Les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD) sont un groupe hétérogène de dystrophies musculaires à progression lente. Des mutations du gène de la dysferline causent la LGMD de type 2B, mutations dans le gène de la cavéoline-3 (cav-3) causent LGMD de type 1C et des mutations dans le gène anoctamine-5 (ano-5) sont liées aux LGMD. Dans le but d'analyser les mécanismes moléculaires des LGMD et d'étudier les potentielles interactions de la dysferline, de la cav-3 et de l'ano5, des expériences sur des cellules musculaires primaires portant des mutations associées aux gènes DYSF, CAV3 et ANO5 ont été analysées. Les études d'immunomarquage ont montré que la protéine dysferline et la cav-3 sont partiellement colocalisées dans des structures vésiculaires de la membrane plasmique des myotubes primaires humains. La purification biochimique des "detergent-resistant membranes" issus des myotubes différenciés a montré que la dysferline est associée aux " lipid raft " liées aux cytosquelettes d'actine. L'analyse de la microscopie électronique sur les myotubes issus des muscles des patients atteints de LGMD a montré des altérations dans l'abondance des cavéoles à la membrane plasmique qui est en corrélation avec les mutations causant la maladie. L'analyse de l'ultrastructure cellulaire a montré que la dysferline est localisée à la membrane plasmique mais également dans des vésicules cytosoliques. L'immunopurification de ces vésicules contenant de la dysferline a révélé la présence d'environ 500 protéines détectées par LC-MS, ce qui pourrait représenter des protéines structurales vésiculaires, ainsi que des nouveaux partenaires potentiels d'interaction de la dysferline. / Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) are a heterogeneous group of slowly progressive muscular dystrophies with common features such as hyperCKemia and skeletal muscle weakness. Mutations in the dysferlin gene cause LGMD 2B, in the caveolin-3 (cav-3) gene LGMD 1C and in the anoctamin-5 (ano-5) gene LGMD 2L, respectively. In order to reveal the molecular mechanisms underlying LGMD and to investigate the putative interactions of dysferlin, cav-3, and ano5, primary skeletal muscle cell lines with disease-related mutations in DYSF, CAV3, and ANO5 have been analyzed. Immunolabeling studies revealed that dysferlin and cav-3 are partially colocalized in vesicular structures at the plasma membrane. Biochemical purification of detergent-resistant membranes from differentiated myotubes showed that dysferlin is associated with lipid rafts linked to the actin-cytoskeleton. Transmission electron microscopy analysis of myotubes revealed alterations of caveolae abundance at the plasma membrane correlating with disease-causing mutations. Ultrastructural studies revealed localization of dysferlin at the plasma membrane, but also in cytosolic vesicles. These vesicles contained a subset of approximately 500 proteins detected by LC-MS, which might represent vesicular structural proteins, vesicle cargo, and putative new dysferlin interaction partners. Results from this study lead to the conclusion that caveolae play a crucial role in the context of LGMD. Dysferlin and cav-3 seem to be closely linked on structural as well as on functional level. Our results confirm that dysferlin is localized in cytosolic vesicles, which are involved in multiple cellular processes.

Les dysferlinopathies sont des dystrophies musculaires qui se manifestent par la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B (LGMD2B) ou la myopathie de Miyoshi (MM). Elles sont causées par des mutations dans le gène dysferline. La dysferline est une protéine membranaire exprimée dans le muscle squelettique, responsable de la réparation des microlésions du sarcolemme. L’absence d’une telle réparation de la membrane entraîne une atrophie musculaire progressive. Ce travail de thèse explore le potentiel thérapeutique d'une stratégie de modulation d'épissage pour le traitement de la LGMD2B causée par la mutation faux-sens c4022T>C dans l'exon 38 du gène dysferline. Des oligonucléotides et des petits ARN U7 délivrés par un vecteur viral de type adéno-associé ont été utilisés comme outils antisens pour induire un saut d'exon in vitro et in vivo. Ce projet de thèse étudie également la capacité de la dysferline tronquée à se localiser de façon appropriée à la membrane et ainsi la réparer. / Dysferlinopathy is a muscular dystrophy that manifests as two major phenotypes: limb-girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) or Miyoshi myopathy (MM). It is caused by mutations in the dysferlin gene. Dysferlin is a membrane protein expressed in skeletal muscle. It is responsible for the repair of sarcolemma microlesions produced by muscle contractions. A compromised membrane repair leads to slowly progressing muscle wasting. This thesis explores the therapeutic potential of an antisense mediated splice switching strategy in LGMD2B caused by the missense mutation c4022T>C in the exon 38 of the dysferlin gene. Antisense oligonucleotides and U7 snRNAs delivered by an adeno-associated viral vector were used as antisense tools to trigger exon skipping in vitro and in vivo. The thesis investigates also if the truncated dysferlin maintainsa proper membrane localization and its membrane repair ability.