Résumé : Les ostéosarcomes sont des tumeurs malignes osseuses primaires qui affectent principalement les enfants et les adolescents. Les thérapies utilisées depuis les 30 dernières années n'ont malheureusement eu que très peu d'effet sur la survie des patients. Ce projet de doctorat évalue deux stratégies pour contrer certaines dérégulations des cellules d'ostéosarcome humain. La première consiste à abolir leur résistance à l'apoptose avec un alcaloïde d'origine végétale. La seconde consiste à accroître leur différenciation ou à réduire leur prolifération en utilisant des protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) et leurs peptides dérivés (pBMPs). La première partie de ce doctorat s'intéresse donc au comportement et à la régulation des cellules d'ostéosarcome en comparaison avec celui des cellules osseuses normales afin d'identifier des cibles potentielles. Elle met l'accent sur trois caractéristiques de l'ostéosarcome: la résistance à l'apoptose, la prolifération incontrôlée des cellules et leur différenciation défectueuse. La sanguinarine, un alcaloïde d'origine végétale, est déjà utilisée pour traiter plusieurs types de cancers (sein et colon). Cet alcaloïde a été choisi pour vaincre la résistance à l'apoptose des cellules d'ostéosarcome. La sanguinarine a éradiqué les deux lignées cellulaires humaines d'ostéosarcome, MG-63 et SaOS-2, d'une manière dépendante du temps et de la dose. Les deux lignées cellulaires se distinguent par des états de différenciation et des taux de prolifération différents. L'alcaloïde induit l'apoptose par les voies extrinsèque et intrinsèque en activant les caspases-8 et -9. La sanguinarine semble agir sur les cellules d'ostéosarcome en fonction de leur potentiel tumorigène. La BMP-2, la BMP-9 et leurs peptides dérivés, pBMP-2 et pBMP-9, ont été utilisés pour contrer la différenciation défectueuse ou la prolifération incontrôlée des cellules d'ostéosarcome. La BMP-2, la BMP-9 et le pBMP-9 activent la phosphorylation des Smads dans les deux lignées cellulaires MG-63 et SaOS-2. Le pBMP-2 n'a eu aucun effet sur ces cellules d'ostéosarcome. Alors que le pBMP-9 agit sur la voie canonique des BMPs, il n'a cependant eu aucun effet significatif sur l'expression des gènes des marqueurs ostéogéniques à 6h. La BMP-2 induit essentiellement la phosphorylation de ERK 112, tandis que la BMP-9 et le pBMP-9 activent la voie p38. De plus, un inhibiteur de MEK1 bloque complètement l'augmentation de la phosphorylation de ERK1/2 induite par la BMP-2 et renforce la phosphorylation de la p38 en présence de BMP-9 ou du pBMP-9. Le traitement avec la BMP-2 ou la BMP-9 et l'inhibiteur MEKI augmente l'expression de gènes codant pour des marqueurs ostéogéniques précoces dans les cellules SaOS-2, tout en inhibant la croissance des cellules MG-63. Ainsi, la sanguinarine ou les BMPs en combinaison avec un inhibiteur MEKI pourraient donner lieu à un traitement anti-cancéreux prometteur. D'autres expériences sont néanmoins nécessaires pour déterminer leurs effets sur les cellules souches cancéreuses. // Abstract : Osteosarcomas are malignant primary bone tumours that normally occur in children and adolescents. Currently used therapies have not measurably improved patient survival rates over the last 30 years. This doctoral research evaluates two strategies for overcoming the major features of osteosarcoma cells. One is to abolish their resistance to apoptosis with a plant-derived alkaloid. The other is to block their defective differentiation or uncontrolled proliferation with bone morphogenetic proteins (BMPs) and peptides derived from them (pBMPs). The first part of this thesis compares the behaviour and regulation of osteosarcoma cells and normal bone cells to identify potential targets. It focuses on three features of osteosarcoma: resistance to apoptosis, uncontrolled cell proliferation, and defective cell differentiation. The plant-derived alkaloid, sanguinarine, is already used to treat several cancers (breast and colon). It was selected to overcome the resistance of osteosarcoma cells to apoptosis. Sanguinarine killed both MG-63 and SaOS-2 human osteosarcoma cells in a time- and dose-dependent manner. These two cell lines have different differentiation states and proliferate at different rates. The alkaloid induces apoptosis through the extrinsic and intrinsic pathways, activating both caspases-8 and -9. Sanguinarine seems to act on osteosarcoma cells depending on their tumourigenic potential. BMP-2, BMP-9, and their derived peptides, pBMP-2 and pBMP-9, were used to overcome the defective differentiation or uncontrolled proliferation of osteosarcoma cells. BMP-2, BMP-9, and pBMP-9 activated the phosphorylation of Smad in both MG-63 and SaOS-2 cells. pBMP-2 had no effect on osteosarcoma cells. While pBMP-9 acted on the canonical BMP pathway, it had no significant effect on the expression of genes encoding osteogenic markers at 6h. BMP-2 mainly increased the phosphorylation of ERK1 /2, while BMP-9 and pBMP-9 activated the p38 pathway. A MEKI inhibitor completely blocked the BMP-2-triggered increase in ERK1/2 phosphorylation and enhanced the phosphorylation of p38 induced by BMP-9 or pBMP-9. Treatment with BMP-2 or BMP-9 and MEKI inhibitor increased the the expression of genes encoding osteogenic markers in SaOS-2 cells, while inhibiting the growth of MG-63 cells. Thus, sanguinarine or BMPs plus a MEK I inhibitor could give rise to a promising anti-cancer treatment. Further experiments are now required to determine their effect on cancer stem cells.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires. Ils transmettent vers l’intérieur de la cellule des signaux extracellulaires d’une grande diversité physiologique. Les différentes classes de RCPGs induisent l'activation de nombreuses voies de signalisation par une multitude de seconds messagers. Le type cellulaire, le contexte du stimulus ainsi que les complexes multiprotéiques recrutés à la membrane plasmique influencent le niveau de spécialisation du signal induit. Le récepteur du thromboxane A? (TP) est exprimé sous deux isoformes, issues d’un épissage alternatif. Les deux isoformes étant régulées différemment au niveau de la signalisation et de la désensibilisation. Dans ce contexte, il est important d’étudier les protéines qui interagissent spécifiquement avec l’une ou l’autre de ces isoformes. Un criblage par double-hybride chez la levure a permis d’identifier une nouvelle protéine d'interaction pour l’isoforme ß de TP (TPß), WDR36 (WD repeat protein 36), une protéine dont la fonction est inconnue. Dans une première étude, nous démontrons que WDR36 interagit directement avec TPß, et que cette interaction est modulée en cellule par la stimulation du récepteur. TP? active la production d’inositol phosphate, qui est augmentée par WDR36. Cette régulation est supportée par l’interaction de WDR36 avec deux effecteurs de la signalisation de TPß, soit G?q et PLCß2. La présence de WDR36 accentue l’interaction entre G?q et PLCß2, et l’interaction entre WDR36 et PLCß2 est modulée par la stimulation de TPß. L'étude des différents mutants de WDR36 associés au glaucome montre qu’ils affectent différemment la production d'inositol triphosphate induite par TPß, comparativement à la protéine de type sauvage. Finalement, nous illustrons que WDR36 induit une activation accrue de ERK1/2 suite à la stimulation de TPß. Ces résultats suggèrent que WDR36 agit à titre de protéine d’échafaudage, servant à favoriser la signalisation de TPß en rapprochant dans un complexe multi-protéique le récepteur TPß et ses effecteurs G?q et PLCß2. Pour faire suite à cette étude, nous avons investigué le rôle de WDR36 dans l'activation de la voie des MAPKs produite par l'activation de TPß. Nous démontrons que WDR36 augmente l’activation de ERK1/2, mais pas de p38 ou JNK. L’activation progresse via la cascade PLCß-PKC-c-Raf-MEK1/2-ERK1/2. L’interaction entre WDR36 et les membres de cette cascade est présente de façon basale et est modulée par la stimulation de TPß. L’expression de WDR36 semble également être importante pour l’interaction c-Raf-ERK1/2 et MEK1/2-ERK1/2. Ces résultats suggèrent que WDR36 assemble un complexe multi-protéique facilitant la phosphorylation et l’activation de ERK1/2. Cette phosphorylation accrue se traduit par une augmentation de la translocation nucléaire de ERK1/2 activées, de la production de c-Fos et de la prolifération cellulaire. Finalement, l’effet positif de WDR36 sur l’activation de ERK1/2 peut également être observé suite à une stimulation des cellules avec des facteurs de croissance retrouvés dans le sérum. Ces deux études supportent un modèle dans lequel WDR36 agit à titre de protéine d'échafaudage dans la signalisation du récepteur TPß en rapprochant ce dernier de ses effecteurs G?q et PLCß2, et en réunissant les membres de la voie d'activation de ERK1/2. Cette caractérisation des rôles de WDR36 est d’autant plus importante, puisque différents variants de WDR36 sont maintenant associés à différents cancers. À cet égard, WDR36 pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique dans la recherche sur le cancer. [symboles non conformes]

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Une augmentation de la génération des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO), tels que le peroxyde d’hydrogène (H2O2), joue un rôle clé dans la pathophysiologie des maladies cardiovasculaires (MCV). La croissance et la prolifération excessives des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) ont été suggérées comme étant les mécanismes à la base de la dysfonction vasculaire. Une implication potentielle du facteur de transcription Early growth response protein-1 (Egr-1) dans le développement des dommages vasculaires a été proposée. Des études ont démontré que le H2O2 augmente l’expression de l’Egr-1 dans les CMLV. Cependant, les voies de signalisation intracellulaire menant à l’expression de l’Egr-1 en réponse au H2O2 restent à établir. L’objectif de cette étude vise à examiner les différentes voies de signalisation impliquées dans l’expression de l’Egr-1 induite par le H2O2 dans les CMLV. Le H2O2 augmente l’expression de l’Egr-1 en fonction du temps et de la dose dans les CMLV A10. Le blocage pharmacologique des tyrosines kinases insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) et c-Src, par AG1024 et PP2 respectivement, atténue l’expression de l’Egr-1 induite par le H2O2, alors que l’AG1478, un inhibiteur de l’epidermal growth factor receptor (EGFR), et le PP3, l’analogue inactif du PP2, n’ont aucun effet sur l’expression de l’Egr-1. Le blocage pharmacologique de l’extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), par UO126, et de la protéine kinase C (PKC), par rottlerin et rö-31-8220, diminue l’expression de l’Egr-1 induite par le H2O2. En résumé, nos résultats suggèrent que le H2O2 déclenche l’expression de l’Egr-1 via l’IGF-1R, la kinase c-Src, l’ERK1/2 et la PKC dans les CMLV. / Increased generation of reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide (H2O2), plays a key role in the pathophysiology of cardiovascular diseases (CVD). Excessive growth and proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) has been suggested as an important contributor of vascular dysfunction. A potential involvement of early growth response protein-1 (Egr-1), a zinc-finger transcription factor, in the development of vascular injury has been proposed. Recent studies have shown that H2O2 increases Egr-1 expression in VSMCs. However, signaling events leading to H2O2-induced Egr-1 expression are not fully understood. Therefore, this study aims to examine the signaling pathways implicated in H2O2-induced Egr-1 expression in VSMC. H2O2 increased Egr-1 expression in a time and dose-dependent fashion in A10 VSMC. Pharmacological blockade of tyrosine kinases insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) and c-Src, by AG1024 and PP2 respectively, attenuated H2O2-induced Egr-1 expression, while AG1478, an epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor, and PP3, the inactive analogue of PP2, have no effect on Egr-1 expression. Pharmacological blockade of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), by UO126, and proteine kinase C (PKC), by rottlerin and rö-31-8220, decreased H2O2-induced Egr-1 expression. In summary, our results suggest that H2O2 triggers Egr-1 expression through IGF-1R, c-Src, ERK1/2 and PKC in VSMC.

Transforming growth factor-β1 (TGFβ1) is a mediator of the fibrotic response through activation of quiescent cardiac fibroblasts to hypersynthetic myofibroblasts. Scleraxis (Scx) is a pro-fibrotic transcription factor that is induced by TGFβ1-3 and works synergistically with Smads to promote collagen expression. Ski is a negative regulator of TGFβ/Smad signaling through its interactions with Smad proteins at the promoter region of TGFβ regulated genes. To date, no studies have examined the direct DNA:protein transcriptional mechanisms that regulate Scx expression by TGFβ1-3 or Ski, nor the mechanisms that govern Ski expression by Scx. We hypothesize that Ski and Scx regulate one another, and form a negative feedback loop that represses gene expression and is a central regulator of the fibrotic response in cardiac myofibroblasts. Primary adult rat cardiac myofibroblasts were isolated via retrograde Langendorff perfusion. First passage (P1) cells were infected with adenovirus encoding HA-Ski, HA-Scx, or LacZ at the time of plating. Twenty-four hours later, cells were harvested for Western blot, quantitative real-time PCR (qPCR), and electrophoretic gel shift assays (EMSA). NIH-3T3 or Cos7 cells were transfected with equal quantities of plasmid DNA for 24 hours prior to harvesting for luciferase, qPCR, and EMSA analysis. Ski overexpression in P1 myofibroblasts resulted in a reduction in both Scx mRNA and protein levels. Overexpression of Scx had no effect on Ski expression. Luciferase reporter assays demonstrated that Scx was induced by TGFβ1 treatment in a concentration dependent manner. However, ectopic Smad2/3 expression was unable to transactivate the Scx promoter in a luciferase reporter assay. Inhibition of p44/42-MAPK signaling modestly counteracted the effect of TGFβ1 on Scx expression. Scx had no effect on Ski promoter expression, however, both tumor necrosis factor-α (TNFα) and p65 expression repressed the Ski promoter and correlated with reduced Ski mRNA levels. We conclude that Ski is a repressor of Scx and that Scx expression is partially mediated through a Smad-independent, p44/42-MAPK pathway in cardiac myofibroblasts. Furthermore, this study proposes a role for TNFα/p65 NF-κΒ signaling in the regulation of Ski gene expression in the cardiac myofibroblast. / October 2016

Platelet-derived growth factor (PDGF) is a family of signaling molecules that stimulates cell growth, survival and migration. PDGF is recognized by specific transmembrane proteins, the PDGF receptors, which relay the signals to the cell activating the Mitogen-activated protein (MAP) kinases and other signaling pathways. Aberrant activation of these pathways is frequently detected in cancer. Hence, the study of these processes is essential for identifying potential drug targets or diagnostic markers. In paper I, we identified Receptor Subfamily 4 Group A Member 1 NR4A1 to be regulated by PDGF via MAP kinases, clarifying the role of Extracellular signal–regulated kinases (Erk) 1/2, Erk5 and Nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) in its regulation. NR4A1 was found to be important for the tumorigenic potential, measured as anchorage-independent growth, of glioblastoma cells. Since the cellular responses elicited by PDGF result from the balance between phosphorylation and dephosphorylation events, we investigated the role of the dual specificity phosphatases DUSP4/MKP-2 and DUSP6/MKP-3. In paper II, we describe the crucial role of Erk1/2 and p53 in the expression of DUSP4/MKP2. Moreover, we observed that DUSP4/MKP-2 downregulation decreases Erk5 activation and accelerates PDGFRβ internalization and downregulation resulting in a specific inhibition of Signal transducers and activators of transcription (Stat) 3, Src and protein kinase C (PKC), and partially of p38, Stat1/5 and Phoshoplipase Cγ (PLCγ). In paper III, we report that DUSP6/MKP-3 creates a negative cross-talk between Erk1/2 and Erk5 and an auto-inhibitory feedback loop on the PI3-kinase/Akt pathway. In paper IV, we identify a new regulative mechanism of the PDGF pathway. PDGF induces Erk5 expression and activation that modulates the PDGFRβ activity. After Erk5 downregulation, the receptor undergoes to a faster and stronger activation that results in a faster internalization and degradation. In conclusion, we present a mechanism through which the PDGF/MAP kinases support tumor growth, and elucidate different regulatory pathways involved in PDGF signaling.

La relation entre l’obésité et le cancer, bien qu’établie par des études épidémiologiques, est peu connue. Pourtant, environ 25 % des cancers pourraient y être attribuables. Parmi les cancers reliés à l’obésité, les cancers du côlon, du sein chez les femmes ménopausées et de la prostate sont les plus fréquents. Des études sur modèles animaux ont suggéré une association positive entre une diète riche en gras et le développement du cancer mammaire et de la prostate. Nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les acides gras influencent le devenir de lignées de cellules cancéreuses du sein et de la prostate. Ces travaux ont montré que les acides gras insaturés, dont l’oléate, induisent la prolifération cellulaire tandis que les acides gras saturés, dont le palmitate, diminuent la prolifération. Un traitement à l’oléate stimule la formation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145 alors qu’un traitement au palmitate entraîne l’apoptose. Le mécanisme d’action de l’oléate sur la prolifération a été étudié de façon plus approfondie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques nous a permis de déterminer que l’effet prolifératif de l’oléate implique la voie PI3K/Akt, la voie ERK1/2 et l’activation d’un ou de plusieurs récepteur(s) couplé(s) aux protéines G (GPCR). L’oléate induit la phosphorylation rapide des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145. Au cours des dernières années, deux GPCRs ont été identifiés comme étant activables par des acides gras à moyennes et à longues chaînes, GPR40 et GPR120. GPR40 étant exprimé dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein et de la prostate contrairement à l’expression de GPR120 qui était inexistante dans la plupart des lignées, nous avons étudié l’implication de GPR40 dans l’effet prolifératif de l’oléate. Ces deux récepteurs n’étant pas exprimés dans les cellules épithéliales mammaires humaines en culture primaire, ces cellules ne répondent pas aux effets de l’oléate sur la prolifération et l’activation des voies de signalisation. L’activation des voies Akt et ERK1/2 par l’oléate dans les cellules MDA-MB-231 et DU145 est potentialisée par la surexpression du récepteur GPR40 et inhibée par l’utilisation d’un siRNA dirigé contre ce récepteur. Cependant, la prolifération induite par l’oléate ne semble pas affectée par la présence d’un siRNA dirigé contre GPR40. L’oléate étant un acide gras, il est capable d’entrer librement dans les cellules et une partie de ses effets sur la prolifération pourrait être attribuée à sa métabolisation. Un agoniste de GPR40, le GW9508, est en mesure d’activer GPR40 sans toutefois entrer dans les cellules ni activer le métabolisme de l’oléate. Le GW9508 stimule la phosphorylation des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145, mais il n’est pas en mesure d’induire la prolifération cellulaire comme le fait l’oléate. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le mécanisme d’action de l’oléate sur les cellules de cancer du sein et de la prostate. L’oléate induit la signalisation de GPR40 qui est impliquée dans l’activation rapide des voies de signalisation Akt et ERK1/2. De son côté, l’effet prolifératif induit par l’oléate s’effectue par un mécanisme GPR40-indépendant, possiblement lié au métabolisme de l’oléate. / The relationship between obesity and cancer, although established by epidemiological studies, remains relatively unknown. However, about 25 % of cancers could be attributed to obesity. Among cancers that are affected by obesity, colon cancer, post-menopausal breast cancer and prostate cancer are the more frequent. Studies on animal models have suggested a positive association between high fat diets and de development of mammary and prostate cancer. We have studied the molecular mechanisms by which fatty acids influence breast and prostate cancer cells fate. This work has shown that unsaturated fatty acids, including oleate, can induce cellular proliferation while saturated fatty acids, including palmitate, reduce proliferation. An oleate treatment stimulates lipid droplets formation in the cytoplasm of breast cancer cells MDA-MB-231 and prostate cancer cells DU145 while a palmitate treatment induces apoptosis. The action mechanism of oleate on proliferation was studied more closely. Using pharmacological inhibitors, we determine that oleate-induced cell proliferation involves PI3K/Akt signaling pathway, ERK1/2 signaling pathway and the activation of one or many G protein coupled receptor(s) (GPCR). Oleate induces rapid Akt and ERK1/2 phosphorylation in breast cancer cells MDA-MB-231 and prostate cancer cells DU145. In the last few years, two GPCRs were identified as being activated by medium and long chain fatty acids, GPR40 and GPR120. GPR40 being expressed in many breast and prostate cancer cell lines while GPR120 expression was null in most cell lines tested, we studied the role of GPR40 in oleate-induced proliferation. Human epithelial mammary cells in primary culture did not express GPR40 nor GPR120 and failed to respond to oleate-induced cell proliferation or activation of signaling pathways. Akt and ERK1/2 signaling pathways activation by oleate in MDA-MB-231 and DU145 cells is potentiated by GPR40 over-expression and inhibited by the use of an siRNA directed against that receptor. However, oleate-induced cell proliferation does not seem to be affected by the presence of the siRNA directed against GPR40. Oleate being a fatty acid, it can enter cells freely by crossing the plasma membrane and part of its effects on proliferation could be attributed to its metabolism. A GPR40 agonist, GW9508, is able to activate GPR40 without entering the cells nor activating oleate’s metabolism. GW9508 stimulates Akt and ERK1/2 phosphorylation in breast cancer cells MDA-MB-231 and prostate cancer cells DU145, but does not induce cell proliferation as does oleate. These results help us to understand the action mechanism of oleate in breast and prostate cancer cells. Oleate induces GPR40 signalization which is involved in the rapid Akt and ERK1/2 signaling pathways activation. On the other hand, oleate-induced cell proliferation is carried out by a GPR40-independent mechanism, possibly linked to oleate’s metabolism.

Protein kinases ERK1 and ERK2 are one of the most studied proteins in cell signalling. Both proteins are involved in a plethora of processes, such as phosphorylation and activation of kinases as part of signalling pathways. Enzymes ERK1 and ERK2 are part of MAPK/ERK signalling cascade, connected to many cellular including cell proliferation, cell growth or differentiation. The MAPK/ERK signalling cascade is often activated in different types of tumors, making it a candidate for developing new chemical inhibitors. One of the important questions in fundamental research of ERK1 and ERK2 protein kinases is the search for difference between these proteins. Current knowledge points to redundancy of both proteins, howver several examples suggest otherwise. Recently, the work presented in Casanova et al. 2012 indirectly suggests divergent effect of ERK1 and ERK2 on cap-independent translation initiation. In the Laboratory of RNA biochemistry we focus on HCV IRES (Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site) dependent translation initiation. This diploma thesis lead to establish RNA interference method in our laboratory and to establish reporter system to study ERK1 and ERK2 effect on HCV IRES dependent translation initiation. Based on our data acquired during our research, we present in this work...

Epithelial ovarian cancer frequently metastasizes to the omentum, a process that requires pro-angiogenic activation of local microvascular endothelial cells (ECs) by tumour-secreted factors. We have previously shown that ovarian cancer cells secrete factors, other than vascular endothelial growth factor (VEGF), with possible roles in metastatic angiogenesis including the lysosomal proteases cathepsin L (CathL) and cathepsin D (CathD), and insulin-like growth factor binding protein 7 (IGFBP7). However, the mechanisms by which these factors may contribute to omental endothelial angiogenic changes are unknown. Therefore the aims of this thesis were a) to examine disease relevant human omental microvascular endothelial cell (HOMEC) proliferation, migration and angiogenesis tube-formation induced by CathL, CathD and IGFBP7; b) to investigate whether CathL and CathD act via a proteolytic or non-proteolytic mechanism; c) to identify activated downstream intracellular signalling cascades in HOMECs and their activation in proliferation and migration; and finally d) to identify activated cell surface receptors by these factors. CathL, CathD and IGFBP7 significantly induced proliferation and migration in HOMECs, with CathL and CathD acting in a non-proteolytic manner. Proteome-profiler and ELISA data identified increased phosphorylation of the ERK1/2 and AKT (protein kinase B) pathways in HOMECs in response to these factors. CathL induced HOMEC proliferation and migration via the ERK1/2 pathway, whereas, although CathD-induced proliferation was mediated by activation of ERK1/2, its migratory effect was dependent on both ERK1/2 and AKT pathways. Interestingly, CathL induced secretion of galectin-1 (Gal1) from HOMECs which in turn significantly induced HOMEC proliferation via ERK1/2. However, none of the ERK1/2 or AKT pathways was observed to be active in Gal1-induced HOMEC migration. Interestingly, Gal1-induced proliferation and migration were significantly inhibited by L-glucose, suggesting a role for a receptor with extracellular sugar moieties. IGFBP7-induced migration was shown to be mediated via activation of the ERK1/2 pathway only. CathL, Gal1 and IGFBP7 significantly induced angiogenesis tube-formation in HOMECs which was not observed in CathD-treated cells. Receptor tyrosine kinase array revealed activation of Tie-1 and VEGF receptor type 2 (VEGFR2) in CathL and IGFBP7-treated HOMECs respectively. In conclusion, all CathL, CathD, Gal1 and IGFBP7 have the potential to act as proangiogenic factors in the metastasis of ovarian cancer to the omentum. These in vitro data suggest all four factors activate intracellular pathways which are involved in well-known angiogenesis models.

Protein Kinase C-iota (PKC-é), an atypical protein kinase C isoform manifests its potential as an oncogene by targeting various aspects of cancer cells such as growth, invasion and survival. PKC-é confers resistance to drug-induced apoptosis in cancer cells. The acquisition of drug resistance is a major obstacle to good prognosis in neuroblastoma. The focus of the dissertation was three-fold: First to study the role of PKC-é in the proliferation of neuroblastoma. Secondly, to identify the efficacy of [4-(5-amino-4-carbamoylimidazol-1-yl)-2,3-dihydroxycyclopentyl] methyl dihydrogen phosphate (ICA-1) as a novel PKC-é inhibitor in neuroblastoma cell proliferation and apoptosis. Finally, to analyze whether PKC-é could self-regulate its expression. Cyclin dependent kinase 7 (Cdk7) phosphorylates cyclin dependent kinases (cdks) and promotes cell proliferation. Our data shows that PKC-é is an in-vitro Cdk7 kinase and that neuroblastoma cells proliferate via a PKC-é/Cdk7/cdk2 cell signaling pathway. ICA-1 specifically inhibits the activity of PKC-é but not that of PKC-zeta (PKC-æ), the closely related atypical PKC family member. The IC50 for the kinase activity assay was approximately 0.1µM which is 1000 times less than that of aurothiomalate, a known PKC-é inhibitor. The phosphorylation of Cdk7 by PKC-é was potently inhibited by ICA-1. ICA-1 mediates its antiproliferative effects on neuroblastoma cells by inhibiting the PKC-é/Cdk7/cdk2 signaling pathway. ICA-1 (0.1µM) inhibited the in-vitro proliferation of BE(2)-C neuroblastoma cells by 58% (P=0.01). Additionally, ICA-1 also induced apoptosis in neuroblastoma cells. Interestingly, ICA-1 did not affect the proliferation of normal neuronal cells suggesting its potential as chemotherapeutic with low toxicity. Hence, our results emphasize the potential of ICA-1 as a novel PKC-é inhibitor and chemotherapeutic agent for neuroblastoma. Bcr-Abl has been shown to regulate the activation of the transcription factor ELK-1 which in turn regulates the expression of PKC-é. Alternatively, we hypothesize that PKC-é can self regulate its expression by indirectly regulating the activity of Elk-1 in an ERK1 dependent manner. Our preliminary data shows that there was robust increase in the expression as well as association of PKC-é and Elk-1 in actively proliferating neuroblastoma cells suggesting a potential role of PKC-é in regulating the activity of Elk-1. Analysis of the subcellular fractions also presented a similar increase in the association between PKC-é and Elk-1 in the nuclear fraction of actively proliferating cells as compared to cytoplasm. Interestingly, the nuclear expression of PKC-é was also found to be higher in these cells, suggesting that PKC-é translocated to the nucleus in actively proliferating cells and regulated the transcriptional activity of Elk-1. However, our data from in-vitro kinase activity demonstrated that PKC-é was not an Elk-1 kinase but that it increased the phosphorylation of Elk-1 in the presence of ERK1, an upstream kinase of Elk-1 in the Bcr-Abl mediated regulatory pathway of PKC-é. This suggested that ERK1 was integral to the self-regulatory activity of PKC-é. In conclusion, we hypothesize that the self-regulatory mechanism of PKC-é is initiated by the translocation PKC-é into the nucleus where it activates ERK1. This promotes the activation of its downstream target Elk-1 which subsequently upregulates the expression of PKC-é