Estudos filogenéticos recentes mostram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados como R. sanguineus. Carrapatos R. sanguineus da chamada América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) formam um grupo monofilético, claramente distinto de um segundo grupo monofilético, formado por R. sanguineus da denominada América Latina tropical (desde México ao estado Brasileiro de Santa Catarina), com claras possibilidades desses dois grupos estarem representados por duas espécies distintas dentro do complexo sanguineus. Estudos sobre erliquiose canina (causada por Ehrlichia canis) na América Latina indicam que E. canis é altamente prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina temperada. Desta forma, a hipótese primária do presente projeto foi que a ausência ou escassez de casos de erliquiose canina na América Latina temperada se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, em que os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial para E. canis. Baseado no exposto acima, o objetivo geral do presente projeto foi avaliar de forma comparativa a competência vetorial de quatro populações de R. sanguineus da região Neotropical, uma representando a América Latina tropical e três representando a América Latina temperada. Carrapatos nas fases de larvas e ninfas, derivados de quatro populações de R. sanguineus, provenientes da Argentina (América Latina temperada), Estado do Rio Grande do Sul (América Latina temperada), Uruguai (América Latina temperada) e da cidade de São Paulo, Brasil (América Latina tropical) foram expostos a E. canis, ao se alimentarem em cães infectados com E. canis, na fase aguda da doença. Em paralelo, larvas e ninfas não infectadas de cada uma das quatro populações foram levadas a infestar cães não infectados (grupo controle). As larvas e ninfas ingurgitadas, recuperadas nessa primeira fase, foram deixadas em estufa para realizarem ecdise para ninfas e adultos, respectivamente. Parte destas ninfas e adultos foi separada para análises moleculares. Outra parte dessas ninfas e adultos foi levada a infestar cães susceptíveis, a fim de se verificar a competência vetorial desses carrapatos das quatro populações. Nas infestações realizadas, amostras de sangue dos cães infestados foram colhidas semanalmente durante sessenta dias. Parte desse sangue foi processado imediatamente para hemograma, mostrando que somente os cães infestados com adultos de R. sanguineusde São Paulo, expostos a E. canis na fase de ninfa, apresentaram alterações marcantes de números de eritrócitos, volume globular, hemoglobina e plaquetas abaixo do valor mínimo de referência para cães sadios. Todos os demais cães infestados apresentaram valores de hemograma sem grandes alterações significativas. Nenhum cão apresentou febre. A outra parte do sangue colhido semanalmente foi separada para processamento por PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-E. canis. As análises moleculares (PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis) e sorológicas (imunofluorescência indireta) de todos esses cães foram realizadas, assim como as análises moleculares dos carrapatos, a fim de se verificar a freqüência de carrapatos de cada população que se infectou, após se alimentarem em cães infectados. Os resultados indicam que somente os carrapatos da colônia de São Paulo (América Latina tropical) foram competentes para transmitir a doençaa três cães sadios, que se mostraram positivos na PCR em tempo real e na soroconversão para E. canis. Todos os cães infestados com carrapatos das colônias da América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) não se infectaram por E. canis, mesmo que esses carrapatos haviam se alimentado, num estágio anterior, em um cão sabidamente infectado. Os testes moleculares dos carrapatos corroboram esses resultados, uma vez que nenhum carrapato adulto (exposto E. canis na fase de ninfa) das colônias da Argentina e Uruguai se mostrou positivo na PCR em tempo real, ao passo que pelo menos 1% das ninfas e 28% dos adultos de R. sanguineus da colônia São Paulo se mostraram positivos, após se alimentarem como larvas e ninfas, respectivamente, no mesmo cão infectado que serviu de alimento para os carrapatos da América Latina temperada (Uruguai, Argentina e Rio Grande do Sul). Em relação aos carrapatos provenientes do estado do Rio Grande do Sul, 4% dos adultos analisados logo após a ecdise se apresentaram positivos na PCR em tempo real, mas nenhum adulto foi positivo 30 dias após a ecdise. Como os carrapatos dessa população não foram competentes para transmitir a bactéria para cães susceptíveis, presume-se que os resultados positivos na PCR logo após a ecdise se deva a DNA residual da bactéria ingerida na alimentação da ninfa no cão infectado. Carrapatos adultos das quatro populações estudadas foram inoculados pela via intracelomática com emulsão de células DH82 infectadas com E. canis. Após ficarem incubados por 10 dias numa incubadora BOD a 25oC, se alimentaram por cinco dias em coelhos, quando então foram manualmente retirados e tiveram suas glândulas salivares dissecadas e submetidas a extração de DNA. Pela PCR em tempo real, somente 1 (10%) de 10 carrapatos da população de São Paulo foi positivo para E. canis, ao passo que nenhum carrapato das demais populações (10 carrapatos por população) foi positivo.Amostras de carrapatos adultos do grupo R .sanguineus coletados a campo em diferentes regiões do Brasil foram analisadas através da técnica de PCR em tempo real para verificar a presença da bactéria E. canis. Foram coletados R.sanguineus dos seguintes locais (30 a 374 carrapatos por localidade): São Paulo/SP, Cuiabá/MT, Campo Grande/MS, Paulo Afonso/BA, Cachoeira do Sul/RS, São Luís/MA, Uberlândia/MG, Bandeirantes/PR, Petrolina/PE, Ji-Paraná/RO; e amostras de Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina). Apenas os carrapatos de Cachoeria do Sul/RS, Campo Grande/MS, Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina) foram todos negativos na PCR. Nas demais localidades, o percentual de carrapatos positivos para E. canis variou de 2,0 a 7.9%. Os resultados deste trabalho servem para uma melhor compreensão da ausência de casos de infecção canina por E. canis na América Latina temperada (cone sul) e reforçam a hipótese de que tal fato se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, onde os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial. / Philogenetic studies have shown that in Latin America two different groups of the tick species Rhipicephalus sanguineus. These two groups found apart in two different regions, the Temperate region (Chile, Argentina, Uruguay and Southern Brazil) and the Tropical region (From Southern Brazil up to Mexico). It is likely that those two groups are represented by two different species within R. sanguineus group. Studies on ehrlichiosis (caused by Ehrlichiacanis) in the Latin America point thet E. canis is highly prevalent in the Tropical region whereas is rarely report in Temperate region. The present study tests the hypothesis that the distribution of ehrlichiosis are related to the low vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Temperate area and the high vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Tropical area. The objective of this study was to evaluate comparatively the vectorial competence of four R. sanguineus tick population, where three were collected in Temperate Area, from Argentina, Uruguay and State of Rio Grande do Sul (Brazil) and one from Tropical Area from the State of São Paulo (Brazil). Ticks from all four populations were exposed to E. canins through feeding upon infected dogs in acute disease phase, a control group were set up for each population by feeding larvae and nymphs on non infected dogs. All larvae and nymphs collected in this part of the study were allowed to molt in incubator (27oC,>85%RH) to nymphs and adults, respectively. Part of the ticks were selected to underwent molecular analysis, other part were released on susceptible dogs, in order to determine the vectorial competence for each of the tick populations. From the carried out infestations, samples of blood from the infested dogs were drawn weekly during 60 days. Part of the drawn blood was processed for hemogram that yielded that dogs infested with ticks from the São Paulo population, exposed to E. canis during the nymphal stage, showed important alteration on the number of erytrocytes, hemoglobine, packed cell volume, and platelets underneath the threshold for health dogs. All other dogs showed no important alteration in blood parameters. No fever was detected in any of the dogs. The other part of the weekly drawn blood from each dog was processed by real time PCR targeting E. canis DNA and processed by serology (Indirect immunofluorescence) seeking for anti-E. canis antibodies. Molecular analysis (real time PCR) on ticks were carried out in order to detect the prevalence of infected ticks on each population. Results show that only the ticks from the São Paulo population (Tropical Region) were competent in transmitting E. canis to three susceptible dogs, since material from these three fogs yielded positive in real time PCR and sorology tests. All dogs infested with ticks from the Argentina, Urugay and State of Rio Grande do Sul (Temperate Regions) population have not being infected by E. canis. The molecular tests on the ticks support this find since no tick from Argentina and Uruguay population yielded positive in the real time PCR, whereas about 1% of the nymphs and 28% of the adults of ticks from São Paulo population yielded positive in the real time PCR. The ticks from the State of Rio Grande do Sul population showed 4% of positive for real time PCR among the adult ticks tested, but when these ticks fed on susceptible dogs, they were not competent in transmitting the bacterium, what may shown that these PCR positive ticks might have residual bacterium DNA in the midgut. Analysis on the salivary gland from the adult ticks from all four tick populations that were either incoculates in vitro with E. canis or feeding upon infected dogs, showed positive for E. canis DNA only in the São Paulo population. Samples of ticks collected from different regions of Brazil were analyzed by real time PCR in order to detect E. canis bacterium DNA. There were collected R. sanguineus from the cities of São Paulo, Cuiabá, Campo Grande, Paulo Afonso, Cachoeira do Sul, São Luís, Uberlândia, Bandeirantes, Petrolina, Ji-Paraná; e amostras de Montevidéu (Uruguay) e Rafaela (Argentina). The State of Maranhão showed 7.94% of positive ticks, that being the highest prevalence found. Samples from State of Rio Grande do Sul, Campo Grande City, alongside with cities of Rafaela (Argentina) and Montevidéu (Uruguay), showed none positive tick for E. canins bacterium DNA. All presented data contribute for a better understanding on the absence of canine ehrlichiosis cases in the Temperate Latin America (Southern South America) and therefore support the hypothesis that this fact is related to the low vetorial competence of the ticks within the R. sanguineus taxon founded in this region, on the other hand, ticks within the R. sanguineus taxon found in Tropical Latin America show high vectorial competence in E. canis transmission.

O presente estudo visou obter informações sobre a epidemiologia da erliquiose canina no Brasil, a partir da caracterização molecular de isolados nacionais e de estudo de prevalência da infecção em cães (Canis familiaris) e carrapatos Rhipicephalus sanguineus. Inicialmente, padronizou-se o isolamento de Ehrlichia canis em cultivo de células DH82, a partir de um cão inoculado com a cepa Jaboticabal, seguida da identificação do isolado pelo sequenciamento de DNA de um fragmento do gene dsb de Ehrlichia. Posteriormente, realizou-se o isolamento de E. canis de um cão naturalmente infectado, atendido no Hospital Veterinário (HOVET) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Este novo isolado foi geneticamente caracterizado a partir da PCR almejando fragmentos dos genes dsb, 16S rRNA e P28. Com o estabelecimento do isolado Jaboticabal em cultivo celular, padronizou-se a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), utilizando-a em amostras de soros de 314 cães de áreas urbana e rural do Município de Monte Negro, RO. Finalmente, avaliou-se pela PCR do gene dsb, a freqüência de carrapatos infectados e de cães oriundos de quatro populações de R. sanguineus, uma do município de Monte Negro, RO. e três do estado de São Paulo. Do cão inoculado com o isolado Jaboticabal, constatou-se o crescimento de E. canis em cultivo celular, no 27o dia pós-inoculação, confirmado pela PCR e citologia. Após o seqüenciamento de DNA, o fragmento amplificado a partir do isolado apresentou-se 100% similar a seqüência correspondente ao gene dsb de E. canis depositada no GenBank. O isolamento de E. canis, a partir do cão atendido no HOVET, foi obtido no 14o dia pós-inoculação. Esta nova cepa, designada como isolado São Paulo, apresentou-se idêntica às seqüências do gene dsb e similares às seqüências dos genes 16S r RNA e P28, de outros isolados de E. canis disponíveis no GenBank. Dos soros testados pela RIFI, observou-se prevalência (títulos &plusmn; 40) de 31,2% (98/314), sendo 37,9% (58/153) em cães urbanos e 24,8% (40/161) em cães rurais (P < 0,05) de Monte Negro, Estado de Rondônia. A prevalência de carrapatos infectados (dada como freqüência mínima de infecção) foi de 2,3, 6,2, e 3,7% para as populações 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), e 3 (São Paulo I, SP), respectivamente (P > 0,05). Nenhum carrapato infectado foi detectado na população 4 (São Paulo II, SP). Os produtos da PCR dos carrapatos e de cães das populações 1, 2 e 3 foram idênticos entre si e à seqüência de E. canis disponível no GenBank. Estes resultados reforçam estudos anteriores, que relataram a infecção por E. canis em cães do Brasil, contudo descreve pela primeira vez no Brasil a infecção natural por E. canis em carrapatos R. sanguineus, tido como o principal carrapatos de cães no país. / The present study was conducted to investigate the canine ehrlichiosis epidemiology in Brazil, through molecular characterization of indigenous isolates and prevalence of infection in dogs (Canis familiaris) and Rhipicephalus sanguineus ticks. Firstly, it was performed the isolation of the Jaboticabal strain of Ehrlichia canis in DH82 cells from an experimentally infected dog, followed by molecular identification of the isolate by sequencing a fragment of the Ehrlichia dsb gene. After that, a new strain of E. canis was isolated from a naturally infected dog, assisted in the Veterinarian Hospital (HOVET) of the Faculty of Veterinary Medicine, University of São Paulo. This isolate was characterized by obtaining dsb, 16S rRNA and P28 nucleotide partial sequences. After the establishment of Jaboticabal strain in DH82 cells, an Indirect Immunofluorescence Test (IFAT) was developed, and 314 urban and rural dogs from Monte Negro Municipality were tested by this technique. Finally the prevalence of E. canis was determined in four different populations of Rhipicephalus sanguineus ticks, being one population from Monte Negro, RO. and three from different areas from São Paulo state using a PCR targeting an erlichial dsb gene fragment. Culture of E. canis Jaboticabal presented positive results by PCR on day 27. The dsb sequence was identical to other E. canis sequences available in GenBank. Cell culture inoculated with material from the dog assisted in the HOVET became positive by day 14 when dsb PCR was positive. This new strain was designated as isolate São Paulo of E. canis and showed to contain identical dsb and high similar partial sequences of 16S rRNA and P28 genes with others E. canis strains available in GenBank. Antibodies Anti-E. canis (titers &plusmn; 40) were detected in 31.2% (98/314) of the dogs, being 37.9% (58/153) in urban and 24.8% (40/161) in rural dogs of Monte Negro; these values were significantly different (P<0.05). The prevalence of infected ticks (given as minimal infection rate) was 2.3, 6.2, and 3.7% for populations 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), and 3 (São Paulo I, SP), respectively, which were statistically similar (P>0.05). In contrast, no infected tick was detected in population 4 (São Paulo II, SP). DNA sequences were determined for some of the PCR products generated from ticks and dogs from populations 1-3, being all identical to each other and to available sequences of E. canis. These results reinforce previous studies that reported E. canis infecting dogs in Brazil, but report for the first time in Brazil the natural infection of E. canis in its vector, R. sanguineus, which is the commonest tick infesting dog in this country.

Master of Science / Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology / Roman Reddy Ganta / Ehrlichia chaffeensis a tick transmitted Anaplasmataceae family pathogen responsible for human monocytic ehrlichiosis. Differential gene expression appears to be an important pathogen adaptation mechanism for its survival in dual hosts. One of the ways to test this hypothesis is by performing mutational analysis that aids in altering the expression of genes. Mutagenesis is also a useful tool to study the effects of a gene function in an organism. Focus of my research has been to prepare several modified Himar transposon mutagenesis constructs for their value in introducing mutations in E. chaffeensis genome. While the work is in progress, research team from our group used existing Himar transposon mutagenesis plasmids and was able to create mutations in E. chaffeensis. Multiple mutations were identified by Southern blot analysis. I redirected my research efforts towards mapping the genomic insertion sites by performing the semi-random two step PCR (ST-PCR) method, followed by DNA sequence analysis. In this method, the first PCR is performed with genomic DNA as the template with a primer specific to the insertion segment and the second primer containing an anchored degenerate sequence segment. The product from the first PCR is used in the second PCR with nested transposon insertion primer and a primer designed to bind to the known sequence portion of degenerate primer segment. This method aided in identifying the genomic locations of four E. chaffeensis mutants and also was valuable in confirming four other sites mapped previously by the rescue cloning method. This is the first mutational analysis study in the genome of an Ehrlichia species. Mapping the genomic transposon insertion sites is the first critical step needed for the continued research to define the importance of the mutations in understanding the pathogenesis caused by the organism.

La Ehrlichiosis canina es una enfermedad causada por diversos microorganismos rickettsiales, principalmente Ehrlichia canis. Está reportada alrededor del mundo como una enfermedad zoonótica y en el Perú fue detectada en 1982. El diagnóstico clínico se basa en la detección de signos, tales como depresión, fiebre, anorexia, mucosas pálidas, pérdida de peso, linfadenopatía, hifema y eritema. En el laboratorio clínico, la hematología, bioquímica sanguínea, uroanálisis y pruebas serológicas son de gran utilidad en el diagnóstico definitivo. En el presente estudio se determinó el grado de concordancia entre el examen hematológico y la técnica indirecta de ELISA, ya que la relación entre ambas pruebas es desconocida en nuestro medio. 97 perros fueron obtenidos provenientes del Laboratorio de Patología Clínica en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se encontró un 84.67 ± 10.98% de grado de concordancia. Asimismo, se determinó que la trombocitopenia, leucopenia, anemia y el antecedente de garrapatas fueron estadísticamente significativos (P es menor que 0.05) en relación a la presencia de la enfermedad. El porcentaje de Ehrlichiosis canina en perros cruzados y de raza Pastor Alemán fue mayor en relación a las demás razas. Los perros de raza nórdica (Siberiano y Samoyedo) presentaron significancia estadística a padecer cuadros hemorrágicos por esta enfermedad. Finalmente, se encontró una concordancia alta entre ambas pruebas, estos resultados evidencian que en nuestro país la hematología es de gran importancia en el diagnóstico de la Ehrlichiosis canina, quedando la serología como prueba de apoyo en casos confusos. / --- Canine Ehrlichiosis is a disease caused by different rickettsial microorganisms, principally by Ehrlichia canis. It has been reported around the world like a zoonotic disease and in our country was detected in 1982. The clinic diagnosis is based in detection of signs like depression, fever, anorexia, pallor of mucous membranes, lost of weight, lymphadenophaty, hiphema and erythema. In Clinical Laboratory, the hematology, sanguineous biochemistry, urine-analysis and serologic tests are usefulness in definitive diagnosis. The present study determinated the concordance grade between the hematology test and indirect ELISA assay, because la relationship between both tests is unknown in our country. 97 dogs were obtained from the Clinical Pathology Laboratory in Veterinary Medicine Faculty of San Marcos National University. We are found 84.67 ± 10.98% of concordance grade. Likewise, was determinated that thrombocytopenia, leukopenia, anemia and tick contact antecedent were significant (P is less than 0.05) in relation with evidence of disease. The percent of cross-breed dogs and German Shepherd dogs (GSDs) with Canine Ehrlichiosis was higher than other breeds. The hemorrhage signs were statistic significance only in Nordic races (Siberian Husky and Samoyedo). Finally, we found a high concordance grade between both tests, this results reveal that hematology in our country is very important in the Canine Ehrlichiosis diagnostic and serology is a support test in confuse cases.

Ehrlichia chaffeensis es una bacteria intracelular obligatoria que pertenece a la familia Anaplasmataceae y es el agente causal de la Ehrlichiosis Monocítica Humana (EMH), una enfermedad con signos inespecíficos que se transmite en su mayoría mediante la mordedura de garrapatas de los géneros Amblyomma, Dermacentor y Rhipicephalus y mediante transfusiones sanguíneas de un individuo afectado a otro susceptible. En el presente estudio se detectó a través de PCR anidada, la frecuencia relativa de E. chaffeensis en propietarios de caninos domésticos con Ehrlichiosis. La toma de muestra se realizó en 20 distritos de la provincia de Lima y se encontraron muestras positivas en los distritos de Lurín, San Juan de Lurigancho, Comas, Chorrillos, Carabayllo y Ate, por lo que se concluye que E. chaffeensis está distribuida en pobladores de al menos seis distritos de la provincia de Lima. Se analizaron 60 muestras de sangre periférica y se encontraron diez positivos (10/60), lo que proporcionó una frecuencia relativa de 16.66%. El 80% (8/10) de las muestras positivas pertenecieron a individuos del sexo femenino y sólo el 20% (2/10) al sexo masculino. Palabras clave: Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichiosis Monocítica Humana, PCR, PCR anidada. / --- E. chaffeensis is an obligately intracelullar bacteria in the family Anaplasmataceae and is the agent of the Human Monocytic Ehrlichiosis (HME), a disease with unspecific symptoms that is mainly transmitted through tick bites of the genera Amblyomma, Dermacentor and Rhipicephalus, and through blood transfusions from an infected to a sensitive person. In this study we detected a relative frecuency of E. chaffeensis in owners of domestic canines with Ehrlichiosis using Nested PCR. The sampling was done in 20 districts of the province of Lima and we found positive samples in the districts of Lurín, San Juan de Lurigancho, Comas, Chorrillos, Carabayllo and Ate, so we came to the conclusion that E. chaffeensis is distributed in at least six districts of the province of Lima. We tested 60 peripheral blood samples and we found ten positive samples, this gives us a 16.66% relative frecuency. 80% (8/10) of the positive samples belonged to females and 20% (2/10) belonged to males. Key words: Ehrlichia chaffeensis, Human Monocytic Ehrlichiosis, PCR, Nested PCR.

El objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de seropositividad frente a Ehrlichia canis (E. canis) y Ehrlichia chaffeensis (E. chaffeensis) en médicos veterinarios o individuos que realizaban actividades veterinarias y que hayan estado en contacto con animales con Ehrlichiosis canina en el distrito de Lima Metropolitana, para lo cual se utilizó muestras de suero sanguíneo de 90 individuos con las características anteriormente mencionadas, 55 varones y 35 mujeres. Los 90 sueros fueron evaluados utilizando inmunofluorescencia indirecta (IFI), utilizando placas que contenían células DH82 (monocitos caninos) infectados con E. canis y E. chaffeensis además de sueros controles positivo y negativo. Se encontró que 21 (23.33 %) y 18 (20 %) sueros fueron positivos a E. canis y a E. chaffeensis, respectivamente. Además la seropositividad hallada para E. canis en hombres y mujeres fue de 21.8 % (12/55) y 25.7 % (9/35), respectivamente. Asimismo, la seropositividad hallada para E. chaffeensis en hombres y mujeres fue de 18.2 % (10/55) y 22.86 % (8/35), respectivamente; encontrando una ligera diferencia entre ambos, pero al igual que para E. canis, al realizar la prueba estadística Chi cuadrado, se llegó a determinar que no existe diferencia estadísticamente significativa, por lo tanto la seropositividad hallada es indistinta al sexo. Teniendo en cuenta que es una enfermedad zoonótica emergente y los resultados obtenidos, es recomendable iniciar estudios epidemiológicos y de vigilancia de la Ehrlichiosis en el Perú. Palabras claves: Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, inmunofluorescencia indirecta, humanos. / --- The goal of the present research was to determinate the presence of seropositivity of Ehrlichia canis (E. canis) and Ehrlichia chaffeensis (E. chaffeensis) in veterinaries or subjects involved in veterinary activities and had been exposed to animals with canine ehrlichiosis in Lima, to which it was used 90 samples of serum blood of subjects with the previous characteristics, 55 males and 35 females. The 90 serums were evaluated using indirect immunofluorescence (IIF) using plates with OH82 cells (canine monocites) infected with E. canis and E. chaffeensis, and positive and negative controls. It was found that 21 (23,33%) and 18 (20%) serums were positive to E. canis and E. chaffeensis, respectively. The seropositivity of E. canis in males and females was 21,8% (12/55) and 25.7% (9/35), respectively. Moreover, the seropositivity found for E. chaffeensis in men and women was 18,2 % (10/55) and 22,86% (8/35), respectively; founding a smooth difference between both, but the same as for E. canis, when using Chi square test, no statistic difference was found, therefore the seropositivity found is indistinct to sex. Having in consideration that ehrlichiosis is a emergent zoonotic disease and the results found, is advisable to begin epidemiologic and control researches of ehrlichiosis in Peru. Key words: Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, indirect immunofluorescence

Submitted by Marília Salgado Caxito null (mariliasalgado@ymail.com) on 2017-02-24T00:12:23Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO (MARÍLIA SALGADO CAXITO) - Defesa em 17-02-2017.pdf: 1916563 bytes, checksum: ad7825421c4deb080f61ac2ac7c94a42 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-03-06T13:44:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 caxito_ms_me_bot.pdf: 1916563 bytes, checksum: ad7825421c4deb080f61ac2ac7c94a42 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-06T13:44:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 caxito_ms_me_bot.pdf: 1916563 bytes, checksum: ad7825421c4deb080f61ac2ac7c94a42 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Ehrlichiose Monocítica Canina (EMC), causada por Ehrlichia canis, destaca-se dentre as hemoparasitoses de cães. A EMC causa doença multissistêmica e pode ser classificada em fase aguda, subclínica ou crônica. A fase crônica caracteriza-se por hipoplasia/aplasia medular e muitos cães vêm a óbito por falência medular, embora as causas da supressão medular ainda sejam indefinidas. Neste estudo, foi investigado se a fase crônica resulta de alterações medulares iniciadas na fase aguda. Em particular, verificar se, durante a fase aguda, células precursoras podem ser parasitadas por E. canis e se processos imunomediados podem ser responsáveis por alterações hematológicas durante o curso da doença. Dezoito cães com EMC na fase aguda foram submetidos a exames hematológicos (hemograma, bioquímica sérica e mielograma) e sorológicos. A presença de E. canis foi confirmada mediante PCR e cultivo celular. A citologia de medula óssea revelou alterações principalmente na série eritróide que comumente estão associadas a doenças imunomediadas, inclusive em animais não anêmicos. Também confirmou-se a presença de E. canis na medula óssea de 11/18 cães e certa tendência entre a positividade das amostras medulares e a série eritróide, embora sem significância estatística. Os títulos sorológicos de 2560 em 9/18 e 10240 nos demais confirmou a resposta humoral exacerbada descrita pela literatura, contudo também sem relação significativa com a presença de E. canis na medula e algumas variáveis medulares. Este estudo evidenciou a importância do mielograma na EMC, inclusive para predizer alterações hematológicas em cães com hemograma normal. / The Canine Monocytic Ehrlichiosis (CME), caused by Ehrlichia canis, one of the most frequent hemoparasites dogs. CME causes multisystemic disease and includes a acute, subclinical or chronic phase. The chronic phase is characterized by medullary hypoplasia/aplasia and many dogs die from bone marrow failure. However, the causes of medullary suppression remain unknow. In this study, we investigated whether the chronic phase can result from marrow changes initiated during the acute phase. In particular, we evaluated if precursor cells can be parasitized by E. canis during the acute phase and whether immune-mediated processes are responsible for hematological changes during the course of the disease. Eighteen dogs with CME in the acute phase were submitted to hematological (hemogram, serum biochemistry and myelogram) and serological tests. The presence of E. canis was confirmed by PCR and cell culture. Bone marrow cytology analyses mainly revealed changes in the erythroid series that are usually associated with immune-mediated diseases, including in non-anemic animals. This study confirmed the presence of E. canis in the bone marrow of the 11/18 dogs and a potential positive relation between the positivity of the marrow samples and the erythroid series was observed, although whithout statistical significance. The serological titers of 2560 in 9/18 and 10240 in the others confirmed an exacerbated humoral response to CME described in the literature, but they were not associated with the presence of E. canis in the bone marrow and medullary alterations. This study evidenced the importance of the myelogram, as well predicting hematological alterations in dogs with normal hemogram.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-10-19T18:19:28Z No. of bitstreams: 1 2013 - Andresa Guimar?es.pdf: 1221110 bytes, checksum: 80ca8363650edbb042caea761cb85083 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-19T18:19:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013 - Andresa Guimar?es.pdf: 1221110 bytes, checksum: 80ca8363650edbb042caea761cb85083 (MD5) Previous issue date: 2013-08-21 / CAPES / CNPq / Studies of domestic cats are little discussed in Brazil, especially regarding hemoparasita research where cats can be carriers of the agent and contribute to infection of man. Anaplasmataceae agents are gram-negative bacteria found in leukocytes and platelets, in which morulae characteristic of the infection is observed. The transmission of these agents to humans and animals occurs by arthropod vectors. Sorologic diagnostic methods are emphasized, but recent studies using molecular techniques demonstrate greater sensitivity and specificity, with better characterization of the agent. The present study aims to diagnose domestic cats in Rio de Janeiro naturally infected by agents Anaplasmataceae (Ehrlichia sp., and Anaplasma sp.) by serological and molecular methods, as well as evaluate hematological changes associated with these infections to guide veterinarians in the diagnosis of these diseases. Samples of 216 animals from clinics located in cities in the metropolitan region of Rio de Janeiro were used. The research of antibodies IgG anti-E. canis was performed by Immunofluorescence Assay (IFAT) and molecular detection of Ehrlichia sp. by nested Polymerase Chain Reaction (PCR) based on 16S rRNA gene. The results demostrate that 18 (8.3%) animals were positive in the direct detection by blood smear, 57 (26.4%) seropositive and 37 (17.1%) positive by nested-PCR for Ehrlichia sp., being 91 (42.1%) positive in at least one technique. The diagnosis of A. platys was performed by real-time PCR (qPCR) and nested-PCR based on 16S rRNA and gltA genes, respectively. Seventeen animals (7.9%) showed inclusions in platelet, eight (3.7%) were positive in qPCR, two (0,9%) in nested-PCR and 23 (10.6%) cats were considered positive for A. platys in at least one technique. The detection of A. phagocytophilum was performed by qPCR based on gene msp2, however, positive animals were not observed. The most common hematologic findings in animals positive for agents Anaplasmataceae were thrombocytopenia, leukocytosis, neutrophilia, regenerative left shift, anemia and hyperproteinemia. Only one animal showed co-positivity for both agents. Regarding the associated factor, only age interfered with positivity for Ehrlichia sp., in wich younger IFAT positive animals were less prone to infection, unlike that observed in the nested-PCR in which the younger had higher positivity. Only two positive samples in the nested-PCR for E. canis were subjected to sequencing. One sequence demonstrated 100% similarity with isolates of Ehrlichia sp. and E. canis and another showed 99% similarity with isolates of Ehrlichia sp. ocelot and Ehrlichia sp. little-spotted-cat. The two positive samples in the nested-PCR for A. platys demonstrated 100% similarity with isolates of A. platys reported in advanced. The present work demonstrates the circulation of agents Anaplasmataceae in domestic cats in Rio de Janeiro. / Estudos com felinos dom?sticos s?o pouco abordados no Brasil, principalmente em rela??o ? pesquisa de hemoparasitoses, em que os gatos podem ser portadores do agente e contribuir para infec??o do homem. Os agentes Anaplasmataceae s?o bact?rias gram-negativas que s?o encontradas em leuc?citos, plaquetas ou eritr?citos, formando m?rulas, caracter?sticas de sua infec??o. A transmiss?o desses agentes para o homem e animais ocorre principalmente por vetores artr?podes. Como m?todo diagn?stico ressalta-se a sorologia, por?m estudos recentes utilizando diagn?stico molecular demonstram maior sensibilidade e especificidade, com melhor caracteriza??o do agente. O presente estudo tem como objetivo diagnosticar felinos dom?sticos do Rio de Janeiro infectados naturalmente por agentes Anaplasmataceae (Ehrlichia sp. e Anaplasma sp.) por meio de m?todos sorol?gico e molecular, bem como avaliar as altera??es hematol?gicas associadas a estas infec??es. Foram utilizadas amostras de 216 animais, provenientes de cl?nicas localizadas em cidades da Regi?o Metropolitana do Rio de Janeiro. A pesquisa de anticorpos IgG anti-E. canis foi realizada pela Rea??o de Imunofluoresc?ncia Indireta (RIFI) e a detec??o molecular de Ehrlichia sp., pela nested Rea??o em Cadeia da Polimerase (nested-PCR) baseada no gene 16s rRNA. Os resultados demonstraram que 18 (8,3%) animais foram positivos na detec??o direta pelo esfrega?o sangu?neo, 57 (26,4%) soropositivos e 37 (17,1%) positivos na nested-PCR para Ehrlichia sp., sendo 91 (42,1%) considerados positivos para Ehrlichia sp. em pelo menos uma t?cnica. O diagn?stico de A. platys foi efetuado pela PCR em tempo real (qPCR) e nested-PCR baseada nos genes gltA e 16S rRNA, respectivamente. Dezessete animais (7,9%) apresentaram inclus?es em plaquetas, oito (3,7%) foram positivos na qPCR, dois (0,9%) na nested-PCR e 23 (10,6%) animais foram considerados positivos para A. platys em pelo menos uma t?cnica. A pesquisa de A. phagocytophilum foi realizada por meio da qPCR baseada no gene msp2; no entanto, n?o foram observados animais positivos. Os achados hematol?gicos mais frequentes nos animais positivos para agentes Anaplasmataceae foram trombocitopenia, leucocitose, neutrofilia, desvio ? esquerda regenerativo, anemia e hiperproteinemia. Apenas um animal apresentou co-positividade para ambos os agentes. Em rela??o aos dados associados, somente a idade interferiu na positividade para Ehrlichia sp., sendo na RIFI os animais mais jovens menos predispostos ? infec??o, ao contr?rio do observado na nested-PCR em que os mais jovens apresentaram maior ?ndice de positividade. Apenas duas amostras positivas na nested-PCR para E. canis foram submetidas ao sequenciamento, sendo que uma sequ?ncia apresentou 100% de similaridade com isolados de Ehrlichia sp. e E. canis e a outra demonstrou 99% de similaridade com isolados de Ehrlichia sp. ocelot e Ehrlichia sp. little-spotted-cat. As duas amostras positivas na nested-PCR para A. platys apresentaram 100% de similaridade com isolados de A. platys previamente descritos. O presente trabalho demonstra, portanto, a ocorr?ncia de agentes Anaplasmataceae na popula??o de felinos dom?sticos do Rio de Janeiro.

La Ehrlichiosis canina es una enfermedad causada por diversos microorganismos rickettsiales, principalmente Ehrlichia canis. Está reportada alrededor del mundo como una enfermedad zoonótica y en el Perú fue detectada en 1982. El diagnóstico clínico se basa en la detección de signos, tales como depresión, fiebre, anorexia, mucosas pálidas, pérdida de peso, linfadenopatía, hifema y eritema. En el laboratorio clínico, la hematología, bioquímica sanguínea, uroanálisis y pruebas serológicas son de gran utilidad en el diagnóstico definitivo. En el presente estudio se determinó el grado de concordancia entre el examen hematológico y la técnica indirecta de ELISA, ya que la relación entre ambas pruebas es desconocida en nuestro medio. 97 perros fueron obtenidos provenientes del Laboratorio de Patología Clínica en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se encontró un 84.67 ± 10.98% de grado de concordancia. Asimismo, se determinó que la trombocitopenia, leucopenia, anemia y el antecedente de garrapatas fueron estadísticamente significativos (P es menor que 0.05) en relación a la presencia de la enfermedad. El porcentaje de Ehrlichiosis canina en perros cruzados y de raza Pastor Alemán fue mayor en relación a las demás razas. Los perros de raza nórdica (Siberiano y Samoyedo) presentaron significancia estadística a padecer cuadros hemorrágicos por esta enfermedad. Finalmente, se encontró una concordancia alta entre ambas pruebas, estos resultados evidencian que en nuestro país la hematología es de gran importancia en el diagnóstico de la Ehrlichiosis canina, quedando la serología como prueba de apoyo en casos confusos. / Canine Ehrlichiosis is a disease caused by different rickettsial microorganisms, principally by Ehrlichia canis. It has been reported around the world like a zoonotic disease and in our country was detected in 1982. The clinic diagnosis is based in detection of signs like depression, fever, anorexia, pallor of mucous membranes, lost of weight, lymphadenophaty, hiphema and erythema. In Clinical Laboratory, the hematology, sanguineous biochemistry, urine-analysis and serologic tests are usefulness in definitive diagnosis. The present study determinated the concordance grade between the hematology test and indirect ELISA assay, because la relationship between both tests is unknown in our country. 97 dogs were obtained from the Clinical Pathology Laboratory in Veterinary Medicine Faculty of San Marcos National University. We are found 84.67 ± 10.98% of concordance grade. Likewise, was determinated that thrombocytopenia, leukopenia, anemia and tick contact antecedent were significant (P is less than 0.05) in relation with evidence of disease. The percent of cross-breed dogs and German Shepherd dogs (GSDs) with Canine Ehrlichiosis was higher than other breeds. The hemorrhage signs were statistic significance only in Nordic races (Siberian Husky and Samoyedo). Finally, we found a high concordance grade between both tests, this results reveal that hematology in our country is very important in the Canine Ehrlichiosis diagnostic and serology is a support test in confuse cases.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv. / Härtill 5 uppsatser.