Orientador: Moustafa Mohamed El-Guindy / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-18T07:59:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingues_SandraReginaToniolo_M.pdf: 3661001 bytes, checksum: d11178932642d2c713506919f6656f80 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: As informaçôes coletadas nos últimos anos demonstram que o câncer é iniciado no organismo pela conversão maligna de uma única célula. Esta conversão resulta da mutação do conjunto de gens responsável pelos processos de divisão e diferenciação celular. As diferenças peculiares que caracterizam as células convertidas foram discutidas por Elias et al.(1985). Esses autores relataram alterações significantes nas enzimas envolvidas na via glicolítica; dados semelhantes foram obtidos em nossos laboratórios em relação às transaminases (EL-Gulndy et al. em vias de publicação). Estudou-se neste trabalho a atividade da Lactato desidrogenase, Malato desidrogenase e Glicose-6 fosfato desidrogenase em células de camundongos normais e portadores de tumor de Erhlich submetidos ou não ação da droga antineoplásica ME-IN já em experimentação em nossos laboratórios. As referidas enzimas, foram analisadas bioquimicamente e também foram estudadas através de análise eletroforética. Com o intuito de reavaliar os atuais nlecanlslnos básicos da quimioterapia empregou-se várias drogas antineoplásticas elaboradas dentro do projeto de cancerologia já em andamento neste laboratório. Essas drogas foram administradas em doses diárias nos animais portadores de tumor. As atividades enzimáticas da Lactato desidrogenase, Malato desidrogenase e Glicose-6 fosfato desidrogenase foram avaliadas antes e depois da administração da droga / Abstract: The information acumulated in Iast years showed that cancer starts by the conversion of a unique cell which furrther proliferate to stablish a tumor. Probably the mutation responsable tor cell conversion is locatted in the gene or group of genes responsable for cellular division and differentiation mechanisms. Alteration of the metabolic activlties in the converted cells are being dlscussed. Elias, 1985 reported a signiflcant diferences in the activities of the enzymes envolved in the glycolysls pathway between normal and cancer cells. Similar differences in the activities of transamination enzymes was observed lin our labs. (EI-Guindy et al. to be published). The activity of Lactate Dehydrogenase, Malate Dehydrogenase and Glucose-6 Phasphate Dehydrogenase in mice normal and tumoral cells submitted or not to a new anti-neoplasic drug have being studied. / Mestrado / Fisiologia e Biofisica do Sistema Estomatognatico / Mestre em Ciências

Ingeniería en Biotecnología Molecular / Actualmente, el uso de enzimas corresponde a un área de la biotecnología de gran crecimiento y desarrollo, la cual ha buscado dar solución a problemas de tipo industriales, biomédicos y domésticos; representando una solución específica, sustentable y ecológicamente amigable. En el ámbito de la innovación, como parte de una mejora tecnológica se ha buscado obtener enzimas estables y que puedan ser utilizadas en condiciones extremas de pH, temperatura, salinidad etc. Los microorganismos provenientes de ambientes extremos representan una buena fuente de este tipo de enzimas, ya que generalmente estos microorganismos precisan de este tipo de enzimas para la sobrevida en las condiciones hostiles de su hábitat. Un ambiente extremo que ha sido poco explorado en este sentido es el Desierto de Atacama. Conocido por ser el desierto más antiguo y árido del planeta, presenta condiciones ambientales que hacen que sea considerado como un ambiente extremo único en el mundo. Pese a estas condiciones adversas, diversos microorganismos han podido ser aislados desde este ambiente tan particular. Entre ellos esta Streptomyces leeuwenhoekii C34 que presenta varios grados de tolerancia a condiciones extremas. En este trabajo se realizó la búsqueda bioinformática de enzimas de interés comercial en el genoma de S. leeuwenhoekii C34. Teniendo en cuenta el gran potencial biotecnológico y diversidad de aplicaciones de las enzimas lipasas, se seleccionó el gen sle_62990 que codifica para una lipasa putativa GDSL- SGNH. Con el fin de estudiar este gen se generó la cepa LIP de S. leeuwenhoekkii C34 que sobre expresa el gen sle_62990. Con esta cepa se pudo comprobar que el gen sle_62990 codifica para una lipasa extracelular funcional y que presenta actividad contra p-nitrofenil palmitato. También se intentó la expresión heteróloga de la enzima en el medio intracelular de E. coli. Sin embargo, no se obtuvieron los resultados esperados, ya que se encontró en cuerpos de inclusión. / Currently, the use of enzymes corresponds to a growing area in the biotechnology field which has sought to solve industrial, biomedical, and domestic problems. These represent a specific, sustainable and ecologically friendly solution. Stable enzymes that can be used under extreme conditions such as high pH, temperature and salinity are of particular interest for biotechnological improvement. Microorganisms from extreme environments require these types of enzymes in order to survive under the harsh conditions of their habitat. Therefore, they represent a good source of interesting enzymes. An extreme environment that has been little explored is the Atacama Desert. The Atacama Desert is known as the oldest and driest desert on Earth. It presents extreme a environmental conditions. Despite these harsh conditions, various microorganisms have been isolated from this particular environment. Among them Streptomyces leeuwenhoekii C34, that shows several degrees of tolerance to extreme conditions. In this work, possible commercial enzymes were searched in the genome of S. leeuwenhoekii C34. Considering the great biotechnological potential and the diversity of applications of the lipases enzymes the gene sle_62990 that encoded for a putative lipase was selected. In order to study this gene, the LIP strain of S. leeuwenhoekii C34 that over-expressed the sle_62990 was generated. The over-expression allowed to confirm that the sle_62990 gene encodes for a functional extracellular lipase and it has activity against p-nitrophenyl palmitate. Attempts to heterologously express this gene in E. coli were unsuccessful.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-07Bitstream added on 2014-06-13T19:22:45Z : No. of bitstreams: 1 knob_a_dr_rcla.pdf: 1207813 bytes, checksum: 318e70abc84de2d440d3a9b60c7b7088 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Enzimas degradadoras de xilana, principal componente da hemicelulose, têm sido utilizadas em várias aplicações biotecnológicas, sendo que em alguns processos é necessário o uso de enzimas purificadas. Aplicações comerciais para as enzimas xilanolíticas envolvem a hidrólise enzimática da xilana, que está presente nos resíduos agrícolas e agroindustriais, sendo convertido a xilose e outros açúcares, que podem ser utilizados como substratos em processos fermentativos para a obtenção de proteínas celulares, combustíveis líquidos e outras substâncias químicas. A utilização destas enzimas também diminui a liberação de agentes poluentes em determinados efluentes, como da indústria de polpa de celulose. Xilanases e β- xilosidases são produzidas principalmente por bactérias e fungos, sendo que em geral, os fungos as produzem em níveis mais elevados. O gênero Penicillium apresenta espécies já caracterizadas como boas produtoras destas enzimas. Uma linhagem deste gênero, isolada de solo brasileiro, na região da Mata Atlântica e identificada como Penicillium sclerotiorum destacou-se por produzir xilanase em níveis elevados. O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da influência das condições de cultivo sobre a produção do complexo xilanolítico produzido por P. sclerotiorum, na caracterização físico-química desse sistema, bem como purificação e caracterização bioquímica de seus principais componentes. Por meio da determinação das condições ótimas de produção e da caracterização deste complexo enzimático foi possível estabelecer metodologias eficientes de purificação de xilanases e uma β-xilosidase. Através da caracterização físico-química das enzimas purificadas, foi possível avaliar seu potencial biotecnológico, visando futuras aplicações em processos industriais. / Xylan degrading enzymes, the main component of hemicellulose, have been used in various biotechnological applications, and in some cases the use of purified enzymes is necessary. Commercial applications of xylanolytic enzymes involve the enzymatic hydrolysis of xylan, which is present in agricultural and agro-industrial wastes, and can be converted to xylose and other sugars, which can be further used as substrates in fermentation processes to obtaining cellular protein, liquid fuels and other chemicals. The utilization of these enzymes also decreases the release of certain pollutants in wastewater, as in the pulp and paper industry. Xylanases and β-xilosidases are mainly produced by bacteria and fungi, and in general, the fungi produce them at higher levels. The genus Penicillium presents species already characterized as good producers of these enzymes. One strain of this genus isolated from Brazilian soil in the Mata Atlântica region and identified as Penicillium sclerotiorum attracted attention by producing xylanase in high levels. The objective of this study was to evaluate the influence of culture conditions on the production of the xylanolytic complex produced by P. sclerotiorum to characterize physical and chemical properties of this system as well to purify and biochemical characterize its main components. By determining optimal conditions for production and by characterizing this enzymatic complex it was possible to establish efficient methodologies for purification of xylanases and one β-xylosidase. Through their physical and chemical characterization, it was possible to evaluate their biotechnological potential for future applications in industrial processes.

Orientador: Hamilton Cabral / Banca: Rodrigo Simões Ribeiro Leite / Banca: Fabiana Fonseca Zanoelo / Resumo: A produção de proteases de origem microbiana depende das condições de cultivo e da diversidade bioquímica de cada espécie. Estudos comparativos entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm) usando farelo de trigo e meio sintético, respectivamente, foram realizados para a determinação dos parâmetros de produção de proteases pelo fungo Aspergillus fumigatus Fresenius. A melhor produção de protease foi em FES no período de 96 horas utilizando farelo de trigo, temperatura de 30 ºC e 1x106 esporos/5g de substrato com 1.517 U/mL. Em FSm o pico de produção foi em pH 6,0, a 30ºC, 5x105 esporos/mL de meio no período de 72 e 96 horas em meio contendo 0,5 e 0,25% de caseína, respectivamente, ambos com 40 U/mL. Conforme a produtividade dos processos fermentativos, o extrato enzimático da FES foi utilizado para estudos de purificação e caracterização bioquímica. Neste estudo, a protease purificada apresentou atividade ótima em pH 7,5 e 50ºC, sendo inibida por Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) e mais intensamente por antipaína (1,6 µM). Sobre efeito de íons, foi observado modulação da atividade proteolítica, principalmente com inibição por AlCl3, cuja atividade proteolítica residual foi de 18% após incubação com este íon. Na presença de Ditiotreitol (DTT) e uréia houve diminuição da atividade proteolítica, apresentando atividades residuais de 63% em 200 mM de DTT e 10% com 5 M de uréia. Comparativamente, na concentração de 0,1% de cada surfactante estudado, notou-se redução da atividade proteolítica, sendo 97% em presença de Brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), 79% para 4 - (1,1,3,3 - Tetrametilbutil) fenil- polietileno glicol (Triton X-100), 55% com Polyoxyethylenesorbitan monolaurato (Tween-20) e completa redução da atividade (0%) em... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The microbial protease production depends on growing conditions and the biochemical diversity of each species. Comparative studies between solid-state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF) using wheat bran and synthetic medium, respectively, were performed to determine the optimum parameters for protease production by the fungus Aspergillus fumigatus Fresenius. The best protease production was in SSF within 96 hours using wheat bran, temperature 30°C and 1x106 spores/5g of substrate, with 1,517 U/mL. In SmF peak production was at pH 6.0 at 30°C, 5x105 spores/mL of media within 72 and 96 hours in medium containing 0.5 and 0.25% casein, respectively, with 40 U/mL. According to the productivity of the fermentative processes, enzymatic extract was used from SSF to study purification and biochemical characterization. In this study, purified protease showed optimum activity at pH 7.5 and 50°C, and inhibited by Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and more intensely for antipain (1,6 µM). Concerning to the effect of ions, we observed modulation of the proteolytic activity, especially with inhibition by AlCl3, which residual activity was of 18 % after incubation with this ion. In the presence of Dithiothreitol (DTT) and ureia, we observed progressive decrease in proteolytic activity, presenting residual activities of 63% with 200 mM DTT, and 10% with 5 M ureia. Comparatively, in the concentration of 0.1% of each surfactant studied, there was a reduction in the proteolytic activity in 97% in presence of Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB), 79% with 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (Triton X-100), 55% with Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween-20) and a complete inactivation in the presence of Sodium dodecyl sulfate... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Patrícia Peres Polizelli / Banca: . Vanildo Luiz Del Bianchi / Resumo: As celulases podem ser utilizadas na bioconversão da fração de celulose de resíduos agro-industriais em açúcares fermentáveis, visando a obtenção de combustíveis renováveis e produtos químicos. As β-glicosidases são cruciais para a total sacarificação da celulose, mas na maioria dos casos elas são fortemente inibidas pelo seu produto, a glicose. Portanto, o conhecimento das cinéticas de hidrólise e as respostas dessa enzima frente a diferentes substratos e produtos pode definir a eficiência de hidrólise e do processo biotecnológico no qual poderia ser incorporada. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a β -glicosidase de 50 kDa (BG50) produzida pelo fungo termofílico Myceliophthora thermophila M.7.7 cultivado em estado sólido, em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (1:1). O zimograma do extrato bruto evidenciou duas isoformas, de aproximadamente 200 e 50 kDa, as quais foram separadas por cromatografia de filtração em gel. A caracterização da BG50 mostrou atividade ótima a 60 ˚C e pH 5,0 quando usado o 4-nitrofenol-β-D-glicopiranosídeo (pNPG), enquanto com celobiose o valor da temperatura e pH ótimo foram de 50 ˚C e pH 4,5, respectivamente. Testes realizados com adição de íons e reagentes mostraram diferenças nos efeitos sobre a atividade da enzima dependendo do substrato, principalmente com a adição de Ditiotreitol (DTT) utilizando celobiose, e inibição completa com Cu2+ e Fe3+ para pNPG e celobiose. Além disso, a enzima não mostrou efeito inibitório quando testada na presença de nove compostos fenólicos, uma característica significativa. Os estudos cinéticos revelaram um perfil de inibição competitiva pela glicose quando utilizado pNPG com valor de KI=1,5 mM e um Km significativamente menor (0,52 mM) pelo pNPG do que pela celobiose (Km=8,50 mM). Os parâmetros termodinâmicos mostraram que a BG50 é bastante... / Abstract: Cellulases can be used in bioconversion of cellulose from agro-industrial waste into fermentable sugars in order to obtain renewable fuels and chemicals. The β-glucosidases are crucial to the overall saccharification of cellulose, but in most cases, they are strongly inhibited by its product, glucose. Therefore, knowledge of the hydrolysis kinetics of the enzyme and its responses against different substrates and products can set the hydrolysis efficiency and possible incorporation in biotechnological process. This study aimed to characterize the 50 kDa β-glucosidase (BG50) produced by the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 grown in solid state, in a mixture of sugarcane bagasse and wheat bran (1:1). The zymogram of the crude extract showed two isoforms of 200 and 50 kDa, which were separated by gel filtration chromatography. The characterization of BG50 showed optimal activity at 60 °C and pH 5.0 when used pNPG, whereas using cellobiose the values of the optimal temperature and pH were 50 °C and pH 4.5, respectively. Tests with addition of reactants and ions showed differences in the effects on enzyme activity depending on the substrate, especially with the addition of dithiothreitol (DTT) utilizing cellobiose, and complete inhibition with Cu2+ and Fe3+ for 4-nitrophenyl-β- D-glucopyranoside (pNPG) and cellobiose. Furthermore, the enzyme showed no inhibitory effect when tested in the presence of nine phenolic compounds, a remarkable characteristic. Kinetic studies showed a profile of competitive inhibition by glucose when using pNPG with Ki = 1.5 mM and Km significantly lower (0.52 mM) with pNPG than using cellobiose (Km = 8.50 mM). The thermodynamic parameters show that BG50 is quite stable, highlighting its half life of 855.6 minutes at 60 ° C, but above this temperature easily denatured. The results emphasize the importance of investigating ... / Mestre

Bothrops barnetti es una serpiente venenosa que habita las regiones de costa sierra y selva de la zona norte de Perú. La enzima similar a trombina de esta especie, denominada barnetobina, fue estudiada a partir de la purificación de los ácidos nucleicos así como de la proteína misma para determinar sus características moleculares y funcionales. La secuencia del cDNA de la barnetobina de 750 pb codifica 233 residuos aminoacídicos, los cuales conservan dominios comunes con las serinoproteasas. La barnetobina muestra homología con otras enzimas similares a trombina de veneno de serpientes donde fueron identificados los aminoácidos correspondientes al sitio catalítico y también los subsitios de unión a sustrato S1, S2 y S3. Además, se encontró tres motivos para N-glicosilación. La enzima nativa purificada es una glicoproteína monomérica que bajo condiciones reductoras y no reductoras presenta las dimensiones de 52 kDa y 48 kDa respectivamente, las cuales decrecen a 27 kDa después de la deglicosilación con PNGasa F. La barnetobina mostró actividad catalítica sobre fibrinógeno bovino, plasma y fibrinógeno humano, BApNA, TAME, BAEE y Chromozym TH; asimismo, produjo desfibrinación cuando fue suministrada a ratones por vía subcaudal. La proteasa logró liberar rápidamente el fibrinopéptido A del fibrinógeno humano. La actividad coagulante específica de la enzima fue equivalente a 251,7 NIH U/mg de trombina sobre fibrinógeno bovino. Las actividades amidásica y coagulante fueron inhibidas por el PMSF, el inhibidor de tripsina de soya y el DTT; en contraste, el 2β- mercaptoetanol, TLCK, EDTA y la heparina tuvieron poco o ningún efecto sobre la actividad amidásica. En este estudio se demostró la importancia de los carbohidratos N-ligados sobre la actividad similar a trombina de la barnetobina, la cual perdió su actividad biológica y enzimática cuando los carbohidratos fueron removidos. Se concluye que la barnetobina es una serinoproteasa coagulante del fibrinógeno cuyos azúcares asociados estarían involucrados en la estabilidad enzimática y la unión a sus sustratos. / Tesis

Se ha aislado una enzima similar a trombina del veneno de la serpiente peruana Bothrops barnetti mediante dos pasos cromatográficos sobre CM Sephadex C-50 y Sephadex G-100, en ambos casos utilizando Acetato de Amonio 0,05 M a pH 5,0. La enzima fue purificada 45 veces con un rendimiento de 14% y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteíca de 52 kDa en condiciones reductoras con 2β-Mercaptoetanol y de 48 kDa en condiciones no reductoras, determinándose que la enzima es de una sola cadena polipeptidica con al menos un enlace disulfuro. El tratamiento con N- glicosidasa (PNGasa F) determinó que es una glicoproteína con un 45% de contenido total de carbohidratos. La enzima mostró tener actividad coagulante sobre plasma citratado y fibrinógeno y actividad amidásica sobre BApNA y Chromozym TH, La potencia coagulante sobre fibrinógeno bovino fue equivalente a 131 unidades NIH de trombina/mg. La enzima es inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya calificándola como una serinoproteasa; el pH óptimo para la actividad amidolítica fue de 8,0 y es estable hasta los 40 ºC. Se demostró mediante inmunoelectroforesis e inmunodifusión la antigenicidad de la enzima frente al suero antibotrópico polivalente sobre plasma citratado (DE: 250 µl de antiveneno/ mg de enzima). Palabras clave: Veneno, serpiente, enzima similar a trombina, Bothrops barnetti, coagulante. / --- A thrombin- like enzyme was purified from Bothrops barnetti peruvian snake venom using CM Sephadex C-50 followed by Sephadex G-100, in both two cases with 0,05 M Amonium Acetate buffer pH 5,0. The enzyme was purified 45 fold with 14% of yield and the PAGE-SDS showed only protein band of 52 kDa under reducing condition with 2β-Mercaptoetanol and 48 kDa under non reducing condition indicating that the enzyme has a single polypeptide chain with disulfide bond. The PNGase treatment showed that it is a basic glycoprotein containing 45% total carbohydrates. The enzyme has coagulant activity on fibrinogen and citrated plasma and amidolytic activity on BApNA and Chromozym TH. The coagulant potency was equivalent to 131 NIH thrombin Units/ mg. In addition the enzyme is inhibited by PMSF and soybean trypsin inhibitor suggesting that is a serine proteinase. The enzyme had optimal amidolytic activity pH was 8,0 and is stable until 40 ºC. The antigenicity and neutralization of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis with the polyvalent antibothropic serum on citrated plasma (ED: 250 µl of antivenom/ mg of enzyme). Key words: Venom, snake, enzyme, thrombin like, Bothrops barnetti, coagulant.

Se han determinado las principales propiedades bioquímicas e inmunológicas de la enzima similar a trombina (EST) de la serpiente peruana Bothrops atrox (“jergón”). Para este fin, la enzima fue purificada hasta la homogeneidad utilizando tres pasos cromatrográficos en Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 y Agarosa-PAB. Asimismo, se determinó el peso molecular por PAGE-SDS y el porcentaje de carbohidratos asociados mediante hidrólisis y análisis de hexosas, hexosaminas y ácido siálico. Luego se ensayaron las actividades fibrinocoagulante, amidolítica y esterásica, sobre fibrinógeno bovino, BApNA y BAEE, respectivamente, así como la hidrólisis sobre los sustratos cromogénicos S-2238, S-2251 y S-2266 y finalmente se realizó la identificación de la enzima aislada mediante la técnica de peptide mass fingerprinting. Para el análisis inmunoquímico, se inmunizaron conejos albinos con 150 µg de la enzima purificada a fin de obtener un suero hiperinmune anti-EST de B. atrox. Posteriormente se analizaron los patrones de reactividad inmunológica del suero contra la enzima purificada y los venenos de Bothrops atrox, Bothrops brazili, Lachesis muta y Crotalus durissus mediante la técnica de ELISA. Como resultado del análisis bioquímico se determinó que la enzima constituye el 1.7% del veneno completo, siendo purificada 25.5 veces y con un rendimiento del 43.3% utilizando BApNA como sustrato. La enzima presenta un peso molecular de 29.6 kDa, del cual el 14.2% lo constituyen los carbohidratos asociados, asimismo la EST de B. atrox produjo coagulación del fibrinógeno bovino y presentó actividad sobre BAEE, BApNA, S-2238 y S-2266, siendo incapaz de hidrolizar el sustrato S-2251. El análisis mediante espectrometría de masas de los péptidos obtenidos por la hidrólisis de la EST de B. atrox permitieron relacionarla con la proteína venombina A, presentando una homología en secuencia del 75% con esta proteína. Al finalizar el protocolo de inmunización se obtuvo un suero hiperinmune anti-EST de B. atrox con un título de 64000, siendo evidencia del potencial inmunogénico de esta proteína. Por otro lado, los anticuerpos producidos reaccionaron de forma cruzada con los venenos completos de B. atrox (9.9%) y B. brazili (9.6%) y en menor intensidad con los de L. muta y C. durissus, con valores de 5.1% y 4.8%, respectivamente. / We have determinated the main biochemical and immunological properties of a thrombin-like enzyme (TLE) isolated from Bothrops atrox Peruvian snake venom (“jergón”). In this concern, TLE was purified until homogeneity using three chromatographical steps on Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 and Agarose-PAB. Furthermore, molecular weight was determinate by PAGE-SDS and associated carbohydrates by hydrolysis and analysis of hexoses, hexosamines and sialic acid. Then, fibrinocoagulant, amidolytic and sterasic activities were measured on bovine fibrinogen, BApNA and BAEE, respectively, hydrolysis on S-2238, S-2251 and S-2266 chromogenic substrates, and finally molecular identity of this enzyme was determinated by peptide mass fingerprinting technique. For the immunochemical analyses, white rabbits were immunized with 150 µg of EST and a hyperimmune serum anti-TLE was obtained. Patterns of immunological reactivity were determined between this serum against TLE and venoms of Bothrops atrox, Bothrops brazili, Lachesis muta y Crotalus durissus using ELISA technique. As a result of biochemical analysis, we determined that this enzyme represents 1.7% of total venom and was 25.5-fold purified with a 43.3% yield, using BApNA as substrate. This enzyme had 29.6 kDa, where 14.2% was associated carbohydrates. The TLE of B. atrox produced coagulation of bovine fibrinogen and had enzymatic activity on BAEE, BApNA, S-2238 and S-2266, being unable to act on S-2251. Mass spectrometry analysis of hydrolyzed EST of B. atrox results on a 75% sequence homology with venombin A protein. At the final of immunization protocol, we obtained an anti-TLE hyperimmune serum with a title of 64000, which showed the potential immunogenicity of this protein. On the other hand, raised antibodies cross-reacted with total venoms of B. atrox (9.9%) y B. brazili (9.6%) and with less intensity with those from L. muta and C. durissus (5.1% and 4.8%, respectively).

Cuyes - Metabolismo / El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad de las enzimas hidrolíticas localizadas en la región cecal de cuyes (Cavia porcellus) bajo diferentes condiciones de pH y temperatura. Se sacrificaron 5 cuyes machos al final del engorde (peso: 1022g), de los cuales se extrajo el contenido del ciego. Este contenido fue sometido a métodos físicos (agitador magnético, sonicación y centrifugación) para extraer las enzimas cecales (EC). Se midió la actividad específica de las EC a diferente temperatura (20°C, 30°C y 40°C) y pH (5, 7 y 9). Estas EC mostraron actividad celulolítica, la más alta se presentó a 40°C y pH 9 (21.8 U/g proteína), mientras que las más baja a 20°C y pH 5 (13.2 U/g proteína). La actividad amilolítica de las EC más altas se presentaron 40°C (441.5, 452.7 y 499.3 U/g proteína) y las más bajas a 20°C (188.7, 174.1 y 150.4 U/g proteína). Sin embargo, el pH no afectó la actividad amilolítica. La actividad amilolítica fue aproximadamente 10 veces mayor a la actividad celulolítica. En cuanto a las EC con actividad proteolítica, a 20°C y pH 5 se presentó el valor más alto (290 U/g proteína) y la más baja a 30°C y pH 9 (104U/g proteína). Finalmente, las EC con actividad lipolítica presentaron mayor actividad a pH 9 (4.05 U/mg proteína) y la más baja a pH 5 (3.18 U/mg proteína). La temperatura no afectó la actividad de las EC con capacidad lipolítica. Los resultados de este estudio evidencian la intensa actividad amilolítica y celulolítica en el ciego del cuy, siendo más intensa la actividad amilolítica. Estos datos sugieren el potencial biotecnológico que poseen estas enzimas. La administración de estas enzimas en el alimento de cuyes podría influir de manera positiva en el rendimiento de esta especie. Palabras claves: cuy, ciego, enzimas, amilolítica, celulolítica, proteolítica, lipolítica. / --- The aim of this study was to evaluate the activity of hydrolytic enzymes located in the cecal region of guinea pigs (Cavia porcellus) under different conditions of pH and temperature. Five male guinea pigs were sacrificed at the end of fattening (weight: 1022g). The content of the cecum was and extracted of them. This content was subjected to physical methods (magnetic stirrer, sonication and centrifugation) to remove cecal enzymes (CE). Specific activity was measured in the CE at different temperatures (20 ° C, 30 ° C and 40 ° C) and pH (5, 7 and 9). These CE showed cellulolytic activity, the highest was submitted to 40 ° C and pH 9 (21.8 U / g protein), while than lower was (13.2 U / g protein) at 20 ° C and pH 5. Amylolytic activity of CE showed higher at 40 ° C (441.5, 452.7 and 499.3 U / g protein) and the lowest at 20° C (188.7, 174.1 and 150.4 U / g protein). However, the pH did not affect the amylolytic activity. Amylolytic activity was approximately 10 times the cellulolytic activity. As to the CE with proteolytic activity at 20 ° C and pH 5 showed the highest value (290 U / g protein) and lowest at 30 ° C and pH 9 (104U / g protein). Finally, the CE with lipolytic activity showed higher activity at pH 9 (4.05 U / mg protein) and lowest at pH 5 (3.18 U / mg protein). The temperature did not affect the activity of lipolytic capacity CE. The results of this study demonstrate the amylolytic and cellulolytic intense activity in the cecum of the guinea pig, being more intense amylolytic activity. These data suggest that these enzymes possess biotechnology potential. The administration of these enzymes in the guinea pig food could positively influence the performance of this species. Keywords: guinea pig, cecum, enzymes, amylolytic, cellulolytic, proteolytic, lipolytic.

Los caballos de carrera representan la constancia en la selección y mejoramiento de la especie equina. Estos animales son sometidos a esquemas de entrenamiento durante meses previos a una carrera donde el desempeño solamente es evaluado mediante la observación del animal. Existen otras variables que pueden ser de utilidad para este propósito como los valores eritrocíticos (conteo de glóbulos rojos, hematocrito y hemoglobina) y concentración sérica de enzimas musculares (CK, AST y LDH). Con el objetivo de evaluar el entrenamiento en esta raza, se realizó un estudio con 24 caballos Pura Sangre de Carrera (PSC), entre machos (n=12) y hembras (n=12) de dos años de edad que fueron seleccionados para participar en competencias hípicas de velocidad. Se evaluó el efecto del ejercicio sobre la cinética de la serie eritrocitaria y las enzimas musculares. Se obtuvieron muestras sanguíneas en reposo (T0), a los 5 minutos (T1), a 1 hora (T2) y a las 24 horas (T3) después del ejercicio mensualmente durante 5 meses. Se obtuvo el promedio de cada mes y en cada tiempo de muestreo con sus respectivas desviaciones estándar. Para cada variable se determinó el efecto lineal y el cuadrático mediante análisis de varianza (ANOVA) y el análisis de varianza post estimación. Posteriormente, se determinó la existencia de diferencia estadística significativa (p<0.05) mediante la prueba del Modelo Mixto Lineal y generando variables dummy. Las variables recuento de glóbulos rojos, concentración de hemoglobina y hematocrito se incrementaron significativamente con el ejercicio en el tiempo T1 con respecto al nivel referencial y sólo aumentaron significativamente con el ejercicio hacia el último mes (M5) con respecto al nivel referencial. Por otro lado, las concentraciones séricas de enzimas, como LDH sólo aumentó significativamente en los tiempos T1 y T2, mientras que la AST no mostró variaciones significativas en tiempos ni en meses. Por último, la CK presentó incrementos significativos en el tiempo T2 con respecto al nivel referencial. Palabras Clave: Caballo Pura Sangre Carrera, valores eritrocíticos, enzimas musculares, CK, AST, LDH, ejercicio. / --- Race horses represent the constancy selection and improvement of the equine species. These animals are subjected to training schemes for months before a race where performance is only evaluated by clinical observation of the animal. There are other variables that may be useful for this purpose like erythrocitic values (Red blood cell count, hemoglobin and hematocrit) and serum muscle enzymes (CK, AST and LDH). To characterize exercise of this in this race, there were conducted a study with 24 two-year-old Thoroughbred horses (PSC) between males (n = 12) and females (n = 12) who were selected to participate in speed horse competitions. The effect of exercise on the kinetics of erythrocitic values and muscle enzymes was evaluated. Blood samples were taken at rest (T0), 5 minutes (T1), 1 hour (T2) and 24 hours (T3) after exercise monthly during five months. Average and standard deviation were determined. Analysis of variance (ANOVA) and post estimation analysis of variance was used to determined linear and quadratic effect of each variable. Linear Mixed Model and dummy variables were used to determine statistically significant difference (p<0.05). The RBC count, hemoglobin and hematocrit increased significantly with exercise in T1 time compared to the reference level and only increased significantly with exercise towards the last month (M5) with respect to the reference level. In the other hand, serum enzymes, such as LDH increased significantly only at the times T1 and T2, while the AST did not show significant variations in days not in months. Finally, the CK had significant increases in time T2 with respect to the reference level. Key words: Throroughbred horses, erythrocytic values, muscular enzymes, exercise, CK, AST, LDH