CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / This study aimed to evaluate rainy and dry season effect on plasma seminal composition and semen quality of 17 crossbred male goats raised in tropical region and to investigate if the biochemical composition of seminal plasma (SP) is correlated to semen quality in relation to the season of the year. Other objective of this experiment was to evaluate if the phospholipase A2 (PLA2) activity level in the SP affects the ejaculate and epididymal spermatozoa. This study was divided into three experiments: in the first phase, seventeen male goats were used and then eight animals with low or high PLA2 activity in SP were separated to the second and third phases. In the first experiment, the ejaculates were collected in artificial vagina, weekly, the SP was separated to evaluate the biochemical parameters and biweekly for quality semen determination. The sperm was diluted in coconut water added 2,5% of egg yolk (200 x 106 sperm/mL) and stored at 4 oC for 48 hours. The vigor (0-5) and motility (1-100%) were measured at 2, 24 and 48 hours after cooling by thermoresistance test (TRT). Slides of sperm were made during TRT and 200 cells were classified as normal or abnormal cellular morphology. The fructose, citric acid, total proteins, calcium, phosphorus, magnesium level and the PLA2 activity level in the SP were measured. In the second experiment, eight bucks were separated in two groups according to PLA2 activity level in SP, in group I (<6.7U/mL) and group II (> 11.0 U/mL). The semen was obtained by artificial vagina, diluted and separate in two samples: the first aliquot was the control treatment (nonwashed semen) and the second aliquot was centrifuged at 550 g for 10 minutes to remove the SP (washed semen). In the third experiment, the semen of the eight bucks was collected and the SP obtained by centrifugation. The SP of each buck was added to aliquots of epididymal spermatozoa pool collected from another male goat and a ninth aliquot was added only to diluent (control). After that, the final dilution (200 x 106 sperm/mL) was made in all samples. In the second and third experiments, after the treatment and final dilution, the semen samples were stored at 4 oC for 48 hours and an aliquot was incubated at 38 oC and evaluated to vigor and motility at 0, 2, 12, 24 and 48 hours of cooling. Slides of sperm were made during TRT and 200 cells were classified as normal or abnormal morphology. In all experiments, the semen quality decreased with time (p<0,001). In the first experiment, the semen obtained in the rainy season was better quality than semen collected in the dry season of the year. In addition, the fructose, citric acid, total proteins, phosphorus and magnesium levels in the SP were higher in rainy season, while the PLA2 activity was lower in this period. The fructose, citric acid and total proteins concentration showed positive correlations to vigor and motility in both seasons. The total sperm morphology alterations (TSMA) showed negative correlation with fructose level and positive correlations with citric acid, total proteins concentrations and PLA2 activity level. In the second experiment, the treatment (washed semen) improved the seminal quality, mainly in washed semen of the group I. The PLA2 activity level showed no effect on sperm performance in the ejaculate spermatozoa, except at 48h in washed semen and at 24h in the non-washed semen. Finally, in the third experiment, the SP addition on epididymal spermatozoa decreased the seminal parameters and this effect was higher in group II. However, the TSMA were lower when the PLA2 activity was higher. These results indicated that male goats raised in tropical region showed better seminal quality in the rainy season. In addition, the fructose, citric acid, total proteins, phosphorus and magnesium concentration levels in the SP were higher in rainy season, while the PLA2 activity was lower in this period. The correlations between the seminal and biochemical parameters in SP could indicate that the differences in the semen parameters in the rainy and dry season occurred due the biochemical parameter variations. The SP addition during the semen storage at 4 oC decreased the seminal quality. However the PLA2 activity level was not a determinant factor of the seminal quality in the ejaculate spermatozoa. Therefore, it cannot be used as an indicative of the spermatic quality of male goats raised in tropical region / Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da Ãpoca chuvosa e seca do ano sobre a composiÃÃo do plasma seminal (PS) e os parÃmetros seminais de 17 caprinos sem padrÃo racial definido (SPRD), criados em clima tropical, alÃm de avaliar se a composiÃÃo bioquÃmica do PS apresenta correlaÃÃo com os parÃmetros seminais, em funÃÃo da Ãpoca do ano, assim como, investigar se o nÃvel de atividade da fosfolipase A2 (FLA2) no PS de caprinos pode ser utilizado como indicativo da qualidade espermÃtica e se esse nÃvel exerce influÃncia na preservaÃÃo dos espermatozÃides ejaculados e epididimÃrios quando conservados a 4 ÂC, por 48 horas. O estudo foi realizado em trÃs etapas: na primeira foram utilizados dezessete machos caprinos e a partir desta, oito bodes com diferentes nÃveis de atividade de FLA2 no PS foram selecionados para realizaÃÃo da segunda e terceira etapas. No primeiro experimento durante a Ãpoca chuvosa e seca, os ejaculados dos animais foram coletados semanalmente, em vagina artificial, para avaliaÃÃo bioquÃmica do PS e a cada 14 dias para determinaÃÃo dos parÃmetros seminais. O sÃmen foi diluÃdo em Ãgua de coco-2,5% gema (200 x 106 sptz/mL), resfriado a 4 ÂC por 48 horas e avaliado o vigor e a motilidade Ãs 2, 24 e 48 horas de resfriamento (T2, T24 e T48), pelo teste de termorresistÃncia lento (TTR). EsfregaÃos do sÃmen diluÃdo foram confeccionados durante o TTR e 200 cÃlulas foram avaliadas e classificadas morfologicamente em normais ou anormais. Determinaram-se ainda as concentraÃÃes de frutose, Ãcido cÃtrico, proteÃnas totais, Ca, P, MG e nÃvel de atividade da FLA2. No segundo experimento, oito caprinos divididos, em funÃÃo do nÃvel de atividade da FLA2 no PS em: grupo I (<6,70 U/mL) e o grupo II (>11,00 U/mL). O sÃmen foi coletado, diluÃdo e dividido em duas alÃquota : a primeira constituiu o tratamento controle (sÃmen nÃo lavado) e a segunda foi centrifugada para remoÃÃo do PS (sÃmen lavado). No terceiro experimento, o sÃmen dos oito animais foi coletado e centrifugado para recuperaÃÃo do PS e adicionados a alÃquotas de um Ãnico âpoolâ de espermatozÃides epididimÃrios obtidos de caprinos castrados cirurgicamente. Uma nona alÃquota foi adicionada apenas de diluidor (grupo controle). Em seguida, procedeu-se a diluiÃÃo final em todas as amostras utilizando o mesmo diluidor. No segundo e terceiro experimentos, apÃs a realizaÃÃo dos tratamentos e diluiÃÃo final, o sÃmen foi resfriado a 4 ÂC por atà 48 horas e amostra de cada tratamento foi avaliada pelo TTR Ãs 0 (fresco), 2, 12, 24 e 48 horas de resfriamento. EsfregaÃos do sÃmen foram confeccionados para avaliaÃÃo da morfologia espermÃtica. Em todos os experimentos, a qualidade espermÃtica diminuiu à medida que se prolongou o tempo de preservaÃÃo (p < 0,001). No experimento 1, o sÃmen apresentou qualidade superior na Ãpoca chuvosa e tambÃm as concentraÃÃes de frutose, Ãcido cÃtrico, proteÃnas totais, P e Mg foram maiores nesta Ãpoca. A FLA2 apresentou menor atividade na Ãpoca chuvosa (p < 0,05). A concentraÃÃo de frutose, Ãcido cÃtrico e proteÃnas totais mostraram correlaÃÃes positivas com o vigor e a motilidade e negativas com a TDM, nas duas Ãpocas. Em relaÃÃo Ãs alteraÃÃes morfolÃgicas totais (AMT), a concentraÃÃo de frutose mostrou correlaÃÃes negativas, enquanto as de Ãcido cÃtrico, proteÃnas totais e atividade da FLA2, positivas. Os nÃveis de fÃsforo no PS apresentaram correlaÃÃo com os parÃmetros seminais apenas na Ãpoca seca, sendo negativa para vigor, motilidade e AMT e positiva para TDM. A concentraÃÃo de Mg correlacionou-se positivamente com a motilidade na Ãpoca chuvosa e AMT na seca. No segundo experimento, o tratamento influenciou a qualidade seminal principalmente no grupo I, sendo o desempenho espermÃtico superior no sÃmen lavado. O nÃvel de atividade da FLA2 nÃo afetou a qualidade dos espermatozÃides ejaculados, exceto em T48 do sÃmen lavado e T24 do sÃmen nÃo lavado. Enquanto no terceiro experimento, a adiÃÃo do PS aos espermatozÃides epididimÃrios diminuiu a qualidade espermÃtica e este efeito foi mais pronunciado quando o nÃvel de atividade de FLA2 foi maior. Contudo, no que se refere e AMT, a adiÃÃo do PS foi benÃfica, reduzindo o nÃmero de alteraÃÃes. Os resultados do presente estudo indicam que caprinos criados em clima tropical apresentam melhor qualidade espermÃtica no perÃodo chuvoso, alÃm das concentraÃÃes de frutose, acido cÃtrico, proteÃnas totais, P e Mg serem mais elevados nesta Ãpoca, enquanto a atividade da FLA2 foi menor neste perÃodo. As correlaÃÃes entre os parÃmetros seminais e a composiÃÃo bioquÃmica do PS podem indicar que as diferenÃas detectadas quanto à qualidade espermÃtica entre as Ãpocas do ano deve-se justamente Ãs variaÃÃes na concentraÃÃo destes componentes. A presenÃa do PS durante a conservaÃÃo do sÃmen caprino a 4 ÂC reduziu a qualidade espermÃtica, contudo o nÃvel de atividade da FLA2 nÃo foi um fator determinante da qualidade seminal para os espermatozÃides ejaculados, por isso, nÃo deve ser utilizado como indicativo de qualidade espermÃtica de caprinos criados em regiÃo de clima tropical

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The seminal plasma is particularly important in sperm protection against damage caused by reactive oxygen species (ROS). The paraoxonase type 1 (PON1) is a multi-enzymatic complex with antioxidant properties, preventing the increase of ROS quantities, thus protects cell membranes and neutralizes the effects of lipid oxidation. The objective of this study was to correlate the influence of PON1 activity with the CASA system parameters and sperm viability (membrane integrity acrosome integrity, functionality of mitochondria and DNA fragmentation) of swine semen in natura, and investigate the PON1 expression (mRNA) in testicle and epididymis (head, body and tail) tissue of boars. The sperm fraction (FE) presented the major PON1 activity and males 81, 80 and 79 (P<0.05) showed the highest enzyme activity. But, when comparing the differences between the ejaculate samples, our study showed differences (P<0.05) between males 81 and 92 in FE and sperm post fraction (PF). However, when the ejaculated was diluted (1:1), it has presented 44% average reduction in the activity of PON1. The activity of PON1 in FE showed positive correlation with sperm concentration, curvaceous distance, curvy velocity and DNA integrity (P<0.05), and also showed negative correlation with straightness and linearity parameters advised by the CASA system. The mRNA expression was observed only in the body portion of the epididymis. The FE is the part of the ejaculate that more PON1 activity and presented the parameters DCL, VCL, STR and LIN, together, with concentration and sperm viability (integrity of DNA) are those who showed the greatest association with the enzyme. Already the PON1 was only expressed (Mrna) in the body of epididymis pig breeder. / O plasma seminal é particularmente importante na proteção do espermatozoide contra os danos causados pelas espécies reativas ao oxigênio (EROs). A paraoxonase tipo 1 (PON1) é um complexo multienzimático com propriedades antioxidantes, impedindo o aumento da quantidade de EROs, o que confere proteção às membranas celulares e neutraliza os efeitos da oxidação lipídica. O estudo objetivou correlacionar a influência da atividade de PON1 com os parâmetros de avaliação do sistema Computer Assisted Semen Analysis (CASA) e a viabilidade espermática (integridade de membrana, integridade de acrossoma, funcionalidade de mitocôndria e fragmentação do DNA) do sêmen suíno in natura e investigar a expressão da PON1 (RNAm) no tecido do testículo e epidídimo (cabeça, corpo e cauda) do reprodutor suíno adulto. A fração espermática (FE) apresentou a maior atividade de PON1 e os machos 81, 80 e 79 (P<0,05) apresentaram a maior atividade de PON1. Já em relação a comparação entre as diferentes amostras do ejaculado, nosso estudo demonstrou diferenças (P<0,05) nos machos 81 e 92 em relação a FE e a fração pós-espermática (FP). Entretanto, quando o ejaculado foi diluído (1:1) apresentou redução média de 44% na atividade da PON1. A atividade de PON1 na FE apresentou uma correlação positiva com a concentração espermática, DCL, VCL e IDNA (P<0,05) e apresentou correlação negativa para os parâmetros de STR e LIN assessorados pelo sistema CASA. A expressão de RNAm somente foi observada para a porção do corpo do epidídimo. A FE é a parte do ejaculado que mais apresentou atividade da PON1 e os parâmetros DCL, VCL, STR e LIN, juntamente, com concentração e viabilidade espermática (integridade de DNA) são os que apresentaram a maior associação com a enzima. Já a PON1 foi somente expressa (RNAm) no corpo de epidídimo do reprodutor suíno.

Submitted by RODRIGO DOS SANTOS ALBUQUERQUE null (rdsa20@gmail.com) on 2016-09-19T19:21:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de mestrado Rodrigo Albuquerque.pdf: 1101110 bytes, checksum: 06cce8f64ce03aadf0ced70da5dcfcab (MD5) / Rejected by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 12 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 12 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Se optar por disponibilizar o texto completo de seu trabalho imediatamente selecione no campo “Data para a disponibilização do texto completo” a opção “Não se aplica (texto completo)”. Isso fará com que seu trabalho seja disponibilizado na íntegra no Repositório Institucional UNESP. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2016-09-22T17:06:43Z (GMT) / Submitted by RODRIGO DOS SANTOS ALBUQUERQUE null (rdsa20@gmail.com) on 2016-09-22T17:53:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de mestrado Rodrigo Albuquerque.pdf: 1101110 bytes, checksum: 06cce8f64ce03aadf0ced70da5dcfcab (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-09-27T12:31:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 albuquerque_rs_me_jabo.pdf: 1101110 bytes, checksum: 06cce8f64ce03aadf0ced70da5dcfcab (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T12:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 albuquerque_rs_me_jabo.pdf: 1101110 bytes, checksum: 06cce8f64ce03aadf0ced70da5dcfcab (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / A criopreservação provoca injúrias aos espermatozoides e necessita de métodos que minimizem esses danos. Embora seja bastante discutida, a remoção do plasma seminal tornou-se uma alternativa para melhorar a qualidade e viabilidade espermática após a congelação e vem sendo utilizada em outras espécies na tentativa de obter bons resultados. O objetivo deste estudo foi comparar a remoção do plasma seminal de bubalinos tanto por filtragem (SpermFilter®) quanto por centrifugação sobre a qualidade do sêmen descongelado de búfalos. Foram utilizados sete touros da raça Murrah, os quais foram submetidos à colheita de sêmen por vagina artificial uma vez por semana. Os ejaculados foram diluídos com Botu-Bov® e fracionados em alíquotas para confrontar três técnicas antes da congelação: grupo C (Criopreservação convencional com plasma seminal), grupo CE (Criopreservação removendo o plasma seminal por centrifugação) e grupo F (Criopreservação removendo o plasma seminal por filtragem). O sêmen fresco foi analisado quanto ao volume, aspecto, cor, concentração (câmara de Neubauer), turbilhonamento, motilidade progressiva, vigor e morfologia espermática. No sêmen descongelado, foram avaliados a cinética espermática pelo CASA, a integridade de membrana plasmática, acrossoma, potencial de membrana mitocondrial e quantificação de EROs por citometria de fluxo e, adicionalmente, foi estimado o grau de peroxidação lipídica pela técnica de TBARS. Os resultados revelam que a remoção de plasma seminal não proporcionou aumento da velocidade espermática, alteração no potencial de membrana mitocondrial e nem modificou o grau de peroxidação lipídica. Entretanto, a presença do plasma seminal (grupo controle) e a centrifugação provocou maiores índices de lesões na membrana plasmática, quando estas apresentam o acrossoma intacto (47,88±1,99% vs. 41,30±1,96%, respectivamente) em comparação ao grupo F (40,45±2,01%; p<0,07). A lesão em ambas as membranas (acrossomal e plasmática) foi mais evidente na filtragem (22,18±1,07) em relação ao grupo controle (15,23±1,06), sendo que a centrifugação não diferiu entre os grupos (17,43±1,04; p<0,01). A EROs foi mais evidente no grupo CE (56,68±4,53%) em relação ao grupo C e F (21,83±4,60% vs. 20,96±4,7%, respectivamente; p<0,01). Portanto, as hipóteses de que a remoção de plasma seminal melhoram a cinética espermática e proporcionam menores índices de lesões na membrana plasmática não foram confirmadas. Embora a filtragem tenha apresentado vantagem sobre a centrifugação gerando menor quantidade de EROs, não se justifica a remoção do plasma seminal em búfalos devido aos resultados serem muito semelhantes ao grupo controle. / Cryopreservation promotes injury to sperm and methods to minimize such damage are necessary. Although much discussed, removal of seminal plasma that has been successfully used in other species has become an alternative for improving sperm quality and viability after freezing. The aim of the present study was compare to removal seminal plasma in buffalo both by filtering (SpermFilter®) and by centrifugation on the quality frozen thawed buffalo semen. For this purpose, semen of seven Murrah buffalo-bulls, which were submitted to semen collection by artificial vagina once a week. The samples were diluted with Botu-Bov® and were fractionated in aliquots to confront three techniques before freezing: C group (conventional cryopreservation with seminal plasma), CE group (cryopreservation removing the seminal plasma centrifuge) F group (Cryopreservation removing the seminal plasma with Sperm Filter®). Fresh semen was analyzed for volume, appearance, color, concentration (Neubauer chamber), gross motility, progressive motility, vigor and sperm morphology. In the thawed sperm, sperm kinetics was evaluated by CASA, plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and estimation of the levels of reactive oxygen species were assigned by flow cytometry and was estimated degree of lipid peroxidation by TBARS technique. The results show that the removal seminal plasma did not improve sperm kinetics, mitochondrial membrane potential and does not modify the degree of lipid peroxidation.However, the presence of seminal plasma (control group) and centrifugation resulted in higher rates of injury to the plasma membrane, where they have an intact acrosome (47,88±1,99% vs. 41,30±1,96%, respectively) compared to F group (40,45±2,01%; p<0.07). The damage in both membranes (acrosome and plasma) was more evident in filtering (22,18±1,07) compared to the control group (15,23±1,06), and centrifugation did not differ between groups (17,43±1,04; p<0.01). ROS production was more evident in the CE group (56,68±4,53%) compared to the C and F group (21.83±4.60% vs. 20.96±4.7%, respectively; p<0.01). Therefore, removal seminal plasmais not beneficial to sperm, as did not alter the sperm kinetics nor provided lower lesions rates in the plasma membrane, although the filter has presented advantage over centrifugation as generated lower amount of ROS, not justifies the use bothtechnique because the results are very similar to those with seminal plasma. / FUNDUNESP: 2523-002-14