O presente trabalho foi realizado com a finalidade de estudar aspectos biológicos básicos do fungo celulolítico Humicola sp. Assim, através da auxanografia, determinou-se que biotina e tiamina eram necessárias ao meio mínimo, para o desenvolvimento de culturas transferidas por inoculação de ponto; contudo, raramente ocorreu germinação nesse meio, quando suspensões de esporos foram semeadas. Devido ao crescimento não individualizado em meio completo, cinco redutores de crescimento foram ensaiados, optando-se pela utilização de citrato de sódio 0,700%, o qual possibilitou redução de 70,1% no diâmetro da colônia, sem prejuízo da sobrevivência. Para indução de mutação foram utilizados: ácido nitroso, etil metano sulfonato, luz ultra-violeta e radiação gama, sendo estabelecidas as curvas de sobrevivência de esporos desse fungo, quando submetidos a esses mutagênicos. Foram então isolados três mutantes auxotróficos e 27 mutantes morfológicos, que posteriormente foram caracterizados. Observações citológicas de núcleos em 250 esporos da linhagem selvagem indicaram que a classe mais freqüente, constituía de 12 núcleos por esporo, evidenciando o estado multinuclear dos conídios desse·fungo. Isso pode permitir a ocorrência de heterocariose, e ser responsável, pelo menos em parte, pela variabilidade observada. As curvas de distribuição do numero de núcleos por esporo dos mutantes morfológicos, apresentaram máximos para as classes 6, 12, 18 e 24 núcleos, sendo que a linhagem mor10 apresentou pico em 3, podendo ser esse o numero básico de núcleos em esporos dessa espécie. Estudo do comportamento cromossomal durante a divisão nuclear demonstrou que a mitose é similar a de outros fungos filamentosos. O número de cromossomos, observados no final da metáfase, não pode ser determinado, com segurança, mas sugeriu-se estar entre 6 e 8. Em culturas de Humicola sp foi freqüentemente observada anastomose de hifas, possibilitando a ocorrência de heterocariose e/ou heteroplasmose e, indicando que o ciclo parassexual pode ocorrer nessa espécie. A interação entre vários pares de mutantes morfológicos produziu conídios pigmentados semelhantes aos da linhagem selvagem, indicando a ocorrência de algum tipo de sintrofismo ou complementação morfológica. A linhagem selvagem e alguns mutantes morfológicos apresentaram variabilidade quanto à morfologia e produção de celulases. Assim, após várias tentativas de estabilização da linhagem selvagem e de alguns mutantes morfológicos, foram determinadas as atividades exoglucanase, endoglucanase, β-glicosidase, amilase e protease neutra dos mesmos. A atividade β-glicosidase do mutante mor13 foi superior à do selvagem e mor21 destacou-se como melhor produtor de amilase, apesar do selvagem ter demonstrado boa produção das referidas enzimas. Coeficiente de correlação altamente significativo foi verificado entre as atividades exoglucanase-endoglucanase, sugerindo que as mesmas devem ser correguladas nesse microorganismo. Correlações significativas foram verificadas, também entre exoglucanase - protease, endoglucanase - protease e β-glicosidase - protease. / This research was carried out aiming to study some biological aspects of Humicola sp., a cellulolytic fungus. Through the auxanographical assay, it was determined that biotin and thiamine are essential for the growth of this fungus. It rarely occured germination in minimal medium, when spore suspensions were plated. Since the colonies were not grown in complete medium independently, five growth reducers were tested. Sodium citrate at the concentration of 0.700% reduced in 70.1% of the colony size, however did not affect the fungus survival. Nitrous acid, sulfonethylmethane, ultra-violet light and gamma ray were used to induce mutation. The survival ratio of this fungus was observed. From these treatments, three auxotrophic and 27 morphological mutants were isolated and characterized. From the cytological observation, multinuclear conditions were observed in the spore ce11s and myce1ium both wild and mutant strains. It might be possible the occurrence of heterokaryosis and probably it is·responsible for part of the variability. Observations of the nuclei in 250 spores of wild strains showed that the most frequent class included 12 nuclei per spore. Classes with 6, 12, 18 and 24 nuclei per spore were observed in morphological mutants. Three nuclei as the most frequent class was observed in the mutant strain mor10. It suggested that the basic number of nuclei in this fungus is three. The chromosomal behaviour showed a typical mitosis similar to other filamentous fungi. The chromosome number observed at the end of metaphase could not properly determined, however it might be between 6 and 8. In general, Humicola sp. showed anastomosis and it allows the occurrence of heterokaryosis and/or heteroplasmosis. It suggests that the parasexual cycle can occur in this fungus. The association of two morphological mutants produced pigmented spores suggesting some kind of synthrophism or morphological complementation. The wild strain and some morphological mutants showed wide variability concerning to morphology and cellulase production. Five enzyme systems: exoglucanase, endoglucanase, Βglucosidase, amylase and neutral protease activities were analysed in wild and selected mutants. Besides the suitable production of Βglucosidase and amylase by the wild strain, the mutant mor13 was better producer of Βglucosidase and mor21 for amylase. Highly significant level of correlation was observed between exoglucanase and endoglucanase activities showing co-regulation of these enzymes in this fungus. Significant level of correlations were obtained to exog1ucanase-protease, endoglucanase-protease and Βg1ucosidase-protease production, as well.

O presente trabalho foi realizado com a finalidade de estudar aspectos biológicos básicos do fungo celulolítico Humicola sp. Assim, através da auxanografia, determinou-se que biotina e tiamina eram necessárias ao meio mínimo, para o desenvolvimento de culturas transferidas por inoculação de ponto; contudo, raramente ocorreu germinação nesse meio, quando suspensões de esporos foram semeadas. Devido ao crescimento não individualizado em meio completo, cinco redutores de crescimento foram ensaiados, optando-se pela utilização de citrato de sódio 0,700%, o qual possibilitou redução de 70,1% no diâmetro da colônia, sem prejuízo da sobrevivência. Para indução de mutação foram utilizados: ácido nitroso, etil metano sulfonato, luz ultra-violeta e radiação gama, sendo estabelecidas as curvas de sobrevivência de esporos desse fungo, quando submetidos a esses mutagênicos. Foram então isolados três mutantes auxotróficos e 27 mutantes morfológicos, que posteriormente foram caracterizados. Observações citológicas de núcleos em 250 esporos da linhagem selvagem indicaram que a classe mais freqüente, constituía de 12 núcleos por esporo, evidenciando o estado multinuclear dos conídios desse·fungo. Isso pode permitir a ocorrência de heterocariose, e ser responsável, pelo menos em parte, pela variabilidade observada. As curvas de distribuição do numero de núcleos por esporo dos mutantes morfológicos, apresentaram máximos para as classes 6, 12, 18 e 24 núcleos, sendo que a linhagem mor10 apresentou pico em 3, podendo ser esse o numero básico de núcleos em esporos dessa espécie. Estudo do comportamento cromossomal durante a divisão nuclear demonstrou que a mitose é similar a de outros fungos filamentosos. O número de cromossomos, observados no final da metáfase, não pode ser determinado, com segurança, mas sugeriu-se estar entre 6 e 8. Em culturas de Humicola sp foi freqüentemente observada anastomose de hifas, possibilitando a ocorrência de heterocariose e/ou heteroplasmose e, indicando que o ciclo parassexual pode ocorrer nessa espécie. A interação entre vários pares de mutantes morfológicos produziu conídios pigmentados semelhantes aos da linhagem selvagem, indicando a ocorrência de algum tipo de sintrofismo ou complementação morfológica. A linhagem selvagem e alguns mutantes morfológicos apresentaram variabilidade quanto à morfologia e produção de celulases. Assim, após várias tentativas de estabilização da linhagem selvagem e de alguns mutantes morfológicos, foram determinadas as atividades exoglucanase, endoglucanase, β-glicosidase, amilase e protease neutra dos mesmos. A atividade β-glicosidase do mutante mor13 foi superior à do selvagem e mor21 destacou-se como melhor produtor de amilase, apesar do selvagem ter demonstrado boa produção das referidas enzimas. Coeficiente de correlação altamente significativo foi verificado entre as atividades exoglucanase-endoglucanase, sugerindo que as mesmas devem ser correguladas nesse microorganismo. Correlações significativas foram verificadas, também entre exoglucanase - protease, endoglucanase - protease e β-glicosidase - protease. / This research was carried out aiming to study some biological aspects of Humicola sp., a cellulolytic fungus. Through the auxanographical assay, it was determined that biotin and thiamine are essential for the growth of this fungus. It rarely occured germination in minimal medium, when spore suspensions were plated. Since the colonies were not grown in complete medium independently, five growth reducers were tested. Sodium citrate at the concentration of 0.700% reduced in 70.1% of the colony size, however did not affect the fungus survival. Nitrous acid, sulfonethylmethane, ultra-violet light and gamma ray were used to induce mutation. The survival ratio of this fungus was observed. From these treatments, three auxotrophic and 27 morphological mutants were isolated and characterized. From the cytological observation, multinuclear conditions were observed in the spore ce11s and myce1ium both wild and mutant strains. It might be possible the occurrence of heterokaryosis and probably it is·responsible for part of the variability. Observations of the nuclei in 250 spores of wild strains showed that the most frequent class included 12 nuclei per spore. Classes with 6, 12, 18 and 24 nuclei per spore were observed in morphological mutants. Three nuclei as the most frequent class was observed in the mutant strain mor10. It suggested that the basic number of nuclei in this fungus is three. The chromosomal behaviour showed a typical mitosis similar to other filamentous fungi. The chromosome number observed at the end of metaphase could not properly determined, however it might be between 6 and 8. In general, Humicola sp. showed anastomosis and it allows the occurrence of heterokaryosis and/or heteroplasmosis. It suggests that the parasexual cycle can occur in this fungus. The association of two morphological mutants produced pigmented spores suggesting some kind of synthrophism or morphological complementation. The wild strain and some morphological mutants showed wide variability concerning to morphology and cellulase production. Five enzyme systems: exoglucanase, endoglucanase, Βglucosidase, amylase and neutral protease activities were analysed in wild and selected mutants. Besides the suitable production of Βglucosidase and amylase by the wild strain, the mutant mor13 was better producer of Βglucosidase and mor21 for amylase. Highly significant level of correlation was observed between exoglucanase and endoglucanase activities showing co-regulation of these enzymes in this fungus. Significant level of correlations were obtained to exog1ucanase-protease, endoglucanase-protease and Βg1ucosidase-protease production, as well.

No presente trabalho foram realizados estudos genéticos em Trichoderma pseudokoningii e verificada a atividade celulolítica da linhagem selvagem, mutante e recombinantes obtidos de heterocários. Com o objetivo de se obter mutantes auxotrófico, testou-se dois agentes mutagênicos, a luz ultravioleta e o ácido nitroso. Através de irradiação com luz ultravioleta foram obtidos dezenove mutantes autotróficos simples e dezoito com dupla deficiência, e dois mutantes morfológicos com ácido nitroso. Sete mutantes com dupla marcas autotróficas e morfológicas foram utilizados para a obtenção de heterocários. Colônias recombinantes foram obtidas diretamente dos heterocários em diferentes meios seletivo, sugerindo a ocorrência de parameiose nesta espécie. Colônias protróficas crescidas em MM eram binucleadas e de coloração verde, indicando um sistema não autônomo para a pigmentação de conídios. Estas colônias dicarióticas formaram setores em MC acrescido de benomyl, sugerindo a ocorrência de uma fase diplóide altamente instável e parassexualidade. Foi descrito um método para a obtenção e fusão de protoplastos. Colônias recombinantes foram recuperadas diretamente de produtos de fusão, numa freqüência aproximadamente 1000 vezes superior em relação às obtidas à partir de heterocário. Quanto a atividade celulolítica da linhagem selvagem e mutantes, observou-se que os valores de índices enzimáticos foram diretamente proporcionais ao maior ou menor grau de compactação das colônias. Colônias de linhagem selvagem originadas de protoplastos regenerados apresentaram índices de atividade celulolítica inferiores em relação às colônias originadas de conídios, indicando um efeito negativo da protoplastização sobre a atividade enzimática / In this work genetic studies were carried out in Trichoderma pseudokoningii in order to test the cellulolitic activity in wild and mutant strains and recombinants obtained from heterokaryons. Two mutagenic agents were tested aiming to obtain auxotrophic mutants-Utraviolet light and nitrous acid. Through UV light were obtained 19 simple auxotrophic mutants and 18 double mutants and through nitrous acid two morphological mutants. Seven color mutants carrying two auxotrophic markers were used to get heterokaryons. Recombinant colonies were directly recovered from heterokaryons onto different seletive media, indicating the occurrence of parameiosis. Prototrophic colonies grown in minimal medium were binucleated and green coloured, revealing a non autonomous system for conidia pigmentation. These dikaryotic colonies gave rise to sectors in complete medium plus benomyl suggesting the occurrence of a highly unstable diploid phase and parassexuality. It was described as well a method for protoplasts obtention and fusion. Recombinant colonies were directly recovered from fusion products in a frequency almost 1000 times higher than the recombinants from heterokaryons. For cellulolitic activity in wild and mutant strains it was shown that the enzymatic indexes were directly proportional to the higher or smaller degree of colony compactation. Colonies regenerated from protoplasts of the wild strain showed worst cellulolitic activity than colonies rosen from conidia. This is a negative effect of protoplastization on the cellulolitic activity. Electrophoretic patterns for esterase of the wild and mutant strains showed different profiles according to number and band position. It might be suggested a relation between band patterns and conidia coloration.

No presente trabalho foram realizados estudos genéticos em Trichoderma pseudokoningii e verificada a atividade celulolítica da linhagem selvagem, mutante e recombinantes obtidos de heterocários. Com o objetivo de se obter mutantes auxotrófico, testou-se dois agentes mutagênicos, a luz ultravioleta e o ácido nitroso. Através de irradiação com luz ultravioleta foram obtidos dezenove mutantes autotróficos simples e dezoito com dupla deficiência, e dois mutantes morfológicos com ácido nitroso. Sete mutantes com dupla marcas autotróficas e morfológicas foram utilizados para a obtenção de heterocários. Colônias recombinantes foram obtidas diretamente dos heterocários em diferentes meios seletivo, sugerindo a ocorrência de parameiose nesta espécie. Colônias protróficas crescidas em MM eram binucleadas e de coloração verde, indicando um sistema não autônomo para a pigmentação de conídios. Estas colônias dicarióticas formaram setores em MC acrescido de benomyl, sugerindo a ocorrência de uma fase diplóide altamente instável e parassexualidade. Foi descrito um método para a obtenção e fusão de protoplastos. Colônias recombinantes foram recuperadas diretamente de produtos de fusão, numa freqüência aproximadamente 1000 vezes superior em relação às obtidas à partir de heterocário. Quanto a atividade celulolítica da linhagem selvagem e mutantes, observou-se que os valores de índices enzimáticos foram diretamente proporcionais ao maior ou menor grau de compactação das colônias. Colônias de linhagem selvagem originadas de protoplastos regenerados apresentaram índices de atividade celulolítica inferiores em relação às colônias originadas de conídios, indicando um efeito negativo da protoplastização sobre a atividade enzimática / In this work genetic studies were carried out in Trichoderma pseudokoningii in order to test the cellulolitic activity in wild and mutant strains and recombinants obtained from heterokaryons. Two mutagenic agents were tested aiming to obtain auxotrophic mutants-Utraviolet light and nitrous acid. Through UV light were obtained 19 simple auxotrophic mutants and 18 double mutants and through nitrous acid two morphological mutants. Seven color mutants carrying two auxotrophic markers were used to get heterokaryons. Recombinant colonies were directly recovered from heterokaryons onto different seletive media, indicating the occurrence of parameiosis. Prototrophic colonies grown in minimal medium were binucleated and green coloured, revealing a non autonomous system for conidia pigmentation. These dikaryotic colonies gave rise to sectors in complete medium plus benomyl suggesting the occurrence of a highly unstable diploid phase and parassexuality. It was described as well a method for protoplasts obtention and fusion. Recombinant colonies were directly recovered from fusion products in a frequency almost 1000 times higher than the recombinants from heterokaryons. For cellulolitic activity in wild and mutant strains it was shown that the enzymatic indexes were directly proportional to the higher or smaller degree of colony compactation. Colonies regenerated from protoplasts of the wild strain showed worst cellulolitic activity than colonies rosen from conidia. This is a negative effect of protoplastization on the cellulolitic activity. Electrophoretic patterns for esterase of the wild and mutant strains showed different profiles according to number and band position. It might be suggested a relation between band patterns and conidia coloration.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-07T16:46:59Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-07T16:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) Previous issue date: 2015-03-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho foi construída uma biblioteca metagenômica a partir de um consórcio microbiano termofílico com aproximadamente 135.000 clones, abrigando cerca de 3,5 Gpb de DNA metagenômico. Essa biblioteca foi construída com o objetivo de identificar genes que codificam enzimas lignocelulolíticas para serem expressos na levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). De 6.720 clones analisados (5 % do total), foram obtidos 182 hits positivos para atividades de celulases, xilanases e β-glicosidases, com seleção e sequenciamento de 30 fosmídeos que deram origem à identificação de 34 ORFs codificando para enzimas glicosil hidrolases, relacionadas com a hidrólise de celulose e hemicelulose. Paralelo à construção da biblioteca, foi obtido uma linhagem de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3) mutante (ura3 ̄ ). Pela primeira vez nesta levedura a deleção deste gene foi realizada utilizando-se a técnica split-marker, com seleção dos mutantes primeiramente em placas contendo geneticina e, posteriormente, associados à seleção em placas contendo ácido 5-fluorótico (5-FOA). Os resultados apresentados mostram que esta técnica de deleção pode ser eficientemente empregada para K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), mesmo levando-se em conta a diploidia desta linhagem. A partir da obtenção do mutante ura3 ̄ , deu-se a construção do vetor pKmLPG para ser usado como sistema de expressão para essa levedura, uma vez que a marca de seleção contida neste vetor é o gene URA3. A característica diferencial e promissora deste sistema de expressão é o uso da sequência do promotor do gene que codifica a enzima endo-polygalacturonase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). A confirmação do vetor pKmLPG será realizada por sequenciamento. Sem essa confirmação, utilizou-se então o vetor de expressão pKMCL para clonagem de três genes de β-glicosidase isolados a partir da biblioteca fosmidial na levedura K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). O vetor pKMCL é derivado do vetor de expressão pKLAC2 de K. lactis e utiliza a marca de seleção que confere resistência ao antibiótico geneticina. Por realização de teste enzimático dos transformantes em meio sólido, observou-se a presença de atividade extracelular de β-glicosidase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3). Com o genoma desta levedura anotado, foi possível identificar o gene, e juntamente com os demais genes de β-glicosidase (P3Gli, P8Gli e P9Gli), foram preditas as estruturas tri-dimensionais dessas proteínas. A confirmação dos transformantes para os genes P3Gli, P8Gli e P9Gli foi realizada por PCR, e atividade de β-glicosidase foi detectada tanto no sobrenadante extracelular quanto na região do periplasma em oito das nove cepas transformantes analisadas. Os resultados de expressão heteróloga de β-glicosidades em K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) mostram que esta linhagem pode ser usada como hospedeira na expressão de diferentes genes lignocelulolíticos, com expectativa de uso das linhagens recombinantes capazes de secretar celulases visando a produção de etanol celulósico. / A metagenomic library harboring around 3,5 Gpb was constructed from a thermophilic microbial consortium. The aim of this library was to identify genes coding lignocellulolytic enzymes that could be expressed in the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). In total, 6,720 clones (5% of all clones) were analysed and 182 positive hits were found for cellulases, xylanases and β-glucosidases. The sequencing of 30 selected fosmids resulted in the identification of 34 putative open reading frames (ORFs) coding glycoside hydrolases involved with cellulose and hemicellulose degradation. Simultaneously, a defective mutant strain of K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) for gene ura3 was obtained. The gene was deleted by using, for the first time in this yeast, the split- marker technique that consisted in a first selection of mutants in solid medium with the antibiotic geneticin followed by a second selection in the presence of 5- Fluoroorotic Acid. The results presented here demonstrated the efficiency of the split-marker technique in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), even though this is a diploid strain. Once the ura3 - was obtained, the vector pKmLPG was constructed using the URA3 as a marker gene in order to have an expression system for the ura3 - mutant strain. The differential and promising feature of this vector lies in the presence of the promoter sequence of the gene coding an endo-polygalacturonase enzyme from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). The confirmation of the correct vector construction will be performed by sequencing. In order to express genes isolated from the metagenomic library in the yeast K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) three genes coding β-glucosidase were cloned onto the vector pKMCL. This vector is derived from pKLAC2 of Kluyveromyces lactis and it uses the resistance gene for the antibiotic geneticin as a marker. Extracellular activity of endogenous β- glucosidase from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) was detected by enzymatic assay in solid medium during the analyses of transformants, and based in the annotated genome of this yeast, was possible to identify the β-glucosidase gene. The three dimensional structure of the endogenous protein as well from those codified by the β-glucosidase genes (P3Gli, P8Gli and P9Gli) were predicted. The confirmation of transformants for the cloned genes P3Gli, P8Gli and P9Gli was done by PCR, and the β-glucosidase activity was detected in both extracelllular supernatant and periplasm region in eight of nine transformants analysed. Results of heterologous expression of β-glucosidase in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) demonstrated that this strain can be used as a host for expression of various lignocellulolytic genes, with the expectation to use recombinant yeast strains capable to secret celulases targeting the production of cellulosic etanol. / Tese liberada do Sigilo pelo departamento em 04-04-2017, ver arquivo

Os micro-organismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas. Uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares, que ajudam na degradação da matéria orgânica e são cada vez mais procuradas e exploradas pela indústria. Essa propriedade aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo. A celulase pertence a essa classe de enzimas e é formada por um complexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose por meio da quebra da ligação β,1-4. A partir dessa característica da celulase, foi realizada uma expressão heteróloga relacionada com a hidrólise da celulose em biblioteca metagenômica de solo da Caatinga. Foram realizados testes de produção enzimática por meio dos quais selecionamos os clones 283/A8 e 307/E11 como melhores produtores de endoglicanases. Com o objetivo de analisar a cinética de produção de celulases pelos clones, estes foram inoculados em diferentes fontes de celulose, pH e temperatura. A faixa ideal de pH foi 5,0 e de temperatura, 50º C, verificada para as enzimas Celulase Total, Endoglicanase e β-glicosidase. Quanto à termoestabilidade, as enzimas presentes mantiveram mais de 60% da atividade inicial após 2 horas de incubação a 50º C. O perfil de proteínas analisado por SDS-PAGE demonstrou que os clones secretam um conjunto de enzimas celulolíticas com 25 a 100 KDa, quando cultivado em farelo de trigo, e 30 a 60 KDa, quando cultivados em CMC. No ensaio de cromatografia para o clone 307/E11, foram selecionadas 5 frações que obtiveram melhores resultados na dosagem enzimática e testados frente ao pH e à temperatura. O resultado obtido foi que o complexo enzimático bruto, extraído do sobrenadante produzido pelo clone, possui melhor atividade frente ao pH e à temperatura do que as frações parcialmente purificadas. / Microorganisms are distinguished by a wide genetic diversity and they perform unique and crucial functions concerning the maintenance of ecosystems. One of those functions is the production of extracellular enzymes, which help in the degradation of organic matter and which are increasingly wanted and explored by industry. Such feature boosts the search of enzymes that can be exploited in several industrial sectors with improved full use and low cost. Cellulase belongs to such class of enzymes and it is composed of a multi-enzymatic complex which is able to hydrolyse cellulose through the breaking of the chemical bond β,1-4. Considering such attribute of the cellulase, a heterologous expression, related to cellulose hydrolysis in a metagenomic inventory of the soil of Caatinga, was realized. Tests of enzymatic production were performed, and through them, we could elect the clones 283/A8 and 307/E11 as the best endoglicanase producers. Those clones were inoculated in different cellulose sources, pH and temperature, so that we could analyse the kinetic of cellulase production between them. The ideal pH range was 5.0 and the ideal temperature range was 50º C (122º F), verified for the enzymes Total Cellulase, Endoglicanase and β-glucosidase. With regard to thermostability, the present enzymes kept more than 60% of the initial activity after 2 hours of incubation at 50º C (122º F). The proteins profile analysed with the help of SDS-PAGE proved that the clones secrete a group of cellulolytic enzymes with a weight average of 25 to 100 KDa, when cultivated in wheat bran, and of 30 to 60 KDa, when cultivated in CMC. Five fractions with the best results, regarding enzymatic dosage and tested before pH and temperature, were chosen by the chromatography research for the clone 307/E11. The achieved result proved that the raw enzymatic complex, extracted from the supernatant produced by the clone, develops a better activity before pH and temperature than the fractions partially purified.

O álcool, considerado um subproduto de grande importância da cultura de cana-deaçúcar, tem apresentado grande interesse nos últimos anos devido a questões econômicas e ambientais. A estimativa de produção para a safra 2007-2008, de acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), é de 251,59 milhões de toneladas de álcool. Por ser considerada uma fonte de energia alternativa (em substituição aos combustíveis fósseis) e renovável, muitos estudos estão sendo direcionados à cultura da cana-de-açúcar como, por exemplo, o aproveitamento do bagaço considerado um resíduo do setor sucroalcooleiro. O intuito deste trabalho foi o de realizar a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar por meio de enzimas celulolíticas comerciais visando identificar e quantificar açúcares fermentescíveis. Com essa finalidade, primeiramente, foram selecionadas as seguintes enzimas comerciais HPL1800, CL3708, P1250 e P4500; as quais apresentaram maior atividade celulolítica total em papel de filtro. Posteriormente foram testados dois pré-tratamentos do bagaço (ácido ou alcalino) e verificadas a atuação dessas enzimas em cada pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar pelas metodologias do ácido dinitrosalicílico (DNS) e da cromatografia líquida (HPAEC - PAD). Os dados obtidos por ambas as metodologias foram analisados estatisticamente e concluiu-se que a ação conjunta do pré-tratamento ácido 0,5%, autoclave a 121ºC por 30 minutos e a enzima P4500 foram as melhores formas de tratamento para a obtenção de açúcares. / Ethanol is considered an important by-product from sugar cane culture. Nowadays it has been shown great importance in economics and environmental questions. The estimate ethanol production 2007-2008 is about 251.59 millions of tons, according to Companhia Nacional de Abastecimento (Conab). Alcohol is considered an alternative and renewable source of energy; this has lead several new studies on development of sugarcane culture and its derivatives, such as bagasse which is considered a residue from sugarcane industry. The aim of this research is the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse for sugar production and its quantification and identification. The first step consisted at the selection of higher cellulolytic activity commercial enzymes in filter paper. The four enzymes selected were: HPL1800, CL3708, P1250 and P4500. After that, their performances were tested with two different pre-treated (acid and alkali) bagasse. The total sugars presents in the hydrolyzed were measured by dinitrosalicilic acid (DNS) and liquid chromatography (HPAEC - PAD) methodologies. The results were analyzed with statistics program. The datelines showed that joint action of 0.5% acid pre-treatment, 121ºC per 30 minutes and enzyme P4500 were the best treatment to sugars attainment.

O álcool, considerado um subproduto de grande importância da cultura de cana-deaçúcar, tem apresentado grande interesse nos últimos anos devido a questões econômicas e ambientais. A estimativa de produção para a safra 2007-2008, de acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), é de 251,59 milhões de toneladas de álcool. Por ser considerada uma fonte de energia alternativa (em substituição aos combustíveis fósseis) e renovável, muitos estudos estão sendo direcionados à cultura da cana-de-açúcar como, por exemplo, o aproveitamento do bagaço considerado um resíduo do setor sucroalcooleiro. O intuito deste trabalho foi o de realizar a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar por meio de enzimas celulolíticas comerciais visando identificar e quantificar açúcares fermentescíveis. Com essa finalidade, primeiramente, foram selecionadas as seguintes enzimas comerciais HPL1800, CL3708, P1250 e P4500; as quais apresentaram maior atividade celulolítica total em papel de filtro. Posteriormente foram testados dois pré-tratamentos do bagaço (ácido ou alcalino) e verificadas a atuação dessas enzimas em cada pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar pelas metodologias do ácido dinitrosalicílico (DNS) e da cromatografia líquida (HPAEC - PAD). Os dados obtidos por ambas as metodologias foram analisados estatisticamente e concluiu-se que a ação conjunta do pré-tratamento ácido 0,5%, autoclave a 121ºC por 30 minutos e a enzima P4500 foram as melhores formas de tratamento para a obtenção de açúcares. / Ethanol is considered an important by-product from sugar cane culture. Nowadays it has been shown great importance in economics and environmental questions. The estimate ethanol production 2007-2008 is about 251.59 millions of tons, according to Companhia Nacional de Abastecimento (Conab). Alcohol is considered an alternative and renewable source of energy; this has lead several new studies on development of sugarcane culture and its derivatives, such as bagasse which is considered a residue from sugarcane industry. The aim of this research is the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse for sugar production and its quantification and identification. The first step consisted at the selection of higher cellulolytic activity commercial enzymes in filter paper. The four enzymes selected were: HPL1800, CL3708, P1250 and P4500. After that, their performances were tested with two different pre-treated (acid and alkali) bagasse. The total sugars presents in the hydrolyzed were measured by dinitrosalicilic acid (DNS) and liquid chromatography (HPAEC - PAD) methodologies. The results were analyzed with statistics program. The datelines showed that joint action of 0.5% acid pre-treatment, 121ºC per 30 minutes and enzyme P4500 were the best treatment to sugars attainment.

Atualmente os processos biotecnológicos têm conquistado um lugar de destaque no desenvolvimento tecnológico mundial, tendo as enzimas como as celulases, grande importância econômica e diferentes aplicações industriais. O objetivo deste trabalho foi à obtenção de fungos isolados e selecionados do ambiente agroindustrial, com a capacidade de hidrolisar a fração celulósica do bagaço de cana-de-açúcar. Um total de 46 isolados foram obtidos de bagaço de cana coletados em 3 destilarias. Quinze apresentaram a formação de halo pela coloração com vermelho Congo, os quais foram avaliados quanto a atividade celulolítica (F1 a F15), tendo como referência o fungo Trichoderma ressei 9414. Os isolados foram cultivados em bagaço de canade- açúcar 1% e conduziu-se a determinação da atividade de endoglucanase (CMCase) empregando-se carboximetilcelulose (CMC) como substrato, e da atividade da celulase total (FPase) empregando papel de filtro como substrato. Após 21 dias de cultivo em bagaço de canade- açúcar nenhum dos isolados apresentou atividade da celulase total maior que T. ressei QM9414. Destes isolados, F9 apresentou maior valor para a atividade da celulase total após 7 dias de cultivo. Com relação a atividade da endoglucanase, no sétimo dia de cultivo o isolado F27 obteve melhor resultado que T. ressei QM 9414. Quanto à cinética da atividade de endoglucanase os isolados 9, 23 e 27 apresentaram atividades enzimáticas muito próximas do fungo referência (QM9414). Os resultados mostram o grande potencial da biodiversidade existente em nichos industriais, na busca de linhagens com potencialidade na hidrólise enzimática de substrato lignocelulósico, como o bagaço de cana- de-açúcar. / Biotechnological processes are achieving increased relevance in today\'s technological development, being enzymes such as celullases, of great economical importance in different industrial applications. The objective of this work was the isolation and selection of fungi from agroindustrial environment, with capacity of hydrolysing the cellulosic fraction of sugar cane bagasse. Forty six isolates were evatuated for their cellulolytic activity using CMC as carbon source and Cong Red as staining indicator . Fifteen isolates showed halo formation by red Congo staining, and they were evaluated for cellulolytic activity (F1 to F15), using Trichoderma ressei 9414 as a reference. The isolates were cultivated in 1% sugar cane bagasse and the cellulolytic activities were assessed by the determination of endoglucanase activity (CMCase) using carboximetilcelulose (CMC) as substrate, and the total celullase activity (FPase) applying filter paper as substrate. After 21 days of cultivation in sugar cane bagasse neither of the isolates showed total cellulase activity higher than T. ressei QM9414. From these isolates, F9 showed higher total cellulase activity after 7 cultivation days. For endoglucanase activity, the isolate F27 showed better result than T. ressei QM 9414 in the seventh cultivation day. For the endoglucanase activity kinetics, the isolates 9, 23 and 27 showed enzymatic activities very close to the reference fungus (QM9414). These results allow to suggest a great biotechnological potential for the biodiversity found in industrial niches, regarding the enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates, namely the sugar cane bagasse.

Os micro-organismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas. Uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares, que ajudam na degradação da matéria orgânica e são cada vez mais procuradas e exploradas pela indústria. Essa propriedade aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo. A celulase pertence a essa classe de enzimas e é formada por um complexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose por meio da quebra da ligação β,1-4. A partir dessa característica da celulase, foi realizada uma expressão heteróloga relacionada com a hidrólise da celulose em biblioteca metagenômica de solo da Caatinga. Foram realizados testes de produção enzimática por meio dos quais selecionamos os clones 283/A8 e 307/E11 como melhores produtores de endoglicanases. Com o objetivo de analisar a cinética de produção de celulases pelos clones, estes foram inoculados em diferentes fontes de celulose, pH e temperatura. A faixa ideal de pH foi 5,0 e de temperatura, 50º C, verificada para as enzimas Celulase Total, Endoglicanase e β-glicosidase. Quanto à termoestabilidade, as enzimas presentes mantiveram mais de 60% da atividade inicial após 2 horas de incubação a 50º C. O perfil de proteínas analisado por SDS-PAGE demonstrou que os clones secretam um conjunto de enzimas celulolíticas com 25 a 100 KDa, quando cultivado em farelo de trigo, e 30 a 60 KDa, quando cultivados em CMC. No ensaio de cromatografia para o clone 307/E11, foram selecionadas 5 frações que obtiveram melhores resultados na dosagem enzimática e testados frente ao pH e à temperatura. O resultado obtido foi que o complexo enzimático bruto, extraído do sobrenadante produzido pelo clone, possui melhor atividade frente ao pH e à temperatura do que as frações parcialmente purificadas. / Microorganisms are distinguished by a wide genetic diversity and they perform unique and crucial functions concerning the maintenance of ecosystems. One of those functions is the production of extracellular enzymes, which help in the degradation of organic matter and which are increasingly wanted and explored by industry. Such feature boosts the search of enzymes that can be exploited in several industrial sectors with improved full use and low cost. Cellulase belongs to such class of enzymes and it is composed of a multi-enzymatic complex which is able to hydrolyse cellulose through the breaking of the chemical bond β,1-4. Considering such attribute of the cellulase, a heterologous expression, related to cellulose hydrolysis in a metagenomic inventory of the soil of Caatinga, was realized. Tests of enzymatic production were performed, and through them, we could elect the clones 283/A8 and 307/E11 as the best endoglicanase producers. Those clones were inoculated in different cellulose sources, pH and temperature, so that we could analyse the kinetic of cellulase production between them. The ideal pH range was 5.0 and the ideal temperature range was 50º C (122º F), verified for the enzymes Total Cellulase, Endoglicanase and β-glucosidase. With regard to thermostability, the present enzymes kept more than 60% of the initial activity after 2 hours of incubation at 50º C (122º F). The proteins profile analysed with the help of SDS-PAGE proved that the clones secrete a group of cellulolytic enzymes with a weight average of 25 to 100 KDa, when cultivated in wheat bran, and of 30 to 60 KDa, when cultivated in CMC. Five fractions with the best results, regarding enzymatic dosage and tested before pH and temperature, were chosen by the chromatography research for the clone 307/E11. The achieved result proved that the raw enzymatic complex, extracted from the supernatant produced by the clone, develops a better activity before pH and temperature than the fractions partially purified.