Enzimas industriais movimentam um mercado mundial estimado em sete bilhões de dólares anualmente. Entre essas enzimas, incluem-se as queratinases, enzimas capazes de catalisar a hidrólise de queratina e com aplicação potencial na indústria coureira. A queratinase KerS14, produzida pelo Bacillus subtilis S14 é capaz de depilar o couro sem causar danos ao colágeno. Embora tenha esta capacidade de grande interesse biotecnológico, sua baixa termoestabilidade a 50 °C é uma característica desvantajosa para a aplicação industrial da enzima. Visando aumentar a produção de queratinases pelo B. subtilis S14 e a termoestabilidade da KerS14, duas estratégias foram adotadas: mudanças nas condições de cultura do microrganismo selvagem e obtenção de enzimas mutantes recombinantes. Na primeira estratégia, B. subtilis S14 foi cultivado em meio farinha de pena 1,5% e CaCl2 1%. O sobrenadante da cultura foi caracterizado e 60% da atividade queratinolítica permaneceu depois de armazenada por nove dias a temperatura de 50 °C. Em paralelo, a ORF que codifica a KerS14 foi amplificada e clonada em vetor de expressão. Os resíduos de aminoácidos G61, S98 e P239 da KerS14 foram modificados por mutagênese sítio dirigida , as enzimas mutantes foram expressas in Escherichia coli e purificadas. A enzima recombinante (rKerS14) foi mais termoestável do que a enzima selvagem. Além disso, foi verificado que o fibrinogênio e fibrina são hidrolisados pela rKerS14, mostrando que a enzima também tem potencial para desenvolver drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares. / Industrial enzymes have a world market of more than seven billion dollars per year. Keratinases are among these enzymes. They have a potential for use in tannery. The keratinase KerS14, produced by Bacillus subtilis S14, differ from other keratinases because it can depilate leather without damaging collagen. Despite this great biotechnological potential, its low thermal stability at 50 °C is an undesirable property for industrial application. In order to increase keratinases production by B. subtilis S14 and KerS14 thermal stability, two strategies were adopted: changes in wild–type microorganism growth conditions and producing recombinant mutant enzymes. In first strategy, B. subtilis S14 were grown in feather meal 1.5% and CaCl2 1 %. The supernatant obtained after fermentation was characterized and its keratinolytic activity remained in 60% after nine days of storage at 50 °C. In parallel, the KerS14 ORF was amplified and cloned into an expression vector. The KerS14 amino acid residues G61, S98 and P239 were modified and mutant enzymes were expressed in Escherichia coli and purified. It was verified that recombinant enzyme (rKerS14) is more thermal stable than the wild–type enzyme. In addition, it is able to hydrolyze fibrinogen and fibrin which is useful to develop drugs for the treatment of cardiovascular diseases.

A sepse é uma síndrome inflamatória sistêmica decorrente de uma infecção que pode causar sérios danos a todos os órgãos do paciente, podendo levá-lo à morte. Dados epidemiológicos norte americanos estimam que 750.000 pacientes são acometidos a cada ano por sepse. A taxa de mortalidade varia de 20 a 60%, dependendo da severidade, sendo semelhante para o Brasil. A terapia utilizada é o tratamento com antibióticos, manutenção de pressão sanguínea e ventilação mecânica, que apesar de extremamente caros ainda se mostram com baixa eficiência, tornando a morte por sepse em UTI mais relevante que mortes por câncer de mama ou AIDS, nos EUA. Tratamentos que demandam grande soma de recursos tendem a ser um grande problema para países como o Brasil, que através do Sistema Único de Saúde, supre o paciente com a terapêutica disponível. Por isso, a compreensão da doença e o desenvolvimento de terapias alternativas mais eficazes e mais barata são de extrema importância. Neste sentido, diversas terapias alternativas têm sido propostas (insulinoterapia, administração de proteína C ativada - Drotrecogina alfa®, antioxidantes ou anticorpos anti-citoquinas). Radicais livres são fisiologicamente produzidos pela mitocôndria e por outras enzimas, como a NADPH oxidase e xantina oxidase. Os organismos contam com defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas para não sofrer danos causados pela própria produção de radicais livres e assim, manter a homeostase celular. Na sepse, a primeira linha de defesa do organismo é o seu sistema imunológico inato mediado por fagócitos que possuem sistemas bactericidas compostos por enzimas produtoras de radicais livres e espécies reativas de oxigênio. Quando a resposta inflamatória à infecção é exagerada e a homeostase é perdida, verificam-se danos a biomoléculas dos tecidos do hospedeiro devido à própria produção de radicais livres. Estes danos podem levar a um comprometimento celular que pode progredir para disfunção orgânica e colaborar para a morte do indivíduo. Devido à importância dos radicais livres no estabelecimento e na progressão da sepse, nós formulamos a hipótese de que o balanço entre as enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), bem como os produtos de dano às biomoléculas (carbonilas e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS), podem ser importantes marcadores de severidade e de prognóstico da sepse. Nossos resultados demonstram que há um aumento na atividade da SOD sem um aumento compensatório da CAT em todos os órgãos analisados (pulmão, diafragma, coração, fígado, rim), retirados de ratos submetidos a sepse. Este desequilíbrio resulta em dano a biomoléculas (lipídeos e proteínas). Os dados sugerem que os níveis de proteínas carboniladas, mas não de TBARS, estão correlacionados com a severidade da sepse. A conseqüência do aumento de carbonilas na resposta imunológica é discutida. Apesar da importância das proteínas carboniladas na progressão da sepse, nós demonstramos uma forte correlação positiva entre a relação SOD/CAT (pulmão e rim) vs. marcadores de falência desses órgãos bem como entre TBARS vs. marcadores de falência, em ratos submetidos a CLP. Estas correlações foram revertidas com a associação de tratamento antioxidante nesses animais. Estes dados sugerem que o equilíbrio entre a SOD e a CAT é muito importante para a manutenção da homeostase redox e que a suplementação antioxidante reverte o desequilíbrio visto na sepse, os níveis de TBARS bem como protege dano renal e respiratório. / Sepsis is a systemic inflammatory syndrome secondary to an infectious process that can progress to multiple organic failure and death. Epidemiological studies estimate that 750,000 cases of severe sepsis occurs per year in United States with mortality rate ranging between 20 and 60%, and these rates reflect the Brazilian reality. Sepsis is classically treated with antibiotics, pressure support and mechanic ventilation. However these treatments have little impact on mortality rate, which is higher for sepsis than for breast cancer or HIV. Thus, a better understanding of sepsis and the development of new therapeutic approaches are extremely important and several researches have been developed in this way (e.g. insulin-therapy, activated-protein C - Drotrecogin alfa®, antioxidants and anti-cytokine antibodies). Free radicals are released normally in cell physiology. Organisms have enzymatic antioxidant defenses as well as non-enzymatic antioxidant defenses to counteract the harmful effects of free radicals and to maintain cellular homeostasis. In the onset of an infectious process like sepsis, the innate immune system is the first defense against pathogen and is carried out by macrophages and neutrophils. These cells are potent phagocytes and their bactericidal compounds include free radicals and reactive oxygen species. When the response to infection is exacerbated the homeostasis is lost and oxidative damage takes place. This damage could compromise cell function and lead the organ dysfunction and death. Considering the importance of free radicals in the onset and progression of sepsis we hypothesized that balance between superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), as well as molecular damage (carbonyl and thiobarbituric acid reactive species - TBARS), could be important markers of severity and prognosis in sepsis. We show an increase in SOD activity without a compensatory increase in catalase in the lung, diaphragm, heart, kidney and liver from rat submitted to sepsis. This imbalance contributes to oxidative damage in lipids and proteins. The data suggests that carbonyl levels but not TBARS levels are linked to sepsis severity and the implication of carbonyl upon immune response is discussed. In spite of the relevance of carbonyl in sepsis progression we found a positive correlation between SOD/CAT ratio (in kidney and lung) and organ failure markers, as well as between TBARS and organ failure markers, in rats submitted to CLP. These are prevented treating animal with antioxidants. These data suggest the importance of a coupled enzymatic activity of SOD and CAT to maintain redox homeostasis. Moreover, the antioxidant treatment reversed the SOD/CAT imbalance, TBARS levels and organ impairment.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, Instituto de Biologia, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-12T16:03:24Z No. of bitstreams: 1 2014_HelderAndreyRochaGomes.pdf: 1336642 bytes, checksum: fb6d409bf2cb5a16450071db8f68805a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-14T14:37:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_HelderAndreyRochaGomes.pdf: 1336642 bytes, checksum: fb6d409bf2cb5a16450071db8f68805a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-14T14:37:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_HelderAndreyRochaGomes.pdf: 1336642 bytes, checksum: fb6d409bf2cb5a16450071db8f68805a (MD5) / As holocelulases compreendem as enzimas que atuam na degradação dos polissacarídeos da parede celular vegetal, e apresentam várias aplicações em processos que empregam a biomassa vegetal como matéria-prima. Neste trabalho, Penicillium fellutanum foi cultivado, por 7 dias, em 6 diferentes fontes de carbono lignocelulósicas: casca de maracujá, casca do grão de soja, piolho de algodão sujo, engaço de bananeira, bagaço de cana-de-açúcar e casca de laranja. Cultivos de 15 dias nos mesmos substratos e mais uma composição de piolho de algodão, casca de soja e casca de laranja (1:1:1) foram avaliados quanto à presença de complexos pela técnica de BN-PAGE. Os extratos brutos foram pesquisados quanto às atividades de mananase, xilanase, pectinase, carboximetilcelulase (CMCase) e avicelase. O isolado de P. fellutanum demonstrou a capacidade de secretar holocelulases nas fontes de carbono avaliadas, e o perfil de enzimas secretadas foi influenciado pela fonte de carbono. Também foram detectados complexos putativos em todos os cultivos avaliados, sendo a presença de alguns deles específica em função do substrato lignocelulósico utilizado. O extrato bruto de cultivos de 5 dias em piolho-de-algodão sujo foram concentrados por ultrafiltração, e a atividade de mananase presente na fração concentrada foi parcialmente purificada por cromatografia de exclusão molecular (S100) e troca iônica (QFF) e caracterizada. Foram detectadas duas enzimas na fração semi-purificada, de tamanhos entre 45 e 66 kDa. As enzimas apresentaram atividade máxima a 55°C e 65°C, e em pH de 3,5. A atividade enzimática foi fortemente inibida pelos íons Cu2+, Ag+, Fe3+ e Hg2+, e ativada por Na+, Ca2+ e K+. A atividade enzimática não foi afetada pela maioria dos compostos fenólicos empregados, e foi fortemente ativada em presença de ácido ferúlico. Os valores de Km e Vmáx foram 1,16±0,21 mg/mL e 0,312±0,015 U.I/mL, respectivamente. Os complexos protéicos detectados serão posteriormente identificados. A atividade de mananase parcialmente purificada a partir de cultivos em piolho-de-algodão sujo demonstrou potencial para aplicação como aditivo em rações animais, em função de seu caráter ácido. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Holocellulases comprise a group of enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides, and they have several applications in processes employing plant biomass as feedstock. In this work, Penicillium fellutanum was growth during seven days in six different lignocellulosic carbon sources: passion fruit peel, soybean hull, dirty cotton gin waste, banana stalk, sugarcane bagasse and orange peel. Fifteen days cultures on the same substrates plus a composition of dirty cotton gin trash, soybean hulls and orange peel (1:1:1) were evaluated for the presence of complexes through BN-PAGE technique. Crude extracts were screened for mannanase, xylanase, pectinase, carboxymethylcellulase (CMCase) and avicelase activities. The strain of P. fellutanum was able to secrete holocellulases on evaluated carbon sources and the profile of secreted enzymes was influenced by the carbon source. Putative complexes were also detected in all cultures evaluated, and their presence was dependent on the lignocellulosic substrate used. Five days cultures on dirty cotton gin trash were concentrated by ultrafiltration, and mannanase activity present in the concentrated fraction was partially purified by size exclusion chromatography (Sephacryl S-100) and ion exchange (QFF) and characterized. Two enzymes of sizes between 45 and 66 kDa were detected in semi-purified fraction. The enzymes showed maximum activity at 55°C and 65°C and pH 3.5. The activity was strongly inhibited by Cu2+, Ag+, Fe3+ and Hg2+, and activated by Na+, Ca2+ and K+. The activity was not affected by most of the phenolic compounds employed, and interestingly was strongly activated in the presence of ferulic acid. Km and Vmax values were found to be 1.16 ± 0.21 mg / mL and 0.312 ± 0.015 IU / mL, respectively. The protein complexes detected will be subsequently identified. Partially purified mannanase activity from cotton gin waste crude extracts demonstrated potential for application as additive in animal feed, due to its acidic character.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-06-29T13:12:56Z No. of bitstreams: 1 2012_MurieleTabordaLottermann.pdf: 2431324 bytes, checksum: 6ce4316335a6c074d43d053cafea80ce (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-29T14:10:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MurieleTabordaLottermann.pdf: 2431324 bytes, checksum: 6ce4316335a6c074d43d053cafea80ce (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-29T14:10:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MurieleTabordaLottermann.pdf: 2431324 bytes, checksum: 6ce4316335a6c074d43d053cafea80ce (MD5) / A crise energética que vem atualmente sendo estabelecida mundialmente deve-se principalmente à elevação de preços e escassez de fontes de petróleo. Em virtude disso, novas fontes para a produção de combustíveis tem sido exploradas, entre elas, o amido para a produção de bioetanol. Para fermentação alcoólica o amido deve ser clivado para liberação das moléculas de glicose presentes em sua estrutura. Uma das enzimas necessárias nesse processo é a α-amilase, responsável pela hidrólise das ligações α-1,4 do amido liberando maltose e oligossacarídeos. Neste trabalho apresentamos estudo biofísico e estrutural de uma α-amilase (Amy1), proteína da levedura Cryptococcus flavus, expressa em Saccharomyces cerevisiae. A Amy1 foi obtida a partir do crescimento da levedura recombinante por 72 horas em meio de cultura com extrato de levedura como fonte de nitrogênio e purificada por cromatografia de troca iônica e de exclusão molecular. Essa enzima apresenta atividade ótima em pH 5,5. Estudos de dicroísmo circular (CD) da Amy1 recombinante em comparação com a proteína selvagem mostraram que a expressão em um organismo diferente não alterou significativamente a estrutura da α-amilase recombinante. A estrutura secundária da Amy1 recombinante em água a 25°C é constituída de 9,1% de α-hélice e 32,7% de folhas-β e da Amy1 selvagem de 8,2% de α-hélice e 34,7% de folhas-β. Nenhuma das proteínas apresentou padrão de desnaturação com a elevação da temperatura até 95°C, indicando a estabilidade estrutural dessas moléculas. Estudos de atenuação de fluorescência, utilizando atenuadores carregados e neutros e ajustes de Stern-Volmer, revelaram que a proteína recombinante apresenta uma população de triptofano predominantemente semi-enterrada. O microambiente desse aminoácido é parcialmente carregado positivamente, indicado pelos valores das constantes de Stern-Volmer (Ksv) obtidas para a partir da atenuação de fluorescência pela acrilamida, cloreto de césio e iodeto de potássio, nos pHs 5,5; 7,0 e 9,0. Mudanças conformacionais da proteína ocorrem em pHs neutro e alcalino levando a inativação da enzima. No entanto, as mudanças ocorridas em pH 5,5 são importantes para o aumento da atividade catalítica dessa enzima. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The energy crisis currently established worldwide has been the main motivation to explore new sources for fuel production, as starch used for bioethanol. In this process the α-amylase, responsible for the hydrolysis of the starch α-1-4 covalent bonds, is used to release maltose and oligosaccharides. Here, we present structural and biophysical studies of the α-amylase (Amy1) from yeast Cryptococcus flavus, expressed in Saccharomyces cerevisiae. The Amy1 was obtained from recombinant yeast in culture medium for 72 hours with yeast extract as nitrogen source. The enzyme was purified by ion exchange and molecular exclusion chromatography and presents optimal activity in pH 5.5. Structural studies using circular dichroism (CD) spectroscopy showed that recombinant and wild type amylases (Amy1) are structurally similar. The secondary structure content of recombinant and wild Amy1 in water at 25°C consists of 9.1% and 8.2% α-helix, 32.7% and 34.7% β-sheet, respectively. The amylases were characterized as thermal stable proteins, since none denaturation profile was observed under increasing temperature up to 95°C. Fluorescence decay studies using charged and neutral quenchers and Stern-Volmer approximation revealed that the recombinant protein has a population of tryptophan predominantly semi-buried. The tryptophan microenvironment is partially positively charged, indicated by the values of the Stern-Volmer constant (KSV) obtained from attenuation of fluorescence by acrylamide, cesium chloride and potassium iodide at pH 5.5, 7.0 and 9.0. Protein conformational changes occur in neutral and alkaline pH leading to inactivation of the enzyme. However, at pH 5.5 these conformational changes are important for increasing the catalytic activity of this enzyme.

Dissertação (mestrado)—Universidade Brasília, Instituto de Ciências da Saúde, 2012. / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-07-11T18:08:22Z No. of bitstreams: 1 2012_AmandaRochaMortoza.pdf: 1061965 bytes, checksum: f6a12b9f2b8fce76ff9bb1aaa8b5cb4e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-13T11:24:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AmandaRochaMortoza.pdf: 1061965 bytes, checksum: f6a12b9f2b8fce76ff9bb1aaa8b5cb4e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-13T11:24:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AmandaRochaMortoza.pdf: 1061965 bytes, checksum: f6a12b9f2b8fce76ff9bb1aaa8b5cb4e (MD5) / Lactase é o nome popularmente utilizado para a enzima β-galactosidase (E.C.3.2.1.23). As β-galactosidases são encontradas na natureza em vegetais, animais e microrganismos, sendo que suas características variam de acordo com sua origem. A literatura apresenta várias enzimas produzidas por fungos e outros microrganismos com ação de interesse biológico que foram purificadas e caracterizadas. Com a melhoria no conhecimento e na purificação de enzimas, novas possibilidades de processos industriais e aplicações na saúde humana surgiram. Neste contexto, a β-galactosidase é uma importante enzima produzida por microrganismos que desperta grande interesse à saúde, pois quando ausente no organismo dos mamíferos a lactose consumida não é digerida. A ingestão oral direta da β-galactosidase por pessoas intolerantes a lactose é uma forma diferente de aplicação da β-galactosidase, visando à digestão da lactose do leite e seus derivados. Além da ingestão da β-galactosidase, esta enzima também está sendo aplicada na indústria de laticínios para hidrolisar a lactose do leite obtendo-se, assim, alimentos com baixos teores de lactose, melhorando a solubilidade e digestibilidade do leite e derivados lácteos, ideais para consumidores intolerantes à lactose. Esta aplicação dá origem a novas pesquisas nesta área, na procura de β-galactosidase com características favoráveis ao ambiente gástrico ou indicadas para o uso industrial. Neste trabalho o fungo Aspergillus foetidus isolado do Cerrado expressou a enzima β-galactosidase em meio líquido contendo resíduo de soja como fonte de carbono após sete dias de fermentação a 28°C. A enzima produzida extracelularmente foi purificada por sistema micelar de duas fases aquosas. A melhor condição de purificação foi obtida com sistema formado por 8%(p/p) Triton X-114, 10%(p/p) caldo fermentado e 28°C como temperatura de incubação. Nesta condição, 89,8% da atividade enzimática adicionada ao sistema foi recuperada na fase pobre em micelas. A caracterização bioquímica da enzima presente na fase pobre em micela revelou um pH ótimo igual a 2,6 e uma temperatura ótima igual a 60°C, valores que favorecem a aplicação industrial da β-galactosidase purificada. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Lactase is the name popularly used for the enzyme β-galactosidase (EC3.2.1.23). β-galactosidases are found naturally in plants, animals and microorganisms, and their characteristics vary according to their origin. The literature contains several enzymes produced by fungi and other microorganisms which shows biological activity. Such enzymes have been purified and characterized. With growing knowledge and greater enzyme purification, new possibilities for applications in industrial processes and human health have emerged. In this context, the β-galactosidase is an important enzyme produced by microorganisms that attracts great interest to health, because when absent in the body of mammals the ingested lactose is not digested. The direct oral intake of β-galactosidase by lactose intolerant people is a different form of application of the enzyme in order to digest lactose present in milk and dairy products. Besides the intake of β-galactosidase, this enzyme is also being applied in the dairy industry to hydrolyze the lactose in milk yielding foods with lactose low levels, improving the solubility and digestibility of milk and dairy products, which is ideal for lactose intolerant consumers. This application gives rise to new research in this area, in the search for β-galactosidase with favorable characteristics to the gastric environment or suitable for industrial use. In this work the fungus Aspergillus foetidus isolated from the Cerrado expressed the enzyme β-galactosidase in liquid medium containing soybean waste as carbon source after seven days of fermentation at 28 °C. The enzyme produced in the medium was purified by aqueous two-phase micellar system. The best condition was obtained in a purification system consisting of 8% (w/w) Triton X-114, 10% (w/w) fermentation broth and 28 °C as incubation temperature. In this condition, 89.8% of enzyme activity added to the system was recovered in the micelle-poor phase. The biochemical characterization of the enzyme present in the micelle-poor phase revealed an optimum pH equal to 2.6 and an optimum temperature equal to 60 °C, favoring the industrial application of purified β-galactosidase.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-14T12:26:54Z No. of bitstreams: 1 2012_RobsonWillianMeloMatos.pdf: 6258233 bytes, checksum: 0e725cb3ceb56998a968102c211ad496 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2012-09-18T12:22:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RobsonWillianMeloMatos.pdf: 6258233 bytes, checksum: 0e725cb3ceb56998a968102c211ad496 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-18T12:22:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RobsonWillianMeloMatos.pdf: 6258233 bytes, checksum: 0e725cb3ceb56998a968102c211ad496 (MD5) / Neste trabalho foi analisado, por microscopia eletrônica de varredura, o crescimento do fungo filamentoso Penicillium echinulatum sobre bagaço de cana-de-açúcar e características morfológicas foram descritas. Essa espécie apresentou hifas ramificadas e com septação. Os conídios apresentaram formato globoso a subgloboso e diâmetro entre 3,5 a 5m. O crescimento do microrganismo sobre o bagaço causou a ruptura parcial desse substrato, observada a partir do aspecto quebradiço e esfarelado das fibras, assim como pela propagação das hifas entremeando as fibrilas. Por meio de estudos de qRT-PCR, foi comparado o nível de acúmulo de transcritos dos genes egl, cbh, bgl e swo de P. echinulatum, cultivado em condições indutoras ou repressoras para genes do complexo celulolítico e em diferentes tempos de crescimento. Em condição indutora, esse fungo apresentou um pico de acúmulo de transcritos dos genes egl, cbh e swo, após 48h de cultivo. Após 24h, foi observado por microscopia eletrônica de trasmissão alterações ultraestruturais condizentes com células com elevada função de produção e secreção de proteínas. O gene bgl, por sua vez, não apresentou indução do nível de transcritos comparável aos demais genes, mesmo quando cultivado em fonte celulósica. A análise quantitativa do acúmulo de transcritos desses genes também foi investigada na presença de drogas com ação inibitória da atividade de histonas desacetilases (Tricostatina A - TSA e butirato de sódio - NaBut), ou inibidoras da atividade de DNA metiltransferases (5-aza-2’-deoxicitidina – 5-AZA). A droga 5-AZA não causou alteração do acúmulo de transcritos de genes de celulases. Com as drogas NaBut e TSA, observou-se a redução do nível de transcritos para os genes egl, swo e cbh, em comparação a condição controle (ausência de droga). Utilizando-se concentrações menores desses dois compostos, somente foi observada a redução do acúmulo de transcritos dos genes egl e swo sob a ação de TSA. Não foi observada influência dos moduladores epigenéticos sobre a atividade enzimática dos sobrenadantes de culturas desse fungo sobre substratos celulósicos. Adicionalmente, o perfil proteico dos sobrenadantes de cultura não apresentou alteração sob efeito dessas drogas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Penicillium echinulatum morphological characteristics and its growth on sugarcane bagasse were evaluated by scanning electron microscopy. This species presented septated and branched hyphae. P. echinulatum conidia presented globose/subglobose shape and diameter between 3.5 and 5m. The growth of this microorganism on sugarcane bagasse caused partial rupture of the substrate structure. The influence of different carbon sources (swollen cellulose or glucose) on the accumulation of transcripts of bgl, egl, swo and cbh genes were determined using real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Under induction conditions, transcription of egl, cbh and the swo genes was hyper induced after 48h incubation. On the other hand, the transcription of bgl gene was not induced to the same level of the other genes, even under induction conditions. Moreover, after 24h, mycelial ultrastructure revealed features of a typical protein production and secretion cell. The impact of epigenetic modifiers Trichostatin A (TSA), sodium butyrate (NaBut) and 5-aza-2’-deoxycitidine (5-AZA) on the transcription of bgl, egl, swo and cbh genes were determined using qRT-PCR. The level of P. echinulatum celulase transcripts was not altered by 5-AZA. On the other hand, TSA and NaBut reduced egl, swo and cbh transcripts levels in comparison with the control condition (drug absence). Lower concentrations of these two compounds were used and only TSA had effect on transcripts levels of egl and swo genes. No difference in enzyme activity towards cellulosic substrates and also in the secreted proteins electrophoretic profile was observed under the influence of these epigenetic modifiers.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade em Ciências da Saúde, Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-03-05T12:24:08Z No. of bitstreams: 1 2012_MairaAzevedoFeitosaAraujo.pdf: 2203133 bytes, checksum: 14d6393d76f3384bb0d2ce1953a8eebd (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-03-05T15:35:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MairaAzevedoFeitosaAraujo.pdf: 2203133 bytes, checksum: 14d6393d76f3384bb0d2ce1953a8eebd (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-05T15:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MairaAzevedoFeitosaAraujo.pdf: 2203133 bytes, checksum: 14d6393d76f3384bb0d2ce1953a8eebd (MD5) / O câncer é descrito como uma doença que é desencadeada por fatores genéticos e epigenéticos. Dentre as manifestações epigenéticas ligadas à carcinogênese a desregulação nas modificações pós-traducionais que ocorrem nas caudas das histonas tem um papel de grande importância. Vários são os tipos de modificações que podem ocorrer e vários são os sítios a serem modificados, entre eles a metilação em resíduos de lisina. As metiltransferases de lisina são um grupo de enzimas que contem um domínio SET, o qual catalisa a adição de grupos metila em resíduos de lisina. Inicialmente, as metiltransferases de lisina foram identificadas como específicas para substratos de histonas, mas estudos posteriores mostraram que estas enzimas também metilam outras proteínas que não-histonas. A família SMYD de metiltransferases consiste no agrupamento de cinco proteínas que apresentam em sua estrutura ambos os domínios SET e MYND. Ainda que os membros desta família (SMYD1 a SMYD5) ainda não tenham sido completamente caracterizados, já foi descrito que expressões aberrantes de algumas destas proteínas estão ligadas à progressão tumoral de diversos tecidos como colorretal, fígado e mama. O SMYD5 foi recentemente descrito como fator importante na atividade inflamatória de macrófagos, mas seu papel na tumorigênese não foi investigado. Seguindo o perfil de outros membros da família SMYD, no presente trabalho investigamos uma possível relação do SMYD5 como o câncer de mama. Foi constatado que o SMYD5 está downregulado em todas as linhagens de células de câncer de mama estudadas. Ainda, obervamos que ele se encontra frequentemente hipoexpresso em amostras de câncer de mama. Entretanto, experimentos de knockdown ou superexpressão do SMYD5 não mostraram efeito significativo na proliferação celular in vitro. Revelamos que o SMYD5 está localizado em ambos núcleo e citoplasma e apresenta-se progressivamente menos presente em tecidos tumorais, quando comparado com tecido normal de mama. Os resultados sugerem uma forte ligação entre a baixa expressão do SMYD5 e o estado maligno da mama e o apontam como um potencial supressor tumoral no contexto mamário. Estudos posteriores ajudarão na compreensão dos mecanismos envolvidos na relação do SMYD5 com o câncer de mama. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cancer is described as a disease triggered by genetic and epigenetic factors. Within epigenetic manifestations linked to carcinogenesis there are the post translational modifications that occur at histone tails. Several modification types may occur and several sites can be modified, amongst them there is the methylation at lysine residues. Lysine methyltransferases are a group of enzymes containing a SET domain, responsible for catalysing the addition of methyl groups at lysine residues. Early on, lysine methyltranferases were thought to be histone substrate specific, but further studies have shown these enzymes to be capable of methylating other non- histone proteins. The SMYD family of methyltransferases consists in five proteins that present both the SET and MYND domains within their structure. Even if members of this family (SMYD 1-5) are yet to be completely characterized, it has been described that aberrant expressions of some of these family members are linked to tumor progression in various tissues, such as colorectal, liver and breast. SMYD 5 has recently been described as an important factor in inflammatory activity mediated by macrophages, but its part in tumorigenesis had not been investigated thus far. Following the profile for other members of the SMYD family, in the present study a possible relation between SMYD5 and breast cancer has been sought. It was found that SMYD5 is downregulated in all breast cancer cell lines studied. In adition, it is also frequently hipoexpressed in clinical breast cancer samples. However, its knockdown or super expression has had no effect on in vitro cellular proliferation. We showed that SMYD5 is located in both the nucleus and cytoplasm and it is also progressive less present in carcinogenic tissues, if compared to regular breast tissue. The results suggest a strong link between SMYD5 low expression states and malignant breast and points it towards to a potential tumor suppressor role in breast context. Further studies will help in understanding the mechanisms involved in the relationship between SMYD5 and breast cancer.

Tese (doutorado)— Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-04-15T15:56:47Z No. of bitstreams: 1 2012_AdelsonJoelSilva.pdf: 3485894 bytes, checksum: fadc62357304c46ebd85bf90f278ae40 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-17T13:09:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AdelsonJoelSilva.pdf: 3485894 bytes, checksum: fadc62357304c46ebd85bf90f278ae40 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-17T13:09:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AdelsonJoelSilva.pdf: 3485894 bytes, checksum: fadc62357304c46ebd85bf90f278ae40 (MD5) / As enzimas que degradam parede celular vegetal produzidas por micro-organismos possuem aplicações biotecnológicas importantes, incluindo a produção de bioetanol. Algumas batérias anaeróbicas são capazes de produzir complexos multi-enzimáticos chamados de celulosomos, enquanto os fungos filamentosos normalmente secretam enzimas hidrolíticas individuais que atuam sinergisticamente no processo de degradação de polissacarídeo. Neste trabalho, nós mostramos que os fungos filamentosos Trichoderma harzianum e Trichoderma reesei, secretam complexos multi-enzimáticos ativos quando cultivados em meio contendo o resíduo agrícula bagaço de cana-de-açucar e lactose (ou galactose), respectivamente. O secretoma de ambos os fungos foram analisadas primeiramente por 1D-BN (blue native)-PAGE. Bandas eletroforéticas correspondendo a possíveis complexos foram submetidas à separação eletroforética usando sistema Tricina-SDS-PAGE para demonstrar que são constituídas de componentes menores. Ensaios zimográficos foram realizados usando 1D-BN-PAGE e 2D-BN/BN-PAGE para verificar atividades celulolítica e xilanolítica em um mesmo complexo. Finalmente, os complexos foram digeridas por tripsina e analisadas separadamente por LC-MS/MS e os programas MASCOT e MS-BLAST para identificação das proteínas constituintes. Os resultados mostraram que ambos os fungos produzem complexos constituídos por enzimas celulolítica e xilanolítica e outras proteínas, as quais apresentam uma complementariedade funcional no processo de degração de substratos polissacaridícos. Em T. harzianum foram analisados três complexos, os quais apresentaram os seguintes componentes: celobiohidrolase I, celobiohidrolase I-II, alfa-L-arabinofuranosidase, xilana 1,4- -xilosidase (complexo I); acetilxilan esterase, ndoquitinase, arabinogalactana, endo-1,4- -galactosidase, celobiohidrolase I, cutinase, ?-N-arabinofuranosidase e endo- -1,4-xilanase (complexo II); glucoamilase, endo-beta-1,4- glucanase, swollenina, beta-endoglucanase ancorado a GPI, alfa-L-arabinofuranosidase, ?-1,3-glucanase (complexo III). T. reesei produziu mais complexos multi-enzimáticos quando cultivado em meio contendo lactose que galactose. A composição dos complexos I e II em lactose parece torná-los melhores equipados para biodegradação. Os componentes dos complexos do meio com lactose são: glicosil hidrolases 20, 36, beta-1,3-endoglucanase, alfa-alactosidase, exo-beta-1,4-glucanase, aril-alcool oxidase, "predicted protein" 43, "predicted protein" 20 (complexo I); beta-1,3-endoglucanase, "predicted protein" 20, 48, 44, 61, 52, 42, glicosil hidrolase 37, quitinase (complexo II). Os complexos do meio com galactose são: glicosil hidrolases 16, 36, 54, 55, beta-1,3-endoglucanase, catalase/peroxidase bifuncional, "predicted protein" 20 (complexo I); "predicted protein" 20, 44, 61, 52, beta-1,3-endoglucanase, glicosil hidrolase 3, 37, quitinase, amidase (complexo II). Além disso, o complexo I é mais expresso em meio contendo lactose que galactose, ocorrendo inversamente com o complexo II. Juntos, esses dados mostram que a fonte de carbono influi na composição dos complexos multi-enzimáticos em T. reesei. A cooperatividade funcional entre os elementos dos complexos dos fungos são discutidos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Plant cell degrading enzymes produced by microorganisms possess important biotechnological applications; including the production of bioethanol . Some anaerobic bacteria are abl e to produce multienzymatic complexes called cellulosomes whilst filamentous fungi normally secrete individual hydrolytic enzymes that act synergically in the process of polysaccharide degradation. I n the present work we demonstrated that the filamentous fungi Trichoderma harzianum and Trichoderma reesei secrete active multienzymatic complexes when culti vated i n culture media suppl emented with the agricultural residue sugarcane bagasse and lactose (gal actose), respecti vely. The secret ome of bot h f ungi were analysed by 1D-BN (blue native) PAGE. Protein bands corresponding to possible complexes were submitted to electrophoretic separation using a Tricine-SDS system in order to demonstrate that they were constituted by smaller components. Zymogr aphic assays were performed using 1D-BN-PAGE and 2D-BN/BN-PAGE o verify cellulolytic and cellulolytic activities in the complexes. Finally, the complexes were trypsin di gested, subjected to LC-MS/MS and the results analyzed using the soft ware MASCOT and MS-BLAST to identify t hei r component s. The results demonstrated t hat both organisms produced complexes constituted by cellulolytic and xylanolytic enzymes as well as other protei ns relat ed to polysacchari de degradation. Three T. harzianum complexes that were analyzed presented the following components: cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase I-II, al pha-L-arabinofuranosidase, xylan 1,4- - xylosidase (compl ex I); acetilxylan esterase, endochitinase, arabinogalactan, endo-1, 4- -galactosidase, cellobiohydrolase I, cutinase, -N-arabi nofuranosidase e endo- -1,4-xylanase (complex II); glucoamilase, endo-beta-1,4-glucanase, swollenin, GPI-anchored beta-endoglucanase, alpha-L-arabinofuranosi dase and -1,3-glucanase (compl exo III). T. reesei produced more multienzymatic compl exes when grown in lactose than in galactose containi ng medium. The composition of compl exes I and II in lactose possibly make them more suitable for biodegradation. The component s of t he compl exes produced i n t he l act ose medium are: glycosyl hydrolases 20, 36, beta-1,3-endogl ucanase, alpha-gal actosidase, exo-bet a-1, 4-glucanase, aryl - 1, 3- ex II). The compl exes produced in the gal actose medi um are glycosil hydrolases 16, 36, 54, 55, bet a-1, 3- 20, 44, 61, 52, bet a-1, 3-endoglucanase, glycosyl hydrolase 3, 37, chitinase and ami dase (complex II). In addition, compl ex I is more expressed in l actose than in gal actose medium whil e compl ex II is more expressed in galactose. Overall, the dat a show that the carbon source infl uence the composition of T. reesei multienzimatic complexes. The functional cooperativity between the elements of the complexes are discussed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-04-16T11:48:41Z No. of bitstreams: 1 2009_TheyssaFernandaBarbosaBorges.pdf: 1589278 bytes, checksum: 9ed964216329f161a08ac2c9b4fd1e06 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-19T20:06:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_TheyssaFernandaBarbosaBorges.pdf: 1589278 bytes, checksum: 9ed964216329f161a08ac2c9b4fd1e06 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-19T20:06:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_TheyssaFernandaBarbosaBorges.pdf: 1589278 bytes, checksum: 9ed964216329f161a08ac2c9b4fd1e06 (MD5) Previous issue date: 2009-02-13 / Atualmente, o mercado tornou-se favorável para a produção de etanol a partir de biomassa. E o Brasil já tem considerável experiência na produção de bioetanol a partir de cana-de-açúcar, no entanto ela é uma planta sazonal e requer terra de plantio de alta qualidade para seu crescimento. Como substrato alternativo para produção de etanol no Brasil a baixo custo, temos a mandioca. O grupo de biotecnologia molecular da UnB possui uma linha de pesquisa que visa diminuir os custos da produção de etanol a partir de amido de mandioca. Em 1995, Moraes et al. construiu oito linhagens de Saccharomyces cerevisiae capazes de converter amido a etanol, no entanto o vetor utilizado nas construções é epissomal e por não ser estável pode ser facilmente perdido durante o processo industrial onde há o stress ambiental e competição entre as linhagens. Para reverter este quadro, este trabalho visou a construção de um vetor integrativo baseado na seqüência δ do transposon Ty de Saccharomyces cerevisiae no qual foram inseridos os cassetes de expressão de α-amilase de Bacillus subtilis e glicoamilase de Aspergillus awamori, gerando três diferentes vetores: pTA (contendo o cassete da α-amilase), pTGA (contendo o cassete da glicoamilase) e pTAGA (contendo ambos os cassetes). A linhagem semi-industrial MFL e a linhagem industrial JP1 foram transformadas com os vetores construídos. Foram encontrados cinco clones positivos para atividade amilolítica nas transformações da MFL e dois na JP1, a baixa eficiência de seleção de transformantes deve-se ao fato de a marca de seleção não estar inserida no vetor integrativo. As curvas de crescimento dos clones positivos mostraram que não houve alterações no crescimento das linhagens após integração dos vetores e os testes de atividade enzimática mostraram que os clones estão produzindo as enzimas de interesse. Além disso, os testes de estabilidade mitótica mostraram alta estabilidade do vetor nos clones positivos da linhagem JP1, o que torna este sistema de expressão atrativo para produção industrial. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / At present, the market became favorable for ethanol production from biomass. And Brazil already has considerable experience in the bioethanol production from sugar-cane, however it is a seasonal plant and it requires land of planting of high quality for his growth. As alternative substrate for low cost ethanol production in Brazil, we have the cassava. The molecular biotechnology group of UnB has a line of research that aims to reduce the costs of ethanol production from cassava starch . In 1995, Moraes et al. built eight Saccharomyces cerevisiae strains able to convert starch to ethanol, however the vector used in this constructions is epissomal and because of not being stable it can be easily lost during the industrial process where there is the environmental stress and competition between strains. To revert this picture, this work aimed the construction of an integrative vector based on sequence δ of the Saccharomyces cerevisiae transposon Ty in which the cassettes of expression of Bacillus subtilis α-amilase and Aspergillus awamori glicoamilase were inserted, resulting three different vectors: pTA (containing the cassette of α-amilase), pTGA (containing the cassette of the glicoamilase) and pTAGA (containing both cassettes). The semi-industrial strain MFL and the industrial strain JP1 were transformed by these vectors. Five positive clones were found with amylolytic activity in the MFL transformations and two in the JP1, the low selection efficiency of positive clones is due to the fact that the selection mark wasnt inserted in the integrative vector. The positive clones growth curves showed that there were no alterations in the strains growth after vectors integration and the tests of enzymatic activity showed that the clones are producing the enzymes of interest. Moreover, the mitotic stabilitys tests showed high stability of the vector in the positive clones of the strain JP1, which makes this system of expression attractive for industrial production.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-04-19T17:39:44Z No. of bitstreams: 1 2009_PrisciladaSilvaLima.pdf: 1572149 bytes, checksum: 33500bc789c2fabbdcfba622796b2d27 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T20:34:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_PrisciladaSilvaLima.pdf: 1572149 bytes, checksum: 33500bc789c2fabbdcfba622796b2d27 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T20:34:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_PrisciladaSilvaLima.pdf: 1572149 bytes, checksum: 33500bc789c2fabbdcfba622796b2d27 (MD5) Previous issue date: 2009-07 / Lacases são enzimas de ampla aplicação biotecnológica, como na remoção de lignina da polpa de celulose e biorremediação de compostos fenólicos de indústrias farmacêuticas e têxteis. Em um estudo iniciado por Garcia e colaboradores (2006), o fungo filamentoso Pycnoporus sanguineus foi descrito como produtor de lacases aplicadas no tratamento de efluentes fenólicos industriais. Dando continuidade a este estudo, um gene de lacase de P. sanguineus foi isolado, clonado e expresso na levedura metilotrófica Pichia pastoris, visando a produção desta enzima em larga escala para aplicação na biorremediação de efluentes fenólicos industriais, assim como, no branqueamento de papel e delignificação de biomassa lignocelulósica para produção de bioetanol. O cDNA da lacase foi obtido através de uma reação de RT-PCR utilizando primes específicos desenhados com base na seqüência de uma lacase de P. sanguineus depositada no banco de dados de seqüências no Genbank. Como produto da RT-PCR foi amplificado um segmento de DNA com 1500 pb. O cDNA foi, clonado no vetor PGEM-T e utilizado na transformação de células de Escherichia coli, sendo obtidos 18 clones positivos. Destes o clone denominado PGLac 1 foi utilizado para a obtenção das construções 1 e 2. Na construção1 o inserto obtido na clonagem em pGEM-T foi subclonado em pPICZA e utilizado na transformação de Pichia pastoris. Para esta construção, não foram detectados clones de P. pastoris produtores de lacases. Na construção 2, o cDNA foi subclonado utilizando-se o vetor de expressão pPIC9. Em seguida, foi realizada a transformação de P. pastoris GS115. Os transformantes foram plaqueados em meio seletivo sólido (MD) contendo o substrato AzBTS, sendo observados clones com a atividade enzimática de interesse. O cDNA clonado no vetor pPICZA10 foi seqüenciado. A seqüência obtida apresentou identidade de 97% com as lacases de P. sanguineus e P. cinnabarinus e 79% com uma lacase de Trametes sp. Além disto, a seqüência protéica predita possui 502 aminoácidos, 3 domínios conservados de cobre-oxidases, massa molecular de 58,8 KDa e ponto isoelétrico de 5,7. A seqüência predita foi modelada utilizando-se a ferramenta SPDBV, tendo como base a estrutura de uma lacase de C. cinereus. A lacase heteróloga tem 57% de identidade com a seqüência molde e uma estrutura semelhante a de outras lacases de fungos da podridão branca. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Lacases are enzymes with potential application in a set of industrial processes. Some authors described their use in bioremediation of phenolic compounds of pharmaceutical and dyes industries and in the removal of lignin of the cellulose pulp. In this study a laccase from Pycnoporus sanguineus previously described by Garcia and co-workers 2006), was expressed in the metylhothrofic yeast Pichia pastoris, aiming their production for biotechnological purposes. The laccase cDNA was obtained by RT-PCR and cloned using the vector PGEM-T. Escherichia coli harbouring the construction were selected and the clone called PGLac 1 was used for further experiments (subcloning and sequencing). Two different vectors were used for P. pastoris transformation, pPIC9 e pPICZ-A. The laccase activity was detected only for P. pastoris harbouring the construction 2 (pPIC9/laccase cDNA). The heterologous laccase presents identity with lacases from P. sanguineus, P. cinnabarinus (97%) and Trametes sp. (79%). Moreover, the predicted protein has 502 amino acids, 3 cupric-oxidase conserveddomains, molecular mass of 58,8 KDa and isoelectric point of 5,7. The molecular modelling revelead a globular protein with a active site containing copper atoms, coordinated by histidin and cistein residues.