Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3689.pdf: 2323201 bytes, checksum: 6af4b1ce7a2e6e0fc415c443c45e7e99 (MD5) Previous issue date: 2011-07-20 / Financiadora de Estudos e Projetos / Pneumococcal diseases are a major cause of mortality worldwide. New vaccines against Streptococcus pneumoniae are been developed. The pneumococcal surface protein A (PspA) is an important pneumococcal virulence factor and a potential vaccine candidate, therefore, a recombinant fragment of PspA gene was cloned into pET37b and the plasmid was inserted into E. coli BL21(DE3) for improved protein production in high cell density cultures (HCDC). Fed-batch is the operational mode most frequently used to obtain high cell density in recombinant E. coli cultures. Before running a high cell density culture (HCDC) of E. coli, it is usually necessary to decide whether to use glucose or glycerol as carbon source in defined or complex media, with IPTG or lactose as inducing agents. Glycerol has outstanding potential as carbon source because its assimilation does not trigger undesirable metabolite formation, even when growth takes place at high rates. However, glycerol is usually simply used as a glucose substitute in media designed for the latter as carbon source. Furthermore, most of the bioreactor induction strategies have been based on a template from molecular biology shake flask expression studies. Here, both batch and fed-batch defined culture medium formulations were modified to improve performance of the process for glycerol as growth limiting substrate. The experiments were carried out in 5 L bioreactor, using an automatically controlled exponential feeding and glycerol as carbon source. The standard defined medium formulation was modified to improve performance of the process for glycerol as growth limiting substrate and induction by both IPTG and lactose was studied. Specific growth rates up to 0.57 h-1, biomass formation yield of 0.56 g DCW/gglycerol and cellular productivities around 6.0 g (DCW)/ L h were achieved in shortened rE. coli HCDC by increasing the thiamine concentration in the medium, adding phosphate salts to the feeding medium and raising the growth phase temperature to 37°C. The performance of lactose as inducer was investigated by implementing an innovative induction strategy, which consisted of addition of a lactose pulse followed by a continuous supply of lactose mixed with glycerol in the feeding solution. The results indicated similar productivity [1.3 g (DCW)/ L h], protein maximum yield (220 mgprotein/g DCW) and concentration (26 gprotein/L) when using IPTG or lactose. These values are significantly higher than some of the best reported in the literature, confirming the efficacy of the proposed biomass formation and protein production strategy. Glycerol showed outstanding performance as carbon source, enabling high growth rates without acetate formation. Together with automatic control of the exponential feeding profile, the cultivation strategy employed resulted in higher rates of cell growth and protein production, leading to shorter cultivations with higher productivities and, consequently, lower production costs. This work is an important contribution to the field of HCDC with glycerol as carbon source and lactose as inducer. / As doenças pneumocócicas são uma das maiores causas de mortalidade mundial e por isso, o desenvolvimento de novas vacinas contra Streptococcus pneumoniae é crucial para tornar mais eficiente a prevenção contra as doenças causadas por essa bactéria. A proteína de superfície de pneumococo A (PspA) é um importante fator de virulência, sendo uma potencial candidata à antígeno vacinal. Por isso, um fragmento recombinante do gene da PspA foi clonado no plasmídeo pET37b e este foi inserido em células de E. coli BL21(DE3) para a produção da proteína em cultivos de alta densidade celular (HCDC). O modo de operação em batelada alimentada é o mais frequentemente empregado para obter altas densidades celulares em culturas de E. coli recombinante. Antes de realizar um HCDC de E. coli, é normalmente necessário decidir entre o uso de glicose ou glicerol como fonte de carbono em um meio definido ou complexo, tendo IPTG ou lactose como agentes da indução. Glicerol apresenta um excelente potencial como fonte de carbono já que sua assimilação não provoca a formação de metabólitos indesejados, mesmo quando altas velocidades de crescimento são observadas. No entanto, o glicerol é geralmente usado simplesmente como um substituto da glicose em meios de cultivo formulados tendo a última como fonte de carbono. Além disso, a maioria das estratégias de indução em biorreator tem sido baseadas em uma transposição dos estudos de indução em frascos agitados. No presente trabalho, as composições dos meios definidos empregados tanto na batelada como na alimentação foram modificadas visando obter um melhor desempenho do processo tendo glicerol como substrato limitante. Os experimentos foram realizados em biorreator de 5 L, utilizando controle automático da alimentação exponencial e glicerol como fonte de carbono. A formulação do meio definido de cultivo comumente utilizado em HCDCs foi modificada para melhorar o desempenho do processo para glicerol como substrato limitante do crescimento e estudou-se a indução com IPTG e lactose. Velocidades específicas de crescimento de até 0,57 h-1, fator de conversão de substrato a células na ordem de 0,56 g (DCW)/ gglicerol e produtividades celular em torno de 6,0 g (DCW)/L h foram obtidos em HCDC de rE. coli de curta duração devido, principalmente, ao aumento da concentração de tiamina no meio, adição de sais de fosfato no meio de alimentação e aumento da temperatura da fase de crescimento para 37ºC. O desempenho da lactose como indutor foi investigado através da implementação de uma estratégia de indução inovadora, baseada na adição de um pulso de lactose seguido por um fornecimento contínuo de lactose junto com glicerol no meio de alimentação. Os resultados indicaram produtividade celular [1,3 g (DCW)/L h], rendimento máximo de proteína (220 mgproteína/g DCW) e concentração protéica (26 gproteína/L) semelhantes ao se utilizar IPTG ou lactose. Estes valores são significativamente maiores do que alguns dos melhores relatados na literatura, confirmando a eficácia da estratégia proposta para a formação de biomassa e produção protéica. O glicerol mostrou um excelente desempenho como fonte de carbono, possibilitando altas velocidades de crescimento celular sem formação de acetato. O controle automático do perfil de alimentação exponencial, juntamente com as estratégias de cultivo empregadas, resultou em maiores velocidades de crescimento celular e produção de proteína, levando a cultivos mais curtos, com maiores produtividades e, consequentemente, menores custos de produção. Este trabalho é uma contribuição importante para estudos de HCDC com glicerol como fonte de carbono e lactose como indutor.

Orientador: Marcel Otavio Cerri / Resumo: Avanços na biotecnologia proporcionaram possibilidades para o eficiente desempenho da produção em larga escala de diversas biomoléculas e consequentemente suas aplicações industriais. A Escherichia coli se destaca dentre a gama de microrganismos que agem como hospedeiros de genes, desempenhando a função de codificar a síntese proteica. Os vetores mais veiculados na produção de proteínas recombinantes em E. coli são baseados no operon lac, onde o isopropil β-D1-tio-galactopiranosídeo (IPTG), análogo a molécula de lactose, é utilizado para a indução da produção da proteína de interesse. Estudos descritos na literatura também observaram o bom desempenho da lactose como agente de indução da E. coli recombinante na expressão de proteína verde fluorescente melhorada (Enhanced Green Fluorescent Protein – EGFP), e suas vantagens quando comparada ao IPTG, como por exemplo menor custo e menor toxicidade. A EGFP se tornou promissora pelo fato de ser monomérica e não precisar de auxilio de quaisquer agentes adicionais para exibir atividade de fluorescência. Possui variadas utilidades no campo biológico como excelente biomarcador da expressão genica e biosensor. Em bioprocessos, operados em biorreatores convencionais é fundamental o estudo dos parâmetros interferentes nos cultivos para a otimização da expressão do produto desejado. A oxigenação em processos conduzidos de maneira aeróbica, também é uma tarefa desafiadora em biorreatores convencionais, sendo imprescindível o controle da con... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Advances in biotechnology have provided possibilities to the performance of large-scale of biomolecules and therefore of their industrial applications. Escherichia coli stands out among microorganisms that act as host genes, functioning as a synthetic protein. The most useful vectors for the production of recombinant proteins in E. coli are based on the operon lac, where isopropyl β-D1-thiogalactopyroside (IPTG), analogous to lactose, is used to induce the production of proteins of interest. Studies in the literature have also observed the good performance of lactose as an inducer of recombinant E. coli in the expression of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), and its advantages when compared to IPTG, such as lower cost and toxicity. EGFP becomes promising because it is monomeric and does not need to help the main agents for fluorescence activity. It has several uses in the biological field as an excellent biomarker of gene expression and biosensor. In bioprocesses, operated in conventional bioreactors, it is fundamental to study the interfering parameters in the cultures to optimize the expression of the desired product. Oxygenation in aerobically conducted processes is also a challenging task in conventional bioreactors, with control of the concentration of dissolved oxygen in the culture medium is essential, which may be limiting for growth and expression of the protein of interest. In processes of production of heterologous proteins, it is assumed that the productiv... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-08-01T21:41:21Z No. of bitstreams: 1 LuanTalesCostaDePaivaVasconcelos_DISSERT.pdf: 4667942 bytes, checksum: f1d92bcd962e6d65e62dd7943ddbeeca (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-08-03T20:28:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LuanTalesCostaDePaivaVasconcelos_DISSERT.pdf: 4667942 bytes, checksum: f1d92bcd962e6d65e62dd7943ddbeeca (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:28:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuanTalesCostaDePaivaVasconcelos_DISSERT.pdf: 4667942 bytes, checksum: f1d92bcd962e6d65e62dd7943ddbeeca (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Com cerca de 900.000 a 1,3 milhões de novos casos anualmente, a Leishmaniose é um complexo de doenças que pode ser fatal se não dada a devida atenção. Apesar de sua relevância na saúde pública, ainda não existe uma vacina capaz de prevenir a doença em humanos, e seu tratamento é caro e agressivo à saúde. O presente estudo tem como objetivo otimizar os parâmetros de indução do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em Escherichia coli recombinante. Dessa forma, para a indução foi utilizada a lactose nas concentrações de 0,1; 1,0 e 10 g/L, e o isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) nas concentrações de 20,0; 100,0; 500,0 e 1000,0 M como moléculas indutoras em diferentes densidades celulares (densidade óptica a 600 nm de 0,5 e 1,0) de modo a analisar a influência do instante de indução no rendimento da proteína de interesse. Os resultados mostraram que a concentração de IPTG de 100,0 M foi a que mais favoreceu a produção do antígeno (0,087 g/L), sendo esta concentração de IPTG 10 vezes menor do que utilizada em trabalhos anteriores para esse tipo de sistema, e para a lactose foi a de 1,0 g/L (0,016 g/L). Dessa forma, a indução com 100,0 M de IPTG permitiu obter o antígeno 503 com uma concentração 5,6 vezes maior que a máxima obtida quando a lactose foi usada como indutor. / With nearly 900,000 to 1.3 million new cases annually, Leishmaniosis is a complex of diseases that can be fatal if not given proper attention. Despite its relevance in the public health system, there is no vaccine capable of preventing disease in humans so far, and its treatment is expensive and aggressive to human health. Vaccination remains the most practical and realistic way of fight against the disease, thus, the production of recombinant antigens as a pathway towards a vaccine acquisition is necessary. In addition, the optimization of the strategy of the recombinant antigen’s production is of interest so it can make the process viable. Therefore, the present study aims to optimize the induction parameters of the 503 Leishmania i. chagasi antigen expressed in recombinant Escherichia coli. Hence, the induction at different cell densities (optical density at 600 nm of 0.5 and 1.0) was evaluated in order to analyse the influence of the induction time on the yield of the protein of interest. In this segment, lactose and isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) were used as inducer molecules, using various concentrations: 0.1 g/L, 1.0 g/L and 10 g/L for lactose and 20 μM, 100 μM, 500 μM and 1000 μM for IPTG. The results presented that the concentration of IPTG that obtained the higher antigen levels was that of 100 μM (0.087 g/L), a 10-fold lower concentration than was being previously used in this type of system, and for lactose it was 1 g/L (0.016 g/L). Thus, the induction with 100 μM allowed to obtain the antigen with a concentration 5.6 times higher than the lactose induction maximum concentration.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MichelleRFV_TESE.pdf: 2132732 bytes, checksum: 80b95f923491eeb118d74b0376a64ba9 (MD5) Previous issue date: 2011-12-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Escherichia coli has been one of the most widely used hosts in recombinant protein production, in both laboratory and industrial scale since the advent of recombinant DNA technology. Despite the substantial progress of studies on the molecular biology and immunology of infections, there is currently no medication-based prophylaxis capable of preventing leishmaniasis. As such, there is a great need to identify specific antigens for the development of vaccines and diagnostic kits against visceral leishmaniasis. Thus, the primary goal of the present study is to assess the influence of cultivation conditions on the production of Leishmania chagasi antigens, carried out in a rotating incubator and bioreactor. To that end, several assays were conducted to evaluate the kinetic behavior of antigens (648, 503) of Leishmania. i. chagasi in two different compositions of media (2xTY, TB), with and without an inducer. In order to improve expression, assays were performed in a benchtop bioreactor using the best conditions obtained in a rotating incubator, in addition to assessing the influence of stirring speed. Results show that high complexity of the cultivation medium favored kinetic growth of clones (648, 503). However, in assays submitted to induction by IPTG, this elevated complexity did not promote the expression of recombinant proteins. Expression of antigens 648 and 503 exhibited behavior associated with growth and, in terms of location, proteins 648 and 503 are intracellularly stored. Lactose may be the most adequate inducer in protein expression, when considering factors, cost, toxicity and stability. Elevated stirring may increase cell growth in clone 53, although it may not result in high concentrations for the protein of interest. On the other hand, positive results were obtained for all recombinant clones (648, 503) tested, confirmed by the electrophoretic profile / A Escherichia coli ? um dos hospedeiros mais utilizados para produ??o de prote?nas recombinantes tanto em escala de laborat?rio como em escala industrial desde o advento da tecnologia do DNA recombinante. Apesar do avan?o expressivo dos estudos da biologia molecular e da imunologia das infec??es, n?o existe, atualmente, nenhuma droga profil?tica capaz de prevenir o calazar. Desta forma, existe uma grande necessidade de identifica??o de ant?genos espec?ficos para o desenvolvimento de vacinas e kits para diagn?sticos contra a Leishmaniose visceral. Com base no exposto, o presente trabalho tem como foco principal avaliar a influ?ncia das condi??es de cultivo na produ??o dos ant?genos de Leishmania i. chagasi em cultivos realizados em incubador rotativo e biorreator. Para atingir o objetivo proposto, v?rios ensaios foram realizados a fim de se avaliar o comportamento cin?tico dos clones (648, 503) de Leishmania i. chagasi em duas diferentes composi??es de meio (2xTY, TB), com e sem adi??o de indutor em incubador rotativo. Para melhorar a express?o, ensaios foram conduzidos em biorreator de bancada com as melhores condi??es obtidas em incubador rotativo, al?m da avalia??o da influ?ncia da velocidade de agita??o. Com base nos resultados obtidos, pode-se observar que a elevada complexidade do meio de cultivo favoreceu a cin?tica de crescimento dos clones (648, 503), no entanto, ao se tratar dos ensaios submetidos ao procedimento de indu??o por IPTG, a elevada complexidade do meio de cultivo n?o favoreceu a express?o das prote?nas recombinantes. Pode-se observar que a express?o dos ant?genos 648 e 503 apresentam um comportamento associado ao crescimento e que em termos de localiza??o, as prote?nas 648 e 503, s?o armazenadas intracelularmente. A lactose pode ser o indutor mais adequado na express?o das prote?nas tendo em vista os fatores, custo, toxicidade e estabilidade. A elevada agita??o pode aumentar o crescimento celular do clone 503, entretanto, pode n?o acarretar em altas concentra??es da prote?na de interesse. Por outro lado, foram obtidos resultados positivos para todos os clones recombinantes (648, 503) testados, confirmada atrav?s do perfil eletrofor?tico

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2531.pdf: 1826513 bytes, checksum: 1b4aeefe4e23520d603b495bbd0b8832 (MD5) Previous issue date: 2009-04-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Using recombinant DNA techniques, the lipase BTL2 gene of Bacillus thermocatenulatus was cloned in E. coli BL321 under control of the strong temperature-inducible λPL promoter. It was investigated, initially, in this work, the influence of different variables in cell growth and expression of lipase BTL2 by recombinant E. coli, through experiments performed in agitated flasks with LB medium. First, it was studied the influence of temperature of growth (between 27 ° C and 34.2 °C) and heat shock temperature (between 37.8 °C and 46.2 °C) in the expression of lipase BTL2 by E. coli recombinant, using statistical design of experiments. The results of this study, where the shock was performed in the early exponential phase, indicated as the best Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, yielding cellular concentration of 0.6 g dry weight / L and enzyme activity of 121.000 U/g.wet.cel. Then, it was investigated the influence of the growth phase of the microorganism at the shock, through cultures with Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, the results of these experiments showed how heat shock condition at the end of exponential phase, resulting in activity of 258.000 U/g.wet.cel It investigated the influence of different initial concentrations of glucose in the medium on cell growth and expression of the enzyme. The best results were obtained from cell mass with 10 g/L glucose and μmax = 0,16 h-1, Yx/s = 0,19 g/g, resulting in 1.2 g / L dry cel, enzymatic activity of about 250.000 U / g.wet.cel. Lower concentrations of glucose and higher concentrations led to smaller cell, but did not affect enzyme activity in the final. Based on previous cultures of E.coli were conducted simulations to calculate the best condition for feed-batch. The experimental test was performed with 10 g/L glucose at the beginning of cultivation, Tcresc = 30 °C, Tchoque = 45 °C. In this test, we were able to achieve 15 g/L dry.cel μmax = 0,38 h-1 with enzyme activity of 231.000 U/g.wet.cel, with resulting in 100 times more enzyme in this test than in cultivation in shaker in the best condition. The results of the simulation, obtained using model of Monod, predicted quite well those obtained experimentally. There was no significant accumulation of organic acids and all aminoacids consumed by the moment of shock. From the heat shock, those who were not exhausted with concentration remained constant. The enzyme produced in the test batch was recovered by breaking the cells in a French press to obtain with this methodology 272.000 U/g wet cells, whereas the results of the samples, which were disrupted by sonication resulted in much lower value. Was then investigated the efficiency of the protocol of sonication that was being used, by subjecting the cells to successive rounds of sonication. The results showed that actually the first cycle only 50% of the enzyme was released, indicating that the maximum production achieved was actually around 462.000 U/gcél.úmida. Study characterization of enzyme kinetics showed that the temperature of maximum activity is 65 °C with activation energy equal to 142.3 kJ/mol. Study of stability in solvent showed that the enzyme retains activity in the presence of 2- propanol. / Utilizando técnicas de DNA recombinante, o gene da lípase BTL2 de Bacillus thermocatenulatus foi clonado em E. coli BL321 sob controle do promotor λPL, com o qual a indução na produção da enzima é obtida através de choque térmico. Investigou-se, inicialmente, neste trabalho, a influência de diferentes variáveis no crescimento celular e na expressão da lípase BTL2 por E.coli recombinante, através de experimentos realizados em frascos agitados, com meio LB. Primeiramente, estudou-se a influência da temperatura de crescimento (entre 27°C e 34,2°C) e da temperatura de choque térmico (entre 37,8°C e 46,2°C) na expressão de BTL2 por E.coli recombinante, usando planejamento estatístico de experimentos. Os resultados desse estudo, onde o choque era realizado no início da fase exponencial, indicaram como as melhores temperaturas Tcresc=27°C e Tchoque=45°C, obtendose concentração celular de 0,6 g massa seca/L e atividade enzimática de 121.000U/gcél.úmida. A seguir, foi investigada a influência da fase de crescimento do microrganismo no momento do choque, através de cultivos com Tcresc=27°C e Tchoque =45°C, os resultados desses experimentos indicaram como melhor condição choque térmico no final da fase exponencial, obtendo-se nessa condição atividade de BTL2 de 258.000U/gcél. Úmida. Investigou-se assim a influência de diferentes concentrações iniciais de glicose no meio de cultivo no crescimento celular e expressão da enzima. Os melhores resultados de massa celular foram obtidos com 10g/L de glicose, obtendo-se 1,2 g/L de massa seca, μmax = 0,16 h- 1, Yx/s=0,19 g/g e atividade enzimática em torno de 250.000 U/gcél, úmida. Concentrações de glicose menores e maiores conduziram a menores concentrações celulares, mas não influenciaram na atividade enzimática final. Baseando-se em cultivos anteriores de E.coli foram realizadas simulações para cálculo de alimentação de meio em ensaio em batelada alimentada. O ensaio experimental foi realizado com 10 g/L de glicose no início do cultivo, Tcresc=30°C, Tchoque=45°C. Nesse ensaio, conseguiu-se atingir 15 g/L de massa seca, com μmax =0,38 h-1 e com atividade enzimática de 231.000 U/gcel.úmida, obtendo-se 100 vezes mais enzima nesse ensaio do que no cultivo em frasco agitado na melhor condição. Os resultados da simulação, obtidos usando modelo de Monod, previram bastante bem os obtidos experimentalmente. Não se observou acúmulo significativo de ácidos orgânicos e todos os aminoácidos.eram consumidos até o momento do choque. A partir do choque térmico, aqueles que não estavam esgotados permaneceram com concentração constante. A enzima produzida no ensaio em batelada foi recuperada rompendo-se as células em uma prensa francesa, obtendo-se com essa metodologia 272.000 U/g cel úmida, enquanto que os resultados das amostras , que eram rompidas por sonicação resultaram em valor muito menor. Investigou-se então a eficiência do protocolo de sonicação que vinha sendo utilizado, submetendo-se as células a sucessivos ciclos de sonicação. Os resultados mostraram que realmente no primeiro ciclo apenas 50% da enzima era liberada, o que indica que a máxima produção obtida estava na verdade em torno de 462.000U/gcél.úmida.Estudo de caracterização cinética da enzima mostrou que a temperatura de máxima atividade é 65°C, com energia de ativação igual a 142,3 kJ/mol. Estudo de estabilidade em solvente mostrou que a enzima mantém atividade na presença de 2-propanol.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RobertaVAC_DISSERT.pdf: 2111666 bytes, checksum: 5b317150d6db63bae04e852173ace9d2 (MD5) Previous issue date: 2009-12-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Visceral leishmaniosis caused by Leishmania chagasi, also known as calazar, presented, in the period from 1990 to 2005, tax of incidence in Brazil varying between 1 and 3 cases for 100 000 inhabitants. The Northeast region that up to the year of 2000 contributed with almost 90% of the registered cases is reducing his participation in the current decade, reaching 56% in 2005. Conventional leishmaniasis treatment is costly and it shows high toxicity, demanding more research for alternative treatments, with special interest in development of vaccines and diagnosis kits which include production of recombinant antigens by host cells. Escherichia coli has been the microorganism most studied and used as a host for recombinant protein production. Therefore, the aim of this work was to study the influence of induction on cellular growth and to verify the type of Leishmania chagasi antigens expression (intra or extracellular) during two recombinant E. coli clones (kmp11 and P36) cultivation in rotary incubator (shaker) using three different media (2xTY, TB, FASS+EL). For that, tests were carried out using conditions established in the literature for E. coli (37?C and 200 rpm) and media supplemented with antibiotics to guarantee that only competent cells grows. First, tests were carried out without induction in order to verify the two microorganisms kinetic behavior (growth and substrate consumption) in different media. Next, the induction was carried out through the addition of IPTG (1mM as final concentration), at the first hour of cultivation. It was observed that protein expression were intracellular for all clones and media tested, however the highest level of expression was clearly observed by the electrophoresis band density (intensity) for 2xTY medium and kmp11 protein. Although it contains the lowest substrate concentration, consequently, a reduced cellular concentration when compared to other media, it appeared that this medium and clone combination is the most indicated for recombinant protein production. Therefore, the objective of this work was achieved, since the interested proteins were produced. Consequently, this result motivates new studies for production optimization using different cultivation strategies / A leishmaniose visceral, causada pela esp?cie Leishmania chagasi, tamb?m conhecida como calazar, apresentou, no per?odo de 1990 a 2005, taxa de incid?ncia no Brasil variando entre 1 e 3 casos por 100 mil habitantes. A regi?o Nordeste, que at? o ano de 2000 contribuiu com quase 90% dos casos registrados, est? reduzindo sua participa??o na d?cada atual, chegando a 56% em 2005. O alto custo e toxicidade das drogas usadas no tratamento convencional dessa leishmaniose levaram a busca de tratamentos alternativos, com interesse especial na pesquisa e produ??o de ant?genos por microrganismos recombinantes para desenvolvimento de vacinas e kits de diagn?stico. A bact?ria Escherichia coli tem sido o microrganismo mais estudado e usado como hospedeiro para produ??o de prote?nas recombinantes. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo estudar a influ?ncia da indu??o no crescimento celular e a verifica??o do tipo de express?o (intra ou extracelular) de ant?genos de Leishmania chagasi atrav?s de cultivo de dois clones de E. coli recombinante (kmp11 e P36) em incubador rotativo (shaker) usando tr?s meios diferentes (2xTY, TB, FASS+EL). Para isso, foram realizados ensaios em condi??es estabelecidas na literatura para E. coli (37?C ? 200 rpm) e os meios suplementados com antibi?ticos para garantir somente o crescimento de c?lulas competentes. Na primeira etapa, foram realizados ensaios sem indu??o a fim de se verificar o comportamento cin?tico dos dois clones (crescimento e consumo de substrato) nos diferentes meios. Na segunda etapa, a indu??o foi realizada atrav?s da adi??o de IPTG (concentra??o final de 1mM), na primeira hora de cultivo. Foi observada que a express?o das prote?nas foi intracelular para todos os clones e meios testados, entretanto o maior n?vel foi verificado nitidamente pela densidade (intensidade) da banda nos g?is de eletroforese para o meio 2xTY e prote?na kmp11. Apesar de o meio 2xTY conter uma menor concentra??o de substratos, conseq?entemente, uma concentra??o celular reduzida quando comparada aos outros meios, pareceu que esta combina??o de meio e clone ? mais indicada para produ??o das prote?nas recombinantes testadas neste trabalho. O objetivo desse trabalho foi alcan?ado j? que a prote?na de interesse foi produzida. Conseq?entemente, este resultado motiva novos estudos para otimiza??o da produ??o usando diferentes estrat?gias de cultivo

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4595.pdf: 1437433 bytes, checksum: f83e0ea8c49064050b3f382c7d942d28 (MD5) Previous issue date: 2012-08-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Diseases caused by Streptococcus pneumoniae are one of the main problems of public health in the world. The pneumococcal surface protein A(PspA) is a potential canditate as carrier in a conjugate vaccine against this bacteria. Considering the inherent high losses of the purification and conjugation steps, it is fundamental to adopt a strategy of cultivation and expression that allows the obtainance of large quantities of protein. Thus, the use of Escherichia coli as expression system as well as its cultivation in complex medium constitutes promising alternatives for reducing the cost and increasing the productivity of the process. The goal of this work was to study the influence of the temperature and cultivation medium composition over the production of a PspA belonging to clade 4 protein fragment (PspA4Pro) during rE coli cultivations, aiming at to evaluate the possibility of employing vegetable-based nitrogen sources (soybean protein hydrolisates) instead of the Triptona, an animal-derived nitrogen source. The experiments were carried out in both shakers and benchscale bioreactor, using a complex medium which contained glucose and glycerol as carbon sources, lactose as inducer and Soytone, Phytone or Triptone as nitrogen sources, besides yeast extract. Samples were collected during the experiments to follow the cell growth (measurements of absorbance, dry cell weight and permittivity signal from biomass sensors), the carbon sources consumption and the production of organic acids by HPLC analysis. The stability of the plasmid (agar plates with or without kanamycin) and the production of recombinant protein (Bradford and SDS-PAGE electrophoresis followed by densitometry) were also evaluated. Preliminary experiments were performed in shake flasks, incubated at 300rpm and 37ºC, employing both complex and defined media. The highest productivity was achieved in complex medium, with a 42% superior protein production. Subsequently, nine complementary experiments were conducted in shake flasks with complex medium, under the agitation of 300rpm and temperatures of 37ºC (growth phase) and 25, 31 or 37ºC (induction phase). The largest specific production of soluble PspA4Pro was verified at 25ºC, reaching, respectively, 209±6, 192±5mg/g dry cell mass for Phytone and Triptone, with final absorbance values (after 12h of induction) of 9.0±0.4 and 8.5±0.4. The best protein production for Soytone (124±4mg/g dry cell weight) was observed at 31ºC, yielding a final absorbance 8.0±0.4. From the results obtained in the preliminary tests, the nitrogen source Phytone was selected for experiments in bioreactor. Four batch cultures were conducted in bench-scale bioreactor (5L), containing a modified auto-induction complex medium (10g/L glucose, 60g/L glycerol and 20g/L lactose), being three of them with Phytone and one with Triptone, for comparison. The best results in terms of protein production (245±7mg of PspA4Pro soluble/g dry mass) were obtained in the presence of Phytone, corresponding to an increase of 16% towards the maximum value achieved in the cultivation with Triptone. These results demonstrate the potential of vegetable-based nutrients as alternatives to animal-derived nitrogen sources in complex media, contributing to adequate these media formulations to the current guidelines of good manufacturing practices. / Doenças causadas por Streptococcus pneumoniae constituem um dos principais problemas de saúde pública mundial. A proteína A de superfície de pneumococo (PspA) é candidata em potencial a ser carreadora em vacina conjugada contra essa bactéria. Considerando as altas perdas inerentes às etapas de purificação e conjugação da proteína, é fundamental adotar uma estratégia de cultivo e expressão que permita obter grandes quantidades de proteína. Nesse sentido, o emprego da bactéria Escherichia coli como sistema de expressão e o cultivo da mesma em meio complexo se apresentam como alternativas promissoras para redução do custo e aumento da produtividade do processo. O objetivo do presente trabalho foi estudar a influência da temperatura e da composição do meio de cultivo sobre a produção do fragmento da proteína PspA do clado 4 (PspA4Pro) em cultivos de rE. coli, visando avaliar a viabilidade de utilização de fontes de nitrogênio de origem vegetal (hidrolisados protéicos de soja) em substituição à Triptona, de origem animal. Os experimentos foram realizados em câmara incubadora e em biorreatores de bancada, utilizando meio complexo contendo glicose e glicerol e lactose como fontes de carbono, lactose como indutor e Soytone, Phytone ou Triptona como fontes de nitrogênio, além de extrato de levedura. Amostras foram coletadas ao longo dos experimentos para acompanhamento do crescimento celular (medida de absorbância, massa seca e permissividade por sensor de biomassa), do consumo das fontes de carbono e da produção de ácidos orgânicos por análises em cromatografia líquida de alto desempenho. A estabilidade do plasmídeo (plaqueamento em meio contendo ou não canamicina) e a produção de proteína recombinante (Bradford e eletroforese SDS-PAGE seguida por densitometria) também foram avaliadas. Experimentos preliminares foram realizados em frascos agitados e incubados a 300rpm e 37oC, empregando tanto o meio complexo como o definido. A maior produtividade foi obtida em meio complexo, a qual foi 42% superior a alcançada com meio definido. Em seguida, nove experimentos complementares foram conduzidos em frascos agitados em meio complexo sob agitação de 300rpm e à temperatura de 37ºC (fase de crescimento) e de 25, 31 ou 37ºC (fase de indução). Verificou-se que a temperatura de 25ºC proporcionou a maior produção específica de PspA4Pro solúvel, alcançando-se, respectivamente, 209±6, 192±5mg/g massa seca para o Phytone e para a Triptona, com absorbâncias finais (após 12h de indução) de 9,0±0,4 e 8,5±0,4. Já para o Soytone, a melhor produção de proteína (124±4mg/g massa seca) foi observada à temperatura de 31ºC, obtendo-se uma absorbância de final de 8,0±0,4. A partir dos resultados obtidos nos ensaios preliminares, a fonte de nitrogênio de origem vegetal Phytone foi selecionada para experimentos em biorreator. Quatro cultivos em batelada foram conduzidos em biorreator de bancada (5L), contendo meio complexo de autoindução modificado (10g/L glicose, 60g/L glicerol e 20g/L lactose), sendo 3 com Phytone e um com Triptona, para comparação. Os melhores resultados em termos de produção de proteína (245±7mg de PspA4Pro solúvel/g massa seca) foram obtidos na presença de Phytone, correspondendo a um aumento de 16% em relação ao valor máximo alcançado no cultivo com Triptona. Esses resultados comprovam o potencial dos nutrientes de origem vegetal como alternativa às fontes de nitrogênio de origem animal em meios complexos, contribuindo para adequar as formulações desses meios às atuais diretrizes de boas práticas de fabricação.