligossacarídeo ou glicoconjugado. Iminoaçúcares são alcalóides piperidínicos polihidroxilados isolados de plantas (gênero Morus) e microrganismos (Bacillus), como nojirimicina (NJ) (1) e 1-desoxinojirimicina (DNJ) (2), os quais são descritos como inibidores de glucosidase. O potencial uso destes inibidores no tratamento de infecções virais, crescimento tumoral, metástases, diabetes, doença de Gaucher e osteoartrite tem motivado a comunidade científica na busca por novos derivados iminoaçúcares. Desse modo, a síntese de pseudodissacarídeos, contendo ambos resíduos de iminoaçúcar e glicopiranose, constitui uma estratégia interessante de obtenção desses derivados, apesar dos desafios envolvidos na geração da ligação entre estes dois açúcares. Por esta razão, foi utilizada a estratégia de click chemistry como uma ferramenta para introduzir uma ponte de grupo 1,2,3-triazol entre os açúcares a partir do acoplamento de azido-glicosídeo com N-propargil-iminoaçúcar. Desta forma, a síntese do iminoaçúcar N-propargílico (73), com função acetileno terminal, foi realizada em cinco etapas e foi usado na reação de cicloadição 1,3- dipolar com três derivados glicosídicos contendo grupo azido nas posições anomérica (C-1), C-3 ou C-6. A partir desta reação CuAAC (Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition), três novos pseudo-dissacarídeos (77, 81 e 85) foram sintetizados em rendimentos moderados e foram, então, avaliados em ensaios de - D-glucosidase isolada de Sacharomyces cerevisiae. Nestes testes preliminares, o composto 77 foi o mais ativo, o qual foi capaz de inibir a atividade da enzima em 40% a 1mM. Esses resultados encorajam a realização de novos experimentos, principalmente, a determinação de Ki e avaliação da atividade relativa à replicação do vírus HIV. Portanto, a obtenção destes pseudodissacarídeos trouxe uma contribuição importante no que diz respeito à química de carboidratos e também ao tratamento das doenças citadas. / Glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of glycosidic bonds releasing monosaccharide units from a non-reducing end of an oligosaccharide or glycoconjugate. Iminosugars are polihydroxilate piperidinic alkaloids isolated from plants (Morus alba) and microorganisms (Bacillus), such as nojirimicin (NJ) (1) and 1- deoxynojirimicin (2), which are described as glucosidase inhibitors. The potential use of these inhibitors in the treatment of viral infection, tumoral growing, metastasis, diabetes, Gaucher´s disease and osteoarthritis has stimulated the scientific community on the search for novel iminosugar derivatives. Thereby, the synthesis of pseudodisaccharides, having both iminosugar and glycopyranose residues, represents an interesting strategy to obtain these derivatives, despite the challenges involved in generating the link between these two sugars. For this reason, we have used click chemistry as a tool to introduce a 1,2,3-triazole bridge between the sugars from the coupling of azide-glycosides with N-propargyl-iminosugar. Thus, the synthesis of N-propargyl-iminosugar (73), containing the terminal acetylene function, was performed in five steps, and was used in the 1,3-dipolar cycloaddition reaction with three glycosidic derivatives containing the azide group at anomeric (C-1), C-3 or C-6 positions. By applying this CuAAC (Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition), three novel pseudo-disaccharides (77, 81 and 85) were synthesized in moderate yields and then, evaluated in -D-glucosidase assays isolated from Sacharomyces cerevisiae. In these preliminary test, compound 77 was the most active from the series, which was able to inhibit 40% of the enzyme activity at 1 mM. These results encourage us to perform new experiments, notably the determination of Ki and evaluation towards HIV replication. Thus, a contribution regarding carbohydrate chemistry and treatment of the supracited diseases was achieved by the synthesis of these pseudodisaccharides.

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:31:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69585.pdf: 1181357 bytes, checksum: 50462d1ba789c7b199ee8460ca90f3b8 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Fernandes Figueira. Departamento de Ensino. Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Doença de Gaucher (DG) é uma Doença de Depósito Lisossômico (DDL) e seu tratamento baseia - se na terapia de reposição enzimática. Tal terapia foi um marco na vida de pacientes e especialistas, pois mudou a história da evolução da doença, caracterizando um a nova era na Genética Médica. Este trabalho tem como objeto de pesquisa as perspectivas trazidas por profissionais, com experiência em trata r a Doença de Gaucher no Sistema Único de Saúde no estado do Rio de Janeiro. Uma vez que a DG é a única condição d o grupo das DDL a ser contemplada por uma Política Ministerial, promovendo acesso a drogas de alto custo através de um Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas (PCDT). O o bjetivo geral foi a nalisar a prática da aplicação do protocolo oficial de tratame nto da DG e o seu entendimento a partir da ótica dos médicos tratadores, profissionais de saúde e gestores do Centro de Referência , o Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HEMORIO). Os objetivos específicos foram primeiramente id entificar a formaçã o profissional dos envolvidos no programa, analisar a ótica desses profissionais sob re as recomendações do PCDT e como estes situam o Centro de Referência (CR) e m seu atual funcionamento , e d iscutir de maneira crítica a visão dos profiss i onais a respeito dos benefícios e de possíveis falhas do programa. Foram realizadas entrevistas temáticas semiestruturadas e a elas aplicou - se a análise de conteúdo. No que tange ao entendimento sobre o PCDT - DG e o seu viii funcionamento, os resultados apontam a importância da existência de um balizador, um programa robusto governamental, revisado por especialistas bem capacitados no tema. O PCDT - DG foi um avanço na saúde, oficializando e garantindo o acesso à medicação de maneira embasada, controlada por câmar as técnicas estaduais, permitindo a efetuação de pregões públicos, uma maneira transparente de aquisiçã o de drogas de alto custo comparada a medidas judiciais . Os sujeitos da pesquisa são favoráveis ao programa, no entanto possuem uma abordagem crítica ao sistema de saúde no que diz respeit o a entraves na rede de assistência cirúrgica e de reabilitação. Um grande gargalo atualmente no SUS não é exclusivo ao programa da DG: certos questionamentos éticos na fomentação do diagnóstico laboratorial por parte da indústria farmacêutica, apesar de haver relações amigáveis entre esses dois atores no CR. Concluímos que muitos avanços foram conquistados a partir da implementação do protocolo e que talvez este possa servir como modelo para garantir acesso ao tratamento de outras DDL. Algumas incongruências do siste ma são questionáveis e discutida s entre gestores, médicos e usuários, entretanto ainda são muito poucos os estudos publicados no Brasil sobre o tema . / Gaucher disease (GD) is a Lysosomal Storage Disease (LSD) and its treatment is based on enzyme replacement therapy. Such therapy was a milestone in patients `s lives and experts in the field, changing the disease natural history . This work aims at present ing the treatment of GD in the Unified Health System i n the state of Rio de Janeiro, as it is the only LSD to be covered by a Ministerial policy , which promotes access to high cost drugs through a Clinical Gui deline (CG) . The overall objective was to analyze the practical application of the CG protocol in the treatment of GD, and how this guideline was interpreted and used by the medical c haracters , health professionals and ma nagers of the Reference Center and the State Institute of Hematology Arthur de Siquei ra Cavalcanti (HEMORIO ). The specific objectives were to identify the training of those involved in the program, to analyze how professionals viewed the recommendations included in the CP, what they thought about the Reference Center for GD and to critical ly discuss the benefits and possi ble shortcomings of the program . Thematic semi - structured interviews were conducted, and the content analysis was applied. Regarding the understanding of the CP - GD and its op eration, the results point the importance of t he existence of a robust government program, reviewed by well - trained experts in the subject. The CP - GD was a health`s breakthrough , ensuring access to medication, controlled by state technical chambers, a llowing the practice of public auctions, a transpar ent way of purchasing high - cost drugs when compared to individual litigation. The steakeholder`s research were x favo rable to the program, although they criticized the health network constraints for specialized care, such as surgical services and rehabilitat ion. Another major bottleneck in the health system, not exclusive for G D is ethical issues regarding laboratory diagnosis by the pharmaceutical industry. We conclude d that many advances have been achieved from the implementation of the CP, and that hopeful ly this can serve as a model to ensure access t o treatment for other LSD. Managers, physicians and users point out some inconsistencies in the system although there is still limited published data on this subject in Brazil.

Deficiência na enzima lisossomal glucocerebrosidase (GCR) resulta na doença de Gaucher. O tratamento atual consiste na administração da enzima exógena, produzida em células CHO. Porém, o medicamento disponível no mercado é extremamente custoso. Neste trabalho, propusemos a clonagem e a expressão da GCR humana em células CHO, visando a obtenção de um clone celular produtor para viabilizar a produção futura da enzima, a um custo menor, no Instituto Butantan. A expressão estável da GCR recombinante foi obtida a partir da transfecção de células CHO-dhfr- com o plasmídeo pED de expressão em células de mamíferos contendo o cDNA da GCR, seguido de amplificação gênica por MTX. A GCR foi detectada no extrato celular (~ 64 kDa) e secretada para o sobrenadante (63-69 kDa) em ensaios de western blotting, usando o anticorpo policlonal anti-GCR gerado neste trabalho. A enzima secretada hidrolisou o substrato 4-MUG e a sua produtividade foi estimada em 5,14 pg/célula/dia para o melhor subclone produtor, selecionado para a produção futura da GCR em larga escala. / Deficiency of the lysosomal glucocerebrosidase (GCR) enzyme results in Gaucher\'s disease. Current treatment consists on enzyme replacement therapy by the administration of recombinant GCR produced in CHO cells. However, the medicine available in the market is extremely expensive. In this work, we proposed the cloning and expression of human GCR in CHO cells, in order to obtain a productive cellular clone for future production of GCR enzyme at a lower cost at the Butantan Institute. The stable expression of recombinant GCR was obtained after transfection of CHO-dhfr- cells with pED mammalian expression vector containing the GCR cDNA, followed by gene amplification with MTX. The GCR was detected by western blotting analysis, either as cell-associated (~ 64 kDa) or as secreted forms (63-69 kDa), using the anti-GCR polyclonal antibody produced in this work. The secreted enzyme was active on 4-MUG and was produced at a level of about 5,14 pg/cell/day for the best producer subclone, selected for subsequent steps of GCR production on large scale in next future.

Introdução: As Doenças lisossômicas (DLs) são condições genéticas, herdadas na sua maioria de forma autossômica recessiva, caracterizadas usualmente pela deficiência de enzimas lisossômicas específicas, envolvidas na síntese, degradação, armazenamento ou transporte de macromoléculas necessárias para o funcionamento normal do organismo. Nas situações mais típicas, o substrato não degradado acumula-se progressivamente nos lisossomos, com repercussões estruturais e funcionais, levando a sinais e sintomas característicos. Os pacientes apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, que podem incluir disfunção de órgãos, anormalidades esqueléticas, envolvimento neuronal, entre outras. O diagnóstico é usualmente obtido pela identificação da deficiência enzimática específica em leucócitos obtidos do sangue periférico, usualmente realizado em laboratórios de referência. O transporte da amostra pode ser um obstáculo quando o serviço requisitante está situado longe do centro de referência ou em outro país, situação em que a amostra de sangue pode chegar ao laboratório já sem condições de ser analisada. Objetivo: Este estudo teve como objetivo principal, tornar disponível um método mais simples, seguro e acessível que utiliza amostras de leucócitos impregnados em papel filtro (LIPF) como uma nova ferramenta para o diagnóstico bioquímico de pacientes com DLs. Métodos: O estudo envolveu amostras de pacientes com diagnóstico previamente confirmado de DLs (amostra de conveniência, por se tratarem de doenças raras, com incidências individuais ao redor de 1:100.000 recém-nascidos vivos). Foram incluídos no estudo os pacientes com diagnóstico já estabelecido de DLs selecionadas (MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe), independente do sexo e/ou idade, atendidos no Serviço de Genética Médica do HCPA, que concordaram em participar do estudo. O grupo de referência negativo foi constituído pelas amostras de 50 indivíduos hígidos, adultos, de ambos os sexos. Resultados: Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos de pacientes com MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe, indicaram que as enzimas analisadas em amostras de LIPF permitiram a identificação de todos os pacientes, com sensibilidade de 100%. Os testes de estabilidade realizados nas amostras de LIPF indicaram que as amostras, quando mantidas a 4ºC, se mostram estáveis por pelo menos 30 dias. Conclusões: Nas condições utilizadas, amostras de LIPF se mostraram adequadas para a identificação segura de pacientes com MPS tipo IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe. As amostras de leucócitos secos em papel filtro são mais estáveis e seguras para o transporte, indicando que possa ser esta uma importante ferramenta para facilitar a identificação de pacientes com DLDs, especialmente daqueles que vivem em áreas que tem dificuldades para a remessa de amostras líquidas para serviços de referência. / Background: Lysosomal Disorders (LDs) are genetic conditions, mostly inherited in autosomal recessive fashion, usually characterized by a deficiency of specific lysosomal enzymes involved in the synthesis, degradation, storage or transportation of macromolecules necessary for normal functioning of the organism. Typically, the non-degraded substrate is progressively accumulated in lysosomes, with structural and functional repercussions, leading to characteristic signs and symptoms. Affected patients present a wide range of clinical manifestations, which may include organ dysfunction, skeletal anomalies, neuronal involvement, etc. The diagnosis is normally made through identification of the specific enzyme deficiency in white blood cells from a sample of peripheral blood, usually performed in reference laboratories. The transporting of a liquid sample can be a problem when the test orderer is located far from the reference center or in a foreign country, as often the blood sample arrives at the laboratory in poor condition and cannot be properly analyzed. Aim: The main aim of this study was to make available a new technique that is simpler, safer and more accessible, using leukocytes impregnated on filter paper (LIFP) as a new tool for the biochemical diagnosis of patients with LSDs. Methods: This study involved samples of patients with previously confirmed diagnosis of selected LSDs (a convenience sample, as these are rare diseases, with individual incidences around 1:100.000 live newborns). Patients with an established diagnosis of MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease and Pompe disease regardless of sex and/or age, cared for at the Genetics Service of HCPA and who agreed to participate were included in the study. The negative reference group comprised blood samples from 50 healthy adults of both genders. Results: The results obtained in the enzymatic assays of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease indicated that the analyzed enzymes in LIFP samples allowed the identification of all patients, with sensitivity of 100%. The stability tests performed in LIFP samples indicated that samples, when maintained at 4ºC, were stable for at least 30 days. Conclusions: In the conditions used, LIFP samples were shown to be adequate for a reliable identification of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease. Blood samples on filter paper are more stable and reliable for transportation, indicating that this may be an important tool to facilitate the identification of patients with LSDs, particularly those living in areas with difficulties for the shipment of liquid samples to reference cervices.

Introdução: As Doenças lisossômicas (DLs) são condições genéticas, herdadas na sua maioria de forma autossômica recessiva, caracterizadas usualmente pela deficiência de enzimas lisossômicas específicas, envolvidas na síntese, degradação, armazenamento ou transporte de macromoléculas necessárias para o funcionamento normal do organismo. Nas situações mais típicas, o substrato não degradado acumula-se progressivamente nos lisossomos, com repercussões estruturais e funcionais, levando a sinais e sintomas característicos. Os pacientes apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, que podem incluir disfunção de órgãos, anormalidades esqueléticas, envolvimento neuronal, entre outras. O diagnóstico é usualmente obtido pela identificação da deficiência enzimática específica em leucócitos obtidos do sangue periférico, usualmente realizado em laboratórios de referência. O transporte da amostra pode ser um obstáculo quando o serviço requisitante está situado longe do centro de referência ou em outro país, situação em que a amostra de sangue pode chegar ao laboratório já sem condições de ser analisada. Objetivo: Este estudo teve como objetivo principal, tornar disponível um método mais simples, seguro e acessível que utiliza amostras de leucócitos impregnados em papel filtro (LIPF) como uma nova ferramenta para o diagnóstico bioquímico de pacientes com DLs. Métodos: O estudo envolveu amostras de pacientes com diagnóstico previamente confirmado de DLs (amostra de conveniência, por se tratarem de doenças raras, com incidências individuais ao redor de 1:100.000 recém-nascidos vivos). Foram incluídos no estudo os pacientes com diagnóstico já estabelecido de DLs selecionadas (MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe), independente do sexo e/ou idade, atendidos no Serviço de Genética Médica do HCPA, que concordaram em participar do estudo. O grupo de referência negativo foi constituído pelas amostras de 50 indivíduos hígidos, adultos, de ambos os sexos. Resultados: Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos de pacientes com MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe, indicaram que as enzimas analisadas em amostras de LIPF permitiram a identificação de todos os pacientes, com sensibilidade de 100%. Os testes de estabilidade realizados nas amostras de LIPF indicaram que as amostras, quando mantidas a 4ºC, se mostram estáveis por pelo menos 30 dias. Conclusões: Nas condições utilizadas, amostras de LIPF se mostraram adequadas para a identificação segura de pacientes com MPS tipo IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe. As amostras de leucócitos secos em papel filtro são mais estáveis e seguras para o transporte, indicando que possa ser esta uma importante ferramenta para facilitar a identificação de pacientes com DLDs, especialmente daqueles que vivem em áreas que tem dificuldades para a remessa de amostras líquidas para serviços de referência. / Background: Lysosomal Disorders (LDs) are genetic conditions, mostly inherited in autosomal recessive fashion, usually characterized by a deficiency of specific lysosomal enzymes involved in the synthesis, degradation, storage or transportation of macromolecules necessary for normal functioning of the organism. Typically, the non-degraded substrate is progressively accumulated in lysosomes, with structural and functional repercussions, leading to characteristic signs and symptoms. Affected patients present a wide range of clinical manifestations, which may include organ dysfunction, skeletal anomalies, neuronal involvement, etc. The diagnosis is normally made through identification of the specific enzyme deficiency in white blood cells from a sample of peripheral blood, usually performed in reference laboratories. The transporting of a liquid sample can be a problem when the test orderer is located far from the reference center or in a foreign country, as often the blood sample arrives at the laboratory in poor condition and cannot be properly analyzed. Aim: The main aim of this study was to make available a new technique that is simpler, safer and more accessible, using leukocytes impregnated on filter paper (LIFP) as a new tool for the biochemical diagnosis of patients with LSDs. Methods: This study involved samples of patients with previously confirmed diagnosis of selected LSDs (a convenience sample, as these are rare diseases, with individual incidences around 1:100.000 live newborns). Patients with an established diagnosis of MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease and Pompe disease regardless of sex and/or age, cared for at the Genetics Service of HCPA and who agreed to participate were included in the study. The negative reference group comprised blood samples from 50 healthy adults of both genders. Results: The results obtained in the enzymatic assays of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease indicated that the analyzed enzymes in LIFP samples allowed the identification of all patients, with sensitivity of 100%. The stability tests performed in LIFP samples indicated that samples, when maintained at 4ºC, were stable for at least 30 days. Conclusions: In the conditions used, LIFP samples were shown to be adequate for a reliable identification of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease. Blood samples on filter paper are more stable and reliable for transportation, indicating that this may be an important tool to facilitate the identification of patients with LSDs, particularly those living in areas with difficulties for the shipment of liquid samples to reference cervices.

Introdução: As Doenças lisossômicas (DLs) são condições genéticas, herdadas na sua maioria de forma autossômica recessiva, caracterizadas usualmente pela deficiência de enzimas lisossômicas específicas, envolvidas na síntese, degradação, armazenamento ou transporte de macromoléculas necessárias para o funcionamento normal do organismo. Nas situações mais típicas, o substrato não degradado acumula-se progressivamente nos lisossomos, com repercussões estruturais e funcionais, levando a sinais e sintomas característicos. Os pacientes apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, que podem incluir disfunção de órgãos, anormalidades esqueléticas, envolvimento neuronal, entre outras. O diagnóstico é usualmente obtido pela identificação da deficiência enzimática específica em leucócitos obtidos do sangue periférico, usualmente realizado em laboratórios de referência. O transporte da amostra pode ser um obstáculo quando o serviço requisitante está situado longe do centro de referência ou em outro país, situação em que a amostra de sangue pode chegar ao laboratório já sem condições de ser analisada. Objetivo: Este estudo teve como objetivo principal, tornar disponível um método mais simples, seguro e acessível que utiliza amostras de leucócitos impregnados em papel filtro (LIPF) como uma nova ferramenta para o diagnóstico bioquímico de pacientes com DLs. Métodos: O estudo envolveu amostras de pacientes com diagnóstico previamente confirmado de DLs (amostra de conveniência, por se tratarem de doenças raras, com incidências individuais ao redor de 1:100.000 recém-nascidos vivos). Foram incluídos no estudo os pacientes com diagnóstico já estabelecido de DLs selecionadas (MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe), independente do sexo e/ou idade, atendidos no Serviço de Genética Médica do HCPA, que concordaram em participar do estudo. O grupo de referência negativo foi constituído pelas amostras de 50 indivíduos hígidos, adultos, de ambos os sexos. Resultados: Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos de pacientes com MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe, indicaram que as enzimas analisadas em amostras de LIPF permitiram a identificação de todos os pacientes, com sensibilidade de 100%. Os testes de estabilidade realizados nas amostras de LIPF indicaram que as amostras, quando mantidas a 4ºC, se mostram estáveis por pelo menos 30 dias. Conclusões: Nas condições utilizadas, amostras de LIPF se mostraram adequadas para a identificação segura de pacientes com MPS tipo IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe. As amostras de leucócitos secos em papel filtro são mais estáveis e seguras para o transporte, indicando que possa ser esta uma importante ferramenta para facilitar a identificação de pacientes com DLDs, especialmente daqueles que vivem em áreas que tem dificuldades para a remessa de amostras líquidas para serviços de referência. / Background: Lysosomal Disorders (LDs) are genetic conditions, mostly inherited in autosomal recessive fashion, usually characterized by a deficiency of specific lysosomal enzymes involved in the synthesis, degradation, storage or transportation of macromolecules necessary for normal functioning of the organism. Typically, the non-degraded substrate is progressively accumulated in lysosomes, with structural and functional repercussions, leading to characteristic signs and symptoms. Affected patients present a wide range of clinical manifestations, which may include organ dysfunction, skeletal anomalies, neuronal involvement, etc. The diagnosis is normally made through identification of the specific enzyme deficiency in white blood cells from a sample of peripheral blood, usually performed in reference laboratories. The transporting of a liquid sample can be a problem when the test orderer is located far from the reference center or in a foreign country, as often the blood sample arrives at the laboratory in poor condition and cannot be properly analyzed. Aim: The main aim of this study was to make available a new technique that is simpler, safer and more accessible, using leukocytes impregnated on filter paper (LIFP) as a new tool for the biochemical diagnosis of patients with LSDs. Methods: This study involved samples of patients with previously confirmed diagnosis of selected LSDs (a convenience sample, as these are rare diseases, with individual incidences around 1:100.000 live newborns). Patients with an established diagnosis of MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease and Pompe disease regardless of sex and/or age, cared for at the Genetics Service of HCPA and who agreed to participate were included in the study. The negative reference group comprised blood samples from 50 healthy adults of both genders. Results: The results obtained in the enzymatic assays of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease indicated that the analyzed enzymes in LIFP samples allowed the identification of all patients, with sensitivity of 100%. The stability tests performed in LIFP samples indicated that samples, when maintained at 4ºC, were stable for at least 30 days. Conclusions: In the conditions used, LIFP samples were shown to be adequate for a reliable identification of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease. Blood samples on filter paper are more stable and reliable for transportation, indicating that this may be an important tool to facilitate the identification of patients with LSDs, particularly those living in areas with difficulties for the shipment of liquid samples to reference cervices.

Deficiência na enzima lisossomal glucocerebrosidase (GCR) resulta na doença de Gaucher. O tratamento atual consiste na administração da enzima exógena, produzida em células CHO. Porém, o medicamento disponível no mercado é extremamente custoso. Neste trabalho, propusemos a clonagem e a expressão da GCR humana em células CHO, visando a obtenção de um clone celular produtor para viabilizar a produção futura da enzima, a um custo menor, no Instituto Butantan. A expressão estável da GCR recombinante foi obtida a partir da transfecção de células CHO-dhfr- com o plasmídeo pED de expressão em células de mamíferos contendo o cDNA da GCR, seguido de amplificação gênica por MTX. A GCR foi detectada no extrato celular (~ 64 kDa) e secretada para o sobrenadante (63-69 kDa) em ensaios de western blotting, usando o anticorpo policlonal anti-GCR gerado neste trabalho. A enzima secretada hidrolisou o substrato 4-MUG e a sua produtividade foi estimada em 5,14 pg/célula/dia para o melhor subclone produtor, selecionado para a produção futura da GCR em larga escala. / Deficiency of the lysosomal glucocerebrosidase (GCR) enzyme results in Gaucher\'s disease. Current treatment consists on enzyme replacement therapy by the administration of recombinant GCR produced in CHO cells. However, the medicine available in the market is extremely expensive. In this work, we proposed the cloning and expression of human GCR in CHO cells, in order to obtain a productive cellular clone for future production of GCR enzyme at a lower cost at the Butantan Institute. The stable expression of recombinant GCR was obtained after transfection of CHO-dhfr- cells with pED mammalian expression vector containing the GCR cDNA, followed by gene amplification with MTX. The GCR was detected by western blotting analysis, either as cell-associated (~ 64 kDa) or as secreted forms (63-69 kDa), using the anti-GCR polyclonal antibody produced in this work. The secreted enzyme was active on 4-MUG and was produced at a level of about 5,14 pg/cell/day for the best producer subclone, selected for subsequent steps of GCR production on large scale in next future.