Ce travail étudie le potentiel de l'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse à ionisation par plasma (ICP/MS) pour le criblage d'une bibliothèque de ligands en fonction de leur affinité pour l'europium en milieu hydro-organique. Cette méthode permet, d'une part, d'évaluer l'affinité des ligands phosphorés en moins de deux heures et en utilisant moins de 15 ng de ligand, et d'autre part, de déterminer les constantes de complexation. Les résultats sont en accord avec ceux obtenus par titrage spectrophotométrique.Parallèlement, une bibliothèque de copolymères pour l'extraction solide/liquide de l'europium a été étudiée. Le protocole d'extraction mis au point permet de les classer selon leur affinité pour celui-ci en milieu hydro-organique et en utilisant 60 mg de copolymère. Pour les plus prometteurs, les propriétés de reconnaissance et la sélectivité La3+/Eu3+/Lu3+ ont été évaluées. / This work investigates the potential of hyphenated capillary electrophoresis and inductively coupled mass spectrometry to classify different ligands according to their europium binding affinity in a hydro-organic medium. On the one hand, this method enables to evaluate the affinity of phosphorus-containing ligands in less than two hours and using less than 15 ng of ligand. On the other hand, complexation constants could be determined. The results are in excellent agreement with the values obtained by spectrophotometric titrations.Moreover, a library of copolymers for solid/liquid extraction of europium is investigated. The extraction protocol enables to classify copolymers according to their europium affinity in a hydro-organic medium. This screening requires 60 mg of copolymers. For the most promising recognition properties and selectivity La3+/Eu3+/Lu3+ are evaluated.

In the first part of this work, magnetized nanoporous silica based microparticles (MMPs) are used for horseradish peroxidase (HRP) immobilization and applied in amperometric peroxidase-based biosensors. A homemade magnetized carbon paste electrode permits the MMPs attraction close to the electrode surface. The resulting original biosensor is applied to the investigation of enzymatic oxidation of model drug compounds namely, clozapine (CLZ) and acetaminophen (APAP) by HRP in the presence of hydrogen peroxide. The biosensor operates at a low applied potential and the signal corresponds to the electro-reduction of electroactive species enzymatically generated. The biosensor allows performing the quantitation of the two drug compounds in the micromolar concentration range. It allows also the study of thiol compounds based on the inhibition of the biosensor response. Interestingly, distinct inhibition results are observed for HRP entrapped in the silica microparticles compared to the soluble HRP.<p>We expect that this type of biosensors holds high promise in quantitative analysis and in biotransformation studies of drug compounds.<p><p>In the second part of this thesis work, HRP immobilized magnetic nanoparticles are injected on-line and magnetically retained, as a microreactor, in the capillary of a CE setup. The purpose of such a configuration is to develop an analytical tool for studying “in vitro” drug biotransformation. The advantages expected are (i) minimum sample (drug compound) and biocomponent (enzyme) consumption, (ii) high analysis throughput, (iii) selectivity and sensitivity. In order to illustrate the potential of such an instrumental configuration, it has been applied to study acetaminophen as model drug compound. The mechanistic information obtained by the HRP/H2O2 system is in agreement with literature data on acetaminophen metabolization. Horseradish peroxidase kinetic studies are realized by this setup and the apparent Michaelis constant is determined. Capillary electrophoresis permitted the identification of APAP off-line biotransformed products such as N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI), the APAP dimer and APAP polymers as inferred from literature data. The formation of the APAP dimer was further confirmed by electrospray ionization mass spectrometry.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La détection et l’identification des protéines sur gel d’électrophorèse dépend aussi bien du marqueur des protéines utilisés (généralement un marqueur fluorescent) que de ses propriétés physicochimiques propres (rendement quantique, Stokes’ shift et recouvrement des bandes d’absorption et d’émission, photoblanchiment), de sa stabilité (chimique et photochimique), et de son accessibilité. Créer une gamme de nouveaux fluorophores dont les propriétés physicochimiques peuvent être modulées en partant d’une structure bien connue et très avantageux dans l’optique d’anticiper les caractéristiques supposées des composées envisagés. Cependant, même si de nombreux fluorophores sont disponibles commercialement, ils souffrent généralement de différentes contraintes telles que leurs prix prohibitifs, leur manque de sensibilité, leur stockes’ shift trop faible ou bien encore leur stabilité. L’accès à une famille de fluorophores résolvant l’ensemble de ces contraintes pour la détection de protéines sur gel d’électrophorèse représenterait donc un réel défi. L’épicocconone, isolée du champignon Epicoccocum Nigrum, se lie de façon covalente aux amines (et donc également aux protéines) en conduisant à un adduit énaminique qui est très fluorescent. Cet adduit émet dans le rouge (610 nm) lorsqu’irradié dans l’UV (395 nm) ou le visible (520 nm). Ces propriétés ont donc conduit à l’utilisation de ce produit naturel comme marqueur fluorescent de protéines sur gel d’électrophorèse menant à une sensibilité de détection rarement atteinte et à une gamme de linéarité très importante (104). La première synthèse de l’épicocconone a alors été engagée au sein de notre laboratoire. Elle a finalement conduit à une chimiothèque d’analogues encore plus efficace ayant permis d’établir une véritable relation structure-fluorescence. / Detection and identification of proteins either in 2D electrophoresis gels or in biological media depends largely on the quality of protein sensitive dye used (generally a fluorescent dye) as well on the efficiency of their fluorescent properties (quantum yield, Stokes’ shift and overlap of excitation frequency with common laser sources), their stability (chemical and photophysical) and their accessibility. To be able to create a range of new fluorescent dyes whose profiles can be modulated starting from a proven scaffold is advantageous in terms of predicting the properties of the final products. Even if many fluorescent dyes are available on the market, they suffer from a prohibitive price, a lack of sensitivity or a restricted wavelength range (absorption/emission) or limited stability. Access to a family of fluorophores displaying similar physicochemical properties, but shifted excitation and emission wavelengths constitutes an invaluable tool Epicocconone, isolated from the fungus Epicoccum nigrum, covalently binds to primary amines (e.g. lysine of proteins), leading to a protein linked conjugate which is strongly fluorescent, emitting light in the red (610 nm) when submitted to UV-visible light (395 or 520 nm). This is a novel pro-fluorophore that allows protein quantification with unprecedented sensitivity and with an excellent linearity on a broad range of concentrations. A program of synthesis of epicocconone and analogues in order to provide a library of complementary fluorophores has been undertaken. The results concerning either the better efficiency of the analogs and the structure-fluorescence relation are presented in this dissertation.

Les régions terminales (les télomères) des chromosomes de la plupart des organismes sont<br />essentielles au maintien de l'intégrité des chromosomes et sont impliquées dans la cancérogenèse et<br />le vieillissement cellulaire. Les télomères sont formés d'un brin riche en guanines et d'un brin<br />complémentaire riche en cytosines. In vitro, chaque brin s'organise en une structure repliée, le<br />quadruplexe de guanines pour l'un, le motif i pour l'autre, ce qui pose la question du rôle<br />biologique de ces structures. Plusieurs protéines s'associant au brin G et favorisant la formation de<br />quadruplexes de guanines sont connues. Deux protéines reconnaissant spécifiquement le brin C de<br />l'ADN télomérique humain viennent d'être identifiées (ASF/SF2 et hnRNP K).<br />Nous avons voulu contribuer à la compréhension des mécanismes de régulation des<br />télomères en recherchant une protéine se liant spécifiquement à une séquence d'ADN télomérique<br />riche en cytosines. Cette étude a été entreprise sur un organisme eucaryote, la levure<br />Saccharomyces cerevisiae.<br />Nous avons commencé par montrer que le fragment d'ADN télomérique de levure,<br />d[(CCCACA)3CCC], pouvait former un motif i in vitro. Nous avons observé par migration<br />électrophorétique non dénaturante, la formation d'un complexe ADN-protéine sur lequel nous<br />avons focalisé nos efforts. La masse moléculaire de cette protéine (~ 250 kDa) a été déterminée par<br />passage sur tamis moléculaire. L'association ADN-protéine a été observée pour une gamme de pH<br />allant de 6 à 8. Un duplexe d'ADN B d(CGCGATCGCG) ou une petite suite de cytosines d(CCC)<br />ne sont pas compétiteurs et le signal retardé est atténué de moitié pour un rapport monobrin<br />d(T14)/sonde de 4000. L'ADN d'E. coli, coupé en fragments de 10 à 1000 bases, est compétiteur<br />(50%) pour un rapport compétiteur/sonde égal à 1000. Mais toutes les séquences d'oligomères<br />testées formant in vitro un motif i monomérique (séquences comptant 4 répétitions de 2, 3, 4 ou 5<br />de désoxycytidines, dont des séquences télomériques ou centromériques naturelles), entrent en<br />compétition avec la séquence d[(CCCACA)3CCC], notamment dans des conditions (pH,<br />température, force ionique,..), où le motif i est observé in vitro.<br />Pour identifier les protéines impliquées dans l'association avec l'ADN télomérique, nous<br />avons utilisé des billes de streptavidine greffées ou non avec la séquence d'ADN. Nous avons<br />identifié les protéines liées à l'ADN par spectrométrie de masse MALDI-TOF et Q-TOF MS/MS. Il<br />s'agit de trois protéines Yhr216p, Ylr432p et Yml056p, dont les séquences sont très proches. Cette<br />identification a été confirmée par séquençage par dégradation d'Edman de peptides internes. Les<br />séquences de ces protéines sont similaires (~ 78 %) aux deux inosine 5'-monophosphate<br />déshydrogénases humaines (IMPDH 1 et 2 (masse de ~ 56 kDa)) connues pour leur implication<br />dans le métabolisme des purines. Celles-ci sont habituellement observées sous forme tétramérique<br />(masse > 200 kDa). Malgré la présence dans des extraits nucléaires humains HeLa d'une protéine<br />ayant des caractéristiques de migration natives identiques à celles observées chez la levure, et<br />différentes des protéines ASF/SF2 et hnRNP K déjà identifiées, nous avons montré que les<br />protéines IMPDH 1 et 2 purifiées ne sont pas capables de fixer seules l'ADN télomérique humain.<br />Nous montrons également que les protéines identifiées (Yhr216p, Ylr432p et Yml056p)<br />s'associent au brin complémentaire riche en G. Des migrations électrophorétiques en présence de<br />compétiteurs montrent que cette association est spécifique. A notre connaissance, il s'agit des<br />premières protéines de levures interagissant séparément avec chacun des deux brins télomériques<br />dans des conditions d'incubation où l'on observe la formation de quadruplexes de guanines et de<br />motif i.

Ces travaux de recherche s’intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d’une transplantation hépatique ou bien encore à l’évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l’essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l’agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d’une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s’est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d’absorbance dans l’ultra-violet et l’autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L’autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l’analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d’investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d’un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d’analyse miniaturisé et simple d’utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d’analyse sur puce microfluidique permettant l’analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d’une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR. / The purpose of our work was the development of new analytical methodologies to measure the benefit of liver transplantation and also the evaluation of new therapeutic approaches under testing on patients with Transtyretin (TTR) familial amyloid polyneuropathy. This rare disease is characterized by a structural destabilization of TTR tetramer leading to it’s aggregation into amyloïd fibrils that accumulate in the tissues of the autonomous nervous system, peripheral nerves and around certain organs, including the heart. As part of a collaboration between university, hospital, analytical chemists, electrochemist, physical chemists and technologists, we are committed to develop separations in capillary electrophoresis coupled with optical detection of native and mutated peptides that are directly associated with a variant of this rare disease. The first challenge of this research is the choice of these biomarkers that ultimately proved relevant with the realization of peptide maps from the serum. Then two approaches have been explored: electrokinetic separation with absorbance spectrometric detection in the ultraviolet and the other requiring the prior labeling peptides with fluorescent molecules and then to a separation on electrophoresis coupled with LIF (Laser induced fluorescence). In both cases the main criterion of separation, resolution, allows quantification and especially analytical validations show actual strength associated methodologies developed. Another encouraging sign for the transposition of these methods to the analysis of samples from patients regarding the quantification limit is lower than commonly measured in serum. Mass spectrometry, using physico-chemical investigation powerful allowed to follow and understand a more fundamental viewpoint the product of organic chemistry reactions bypass peptides by three fluorescent dyes: TAMRA-SE, the NDA and FQ. The ability to provide a miniaturized analysis and easy to use tool for the hospital environment was also studied. A post analysis on microfluidic chip for quantitative and qualitative analysis was installed to allow the realization of the first experimental tests of electrokinetic separations on microfluidic chip. These studies lay the foundation for a new analytical way to separate and quantify the different characteristics biomarkers family TTR amyloid polyneuropathy.

Certaines populations d'Armadillidium vulgare (A. vulgare) présentent une descendance comportant un excès de femelles. Cette anomalie est dûe à une bactérie intracytoplasmique du genre Wolbachia [Gram(-)], responsable de la féminisation des mâles. Ces derniers présentent alors toutes les caractéristiques d'une femelle et transmettent la bactérie à leur descendance. Cependant, ce taux de transmission n'est pas contant. De plus, lors d'injections expérimentales de Wolbachia à des mâles sains de la même espèce, la bactérie s'implante dans tous les tissus (y compris les hémocytes), et l'individu présente une régression de ses caractères sexuels secondaires. Par contre, la même injection réalisée chez certains isopodes d'un genre différent conduit à l'élimination totale de la bactérie. Ainsi, Wolbachia semble capable d'interagir avec le système immunitaire de son hôte mais semble également capable de lui échapper.<br /> Chez les crustacés, les hémocytes sont le siège de l'immunité innée, qui comporte deux types de réponses, une réponse cellulaire et une réponse humorale. La première concerne tous les phénomènes de phagocytose, d'encapsulation et de formation de nodules. La deuxième met en jeu de nombreuses protéines responsables de la mélanisation, de la coagulation et de l'activité antimicrobienne. Ces protéines sont stockées dans les granules des hémocytes et sont libérés dans l'hémolymphe lors d'une infection microbienne.<br /> Chez les isopodes terrestres, aucune étude n'avait été réalisée sur la réponse immunitaire, nous nous sommes donc intéressés aux deux aspects de cette réponse. L'observation en cytologie fine des hémocytes et des organes hématopoïétiques d'A. vulgare infectés ou non par Wolbachia, nous a permis d'une part d'identifier les différents types d'hémocytes et de les comparer à ceux décrits chez les crustacés décapodes et, d'autre part, de suspecter une désorganisation du cytosquelette des cellules infectées par Wolbachia.<br /> La recherche d'activité antimicrobienne a conduit à l'isolement et à la caractérisation d'un peptide antibactérien (armadillidine) produit et stocké dans les hémocytes mais également à mettre en évidence deux peptides (potentiellement antimicrobiens) issus du clivage de l'hémocyanine. <br /> Afin d'identifier les protéines impliquées dans la réponse humorale, une cartographie bidimentionnelle des protéines hémocytaires des deux types d'animaux a été réalisée. L'analyse de ces cartes a permis de mettre en évidence de nombreuses protéines, connues chez les crustacés décapodes et chez d'autres invertébrés, impliquées dans la réponse immunitaire. <br /> Cette étude contribue à la compréhension des mécanismes impliquées dans la réponse immunitaire et devrait permettre d'appréhender la relation d'A. vulgare avec Wolbachia.

Les aptamères sont de courts oligonucléotides sélectionnés par le procédé SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment), présentant une affinité et une spécificité élevée pour leur cible. Ce travail porte sur la caractérisation physico-chimique d'aptamères et l'étude de leur affinité avec leur cible, par électrophorèse capillaire, à travers l'exemple d'un aptamère dirigé contre une cible protéique fortement basique, le lysozyme. Après évaluation de différents traitements de surface du capillaire, la modification permanente par l'hydroxypropylcellulose a été retenue afin de limiter l'adsorption protéique tout en restant compatible avec l'analyse de l'aptamère. Le comportement électrophorétique de l'aptamère en présence de différents cations en solution a ensuite été étudié par électrophorèse capillaire d'affinité (ACE), mettant en évidence dans le cas d'un dication une interaction significative pouvant induire un changement de conformation de l'aptamère, et donc susceptible d'influer sur l'interaction avec la cible. Le développement d'une méthode d'analyse frontale électrocinétique en microsystème (FACMCE) avec détection de fluorescence a permis de déterminer les paramètres de l'interaction aptamère-lysozyme, ainsi que l'influence des conditions expérimentales sur l'affinité. Enfin, des nanoparticules magnétiques fluorescentes cœur/coquille ont été fonctionnalisées par l'aptamère puis caractérisées par électrophorèse capillaire de zone (CZE). L'étude par FACMCE de l'interaction entre l'aptamère greffé et le lysozyme a montré une affinité similaire à celle de l'aptamère libre, permettant ainsi d'envisager l'utilisation future de ces objets comme outils de bio-reconnaissance moléculaire.

Dans le plasma, la protéine humaine de transfert des esters de cholestérol joueun rôle central dans le métabolisme des lipoprotéines plasmatiques en catalysant le transfert net massique d'esters de cholestérol des HDL vers les lipoprotéines contenant de l'Apo.B, et de triglycérides des VLDL vers les HDL et LDL. Bien que le rôle de la CETP sur l'athérogénicité du profil lipoprotéique reste à l'heure actuelle encore ambigu, l'étude des mécanismes de régulation de cette protéine suscite un intérêt croissant d'un point de vue pharmacologique en particulier en ce qui concerne le développement d'inhibiteurs. <br />Une approche in vitro nous a permis de montrer que des composés amphipathiques (acides gras non estérifiés et rétinoïdes) constitués d'une chaîne carbonée hydrophobe et d'un groupement carboxylique ionisable induisaient une augmentation de l'activité de transfert des esters de cholestérol en augmentant l'électronégativité des particules lipoprotéiques. <br />In vivo, nos études ont permis de mettre en évidence une corrélation significative entre la concentration en acides gras non estérifiés liés aux protéines et l'activité de la CETP plasmatique chez des sujets normolipidémiques. L'effet des acides gras non estérifiés est encore plus marqué dans des situations pathologiques associées à une redistribution des AGNE de l'albumine vers les lipoprotéines plasmatiques (analbuminémie ou syndrôme néphrotique). La mise au point d'une méthode électrophorétique spécifique nous a permis de confirmer que, chez des sujets analbuminémiques, les échanges d'esters de cholestérol s'effectuent préférentiellement avec les lipoprotéines les plus électronégatives dont le contenu en AGNE est le plus élevé.<br />Globalement, les résultats de cette étude montrent que les AGNE constituent des modérateurs potentiels de l'activité de transfert des esters de cholestérol au niveau plasmatique et qu'ils pourraient ainsi influencer l'athérogénicité du profil lipoprotéique.

Les nanodiamants issus de la détonation ont été découverts en URSS dans les années 1960. Cette technique de synthèse permet de générer pendant un temps très court, des hautes pressions et hautes températures. Les particules de diamant formées, possèdent un diamètre moyen de 5nm et disposent d'une riche chimie de surface. Celle-ci a été étudiée et les sites oxygénés ont été quantifiés par diverses méthodes. Ces sites ont ensuite été modifiés par le greffage (par des liaisons covalentes ou métal-ligand) de molécules organiques (porphyrines, phthalocyanines, ...). Des techniques ont été développées afin de déterminer le rendement du greffage chimique. Les matériaux synthétisés ont ensuite été valorisés par leur utilisation comme filtres aux propriétés non-linéaires pour de la protection laser. Les propriétés colloïdales des nanodiamants ont également été étudiées, afin de séparer les agrégats des particules unitaires et procéder à des dépôts contrôlés. Grâce à un procédé présenté dans ce manuscrit, il a été possible de déposer de manière uniforme des particules unitaires de nanodiamant en monocouche extrêmement dense. Ces dépôts ont été utilisés pour l'élaboration de capteurs.

Les nanoparticules (NPs) à luminescence persistante de gallate de zinc dopée chrome (ZnGa1.995Cr0.005 O4) sont des matériaux innovants avec des propriétés optiques particulières qui permettent leur utilisation pour l'imagerie optique in vivo. Leur caractérisation a été effectuée par une méthode émergente dans ce domaine, l'électrophorèse capillaire. Les résultats ont démontré le potentiel de cette méthode pour garantir le contrôle et la qualité des NPs. Un ensemble général des tests de toxicité a été réalisé in vitro et in vivo après administration aiguë, à court et à long terme des ZnGa1.995Cr0.005O4, afin d'évaluer leur biocompatibilité. Lors de l'administration de NPs hydroxylés, différentes conséquences négatives ont été notées, ainsi comme l'effet protecteur du polyéthylène glycol fonctionnalisé en surface des NPs. En raison de l'importance des interactions des NPs avec les protéines plasmatiques lors de leur administration, nous avons évalué et appliqué pour la première fois la méthode électrocinétique de Hummel-Dreyer pour la détermination des interactions non spécifiques entre les NPs PEGylés et des protéines. Finalement, l'évaluation des interactions entre les ZnGa1.995Cr0.005O4 et un système binaire de protéines (albumine et Apolipoprotéine-E) a été effectuée par des méthodes électrocinétiques. Ces analyses ont montré une affinité plus forte entre la surface des NPs PEGylés et l'apolipoprotéine-E par rapport à l'albumine, ce qui pourrait représenter une stratégie novatrice pour la vectorisation des NPs vers la région du cerveau. Toutes les méthodes mentionnées ci-dessus peuvent être extrapolées pour l'analyse des autres NPs avec plusieurs des applications. / The chromium doped zinc gallate (ZnGa1.995Cr0.005O4) nanoparticles (NPs) are innovative materials with specific optical properties, notably the persistent luminescence, which allow their use for in vivo optical imaging. Their characterization was carried out by an emergent method in this area, the capillary electrophoresis. The obtained results demonstrated the potential of this method to ensure the control and quality of NPs. A general set of toxicity tests were performed in vitro and in vivo after acute, short- and long-term administration of the NPs to assess their biocompatibility. Various negative effects were noted upon administration of hydroxylated NPs, as well as the protective effect of NP PEGylation. Because of the importance of NP interactions with plasma proteins after their in vivo administration, we evaluated and applied for the first time the Hummel-Dreyer electrokinetic method for the determination of non-specific interactions between PEGylated NPs and proteins. Finally, the evaluation of the interactions between the ZnGa1.995Cr0.005O4 and a binary system of proteins (albumin and apolipoprotein-E) was carried out by electrokinetic methods. The results revealed greater affinity between the surface of the PEGylated NPs and the apolipoprotein-E compared to albumin, which could represent a novel strategy for the vectorization of NPs towards the brain region. All the above mentioned methods can be extrapolated for the analysis of other NPs with several potential applications.