Orientador: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Carlos Antônio de Carvalho Fernandes / Banca: Eunice Oba / Banca: Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção / Banca: Maria Denise Lopes / Resumo: Neste estudo vitrificou-se em OPS ovócitos (Experimentos 1, 2 e 3) e embriões bovinos (Experimentos 4, 5 e 6) em três soluções de vitrificação distintas: Experimentos 1 e 4) 20%EG + 20%DMSO + 0,5M sacarose; Experimentos 2 e 5) 20%DF + 20%EG + 0,5M sacarose; Experimentos 3 e 6) 20%DF + 20%DMSO + 0,5M sacarose. Os embriões foram vitrificados na presença ou não de citocalasina B. Os ovócitos foram vitrificados ou somente expostos aos crioprotetores imaturos (G0h e G0hexp), ou após 6 horas (G6h e G6hexp), 12 horas (G12h e G12hexp) ou 22 horas de MIV (G22h e G22hexp). Após a exposição ou aquecimento, parte dos ovócitos completou as 22 horas de MIV e foi destinada à PIV, para avaliação da capacidade de se desenvolverem até blastocisto. No restante avaliou-se o estágio de maturação nuclear e a distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias. Observou-se que a exposição dos ovócitos imaturos (0 ou 6 horas de MIV) aos crioprotetores nos experimentos 1, 2 e 3 resultou em perda substancial de viabilidade, avaliada pelas taxas de clivagem (GC=79,4%; 1G0hexp=37,1%; 1G6hexp=51,1%; 2G0hexp=33%; 2G6hexp=52,5%; 3G0hexp=36,2%; 3G6hexp=49,8%), o que foi menos notável nos ovócitos expostos após 12 ou 22 horas de MIV (1G12hexp=59,1%; 1G22hexp=71,1%; 2G12hexp=61,5%; 2G22hexp=62,5%; 3G12hexp=58,8%; 3G22hexp=68,6%). A realização da MIV antes da vitrificação foi benéfica. Apesar de nenhuma das soluções de crioprotetores ter sido capaz de promover proteção adequada aos ovócitos submetidos à vitrificação em qualquer momento da MIV, no Experimento 1 foi observada clivagem (1G12h=7,3%; 1G22h=4,2%) indicando que a mistura de crioprotetores EG+DMSO foi a mais eficiente nas condições utilizadas. Entretanto, não houve produção de blastocistos em nenhum experimento. Nos Experimentos 4, 5 e 6 notou-se que em todos os grupos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this study bovine oocytes (Experiments 1, 2 and 3) and embryos (Experiments 4, 5 and 6) were vitrified in OPS using 3 different cryoprotectant solutions: Experiments 1 and 4) 20%EG + 20%DMSO + 0,5M sucrose; Experiments 2 and 5) 20%DF + 20%EG + 0.5M sucrose; Experiments 3 and 6) 20%DF + 20%DMSO + 0.5M sucrose. Embryos were vitrified in the presence or not of cytocalasin B. Oocytes were vitrified or just exposed to the cryoprotectant solutions after 0h (G0h and G0hexp), 6h of IVM (G6h and G6hexp), 12h of IVM (G12h and G12hexp) and 22h of of in vitro maturation (IVM) (G22h and G22hexp). Oocytes from groups 0 and 6h were considered immature and from 12 and 22h groups were considered mature. After exposure to cryoprotectants or warming, part of the oocytes that completed 22h of IVM were submitted to IVF to evaluate their developmental ability. Another part of the oocytes were used to evaluate nuclear maturation in the distribution of mitochondria and cortical granules. The results showed that the exposure of immature oocytes (0 and 6 hours of MIV) to cryoprotectants reduce their viability, since cleavage rates of all groups were significantly lower compared to control group (GC=79.4%; 1G0hexp=37.1%; 1G6hexp51.1%; 2G0hexp=33%; 2G6hexp=52.5%; 3G0hexp=36.2%; 3G6hexp=49.8%). This effect was less evident in the groups of mature oocytes submitted to IVM for 12 or 22 hours (1G12hexp=59.1%; 1G22hexp=71.1%; 2G12hexp=61.5%; 2G22hexp=62.5%; 3G12hexp=58.8%; 3G22hexp=68.6%). The previous IVM is beneficial to vitrification. Although none of the cryoprotectant solutions utilized were totally efficient in protecting the oocytes form cryodamage, in Experiment 1 cleavage was observed (1G12h=7.3%; 1G22h=4.2%) indicating that the combination of EG+DMSO was more effective than the other two. However in none of the groups blastocyst was formed. When embryos... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-29T17:51:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 573452 bytes, checksum: b30ab12e24dedee6f3cd4b820e641897 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-29T17:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 573452 bytes, checksum: b30ab12e24dedee6f3cd4b820e641897 (MD5) Previous issue date: 2016-07-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção in vitro de embriões caprinos ainda não é considerada uma biotecnologia rotineiramente efetiva. Um dos fatores mais importante e que dificulta a evolução no processo de todo o processo da PIV é o estresse oxidativo. A proposta adotada neste estudo foi avaliar os efeitos da adição de melatonina em meios de maturação e cultivo in vitro no desenvolvimento de embriões caprinos e na qualidade dos blastocistos oriundos de oocitos de cabras pré-púberes. O objetivo do primeiro estudo foi avaliar o efeito da melatonina no meio de cultura in vitro de embriões partenogenéticos através da taxa de desenvolvimento de blastocistos e vitrificação. Foi utilizado um meio de maturação e de cultivo in vitro e convencional com e sem melatonina (10-9 mol L-1). Os oocitos com células do Cumulus oophorus foram maturados in vitro naqueles meios de maturação por 27 h e então ativados. Estas células ativadas foram cultivadas nos respectivos meios de cultivo por oito dias e então aferidos as taxas de blastocistos. O método de vitrificação foi utilizado de acordo com Mermillod et al., 1998. A adição da melatonina a 10-9 mol L- aos meios de maturação e de cultivo in vitro não apresentou melhora na taxa de blastocistos produzidos. Na segunda parte deste estudo objetivou-se avaliar o efeito da melatonina no meio de cultura in vitro, porém em embriões fertilizados artificialmente, por meio da taxa de desenvolvimento de blastocistos. Utilizou-se um meio convencional para MIV com ou sem adição de melatonina a 10-9 mol L-1. Após a MIV, os oocitos maturados foram inseminados com semen a fresco, e os espermatozoides foram capacitados em meio de capacitação contendo heparina. Os possíveis zigotos foram separados e uma parte foi cultivado em meio de cultura padrão com adição da melatonina a 10-9 mol L-1. Ambos foram cultivados durante oito dias e a taxa de blastocisto foi aferida. Os resultados desta segunda etapa mostraram que ao utilizar melatonina a 10-9 mol L-1 adicionada ao meio de maturação in vitro convencional melhoraram quanto ao número de células fertilizadas (34,57% vs. 17,39%, p<0,05), embora, não houve melhora na taxa de clivagem e no número de blastocistos produzidos. A conclusão mostra que a melatonina a 10-9 mol L-1 adicionada tanto em MIV, quanto em CIV, não melhora o desenvolvimento e a produção dos embriões in vitro, embora possa aumentar a taxa fertilização in vitro. / The in vitro production of goat embryos is not considered a routinely effective biotechnology. There are a number of factors that hinder the progress in the process of maturation, fertilization, cultivation and freezing. One of the most important factors that cause deleterious effects throughout the IVP process is the oxidative stress. The proposal of this study in order to prevent and to control that stress condition was to supplement the in vitro maturation (IVM) and in vitro culture media (IVC) with melatonin evaluating it effects on the development of goat embryos and quality of embryos derived from prepubertal goats oocytes. The aim of the first experiment was to evaluate the effect of melatonin supplementation in the in vitro culture on development of parthenogenetic embryos. It was used two in vitro maturation media [conventional maturation media (CM) and CM + 10-9 M melatonin] and two in vitro culture media [conventional cultivation media (CC) and CC + 10-9 M melatonin. The oocytes with cumulus cells were randomly distributed in the IVM and then activated by ionomycin method followed by 6-DMAP. Afterwards, presumptive zygotes were randomly distributed in the IVC media and cultured for eight days. Supplementation of 10-9 M melatonin to the IVM and IVC media showed no improvement in the parthenogenetic blastocyst rate. The blastocyst rate diminished when melatonin was added in vitro culture medium. The second study was also evaluate the effect of melatonin in vitro culture medium, but using in vitro fertilization over the blastocyst development rate. We used a conventional medium (CM) to in vitro maturation media and other CM was supplemented with melatonin at 10-9 M. After IVM, the matured oocytes were inseminated with fresh semen, and then, that spermatozoa were capacitated and cultured for eight days. There was an in vitro culture media used and other one added with melatonin (10-9 M). The results of this second study demonstrated that the use of melatonin at 10-9 M added to the in vitro conventional maturation medium presented a beneficial effect on the number of fertilized cells (34.57 % vs. 17.39%, p<0.05). However, this addition there was no improvement in the cleavage rate nor the blastocyst rate. We concluded that melatonin at 10-9 M added in both IVM medium and IVC medium do not improve the development of embryos. However, it can be a gain in the in vitro fertilization rate when melatonin is added in the IVM medium.

Orientador: Silvia Helena Venturoli Perri / Coorientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Felipe Perecin / Banca: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Caliê Castilho / Banca: Guilherme de Paula Nogueira / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de cultivo com ácido linoleico e/ou catalase, em meio sem a adição de SFB, cultivados em atmosfera de baixa tensão de oxigênio sobre o desenvolvimento, qualidade e criotolerância de embriões bovinos. Em um grupo foi feita a suplementação com 100 μM de ácido linoleico (LA); 100UI de catalase (CAT) em um segundo, no terceiro grupo foram feitas as 2 suplementações (CAT+LA) e um quarto grupo sem suplementação (CONTROLE), durante todo o período de cultivo em atmosfera de 5%CO2, 7%O2 e 88%N2 em BAGS. As taxas de clivagem não diferiram (P>0,05) entre os grupos. Porém as taxas de produção de embriões em D7 e D8 diferiram (P<0,05), sendo que o controle obteve melhor resultado perante os 3 tratamentos e o grupo CAT+LA gerou a menor taxa de produção (30,7; 22,4; 19,8; 12,4%). Observou-se um atraso no desenvolvimento, sendo os blastocistos expandidos somente encontrados no D8. Na avaliação do conteúdo total de lipídios, houve uma redução significativa (P<0,05) nos 3 grupos tratados em relação ao controle. A medida dos níveis intracelulares de ROS não foi afetada nos 4 grupos (P>0,05). A quantidade de células totais foi significativamente menor (P<0,05) no grupo CAT+LA, e o grupo CAT foi o que apresentou maior porcentagem de células apoptóticas. Em relação à taxa de re-expansão às 24 horas (P<0,05), o grupo controle (50%) e o CAT (67,2%) apresentaram menores taxas que os grupos LA (71,7%) e o CAT+LA (76,7%). Às 48 horas, o grupo controle apresentou a menor taxa (35,7%), seguido pelo grupo CAT (47,5%). Já o grupo LA (56,5%) diferiu estatisticamente do controle mas não dos grupos CAT (47,5%) e CAT+LA (76,7%). O grupo CAT+LA diferiu estatisticamente dos grupos controle e CAT. Com base nestes resultados, embriões tratados com LA ou CAT+LA no cultivo in vitro, na ausêncio... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The most commonly recommended way to obtain more resistant in vitro embryos during the cryopreservation process is to change these embryos, whether through removal of fetal bovine serum (FBS), addition of different supplements to the culture medium or changes in oxygen tension in the production process. The objective of this study was to assess the effects of supplementation of the culture medium with linoleic acid and/or catalase in medium without the addition of FBS, in low tension oxygen atmosphere on development, quality and cryotolerance of bovine embryos. In one group, the medium was supplemented with 100 μm of linoleic acid (LA); the second was supplemented with 100UI of catalase (CAT), a third group was supplemented with both, CAT+LA and a fourth group received no supplementation (control), during the entire culture period in an atmosphere of 5% CO2, 7% O2 and N2 88% in BAGS. Cleavage rates did not differ (P>0.05) between groups (72.7; 74.1; 72.1; and 72.0%, respectively). However, embryo production rates in D7 and D8 were different (P<0.05), where the control had the highest blastocyst rate of the treatments and the CAT+LA group presented the lowest rate of production (30.7; 22.4; 19.8; 12.4%). Expanded blastocysts were only foundon D8, indicating a delay in development. There was a significant reduction (P<0.05) of total lipids in the 3 treated groups when compared to the control group. There was no difference in the intracellular levels of ROS between the 4 groups (P>0.05).Total cell number was significantly lower (P<0.05) in the CAT+ LA and the CAT group showed the highest percentage of apoptotic cells. Considering the re-expansion rates in 24 hours (P<0.05), the control group (50%) and the CAT group (67.2%) presented lower rates than the LA group (71.7%) and CAT+LA group (76.7%). At 48 hours, the control group showed the worst rate (35.7%) followed by the CAT group (47.5%)...(Complete abstract eletronic access below) / Doutor

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-05-15T11:33:00Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_UtilizacaoCelulasTrofoblasta.PDF: 3484769 bytes, checksum: 0aeb5fff725718c30f9e19f2450b603e (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-05-16T17:31:50Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_UtilizacaoCelulasTrofoblasta.PDF: 3484769 bytes, checksum: 0aeb5fff725718c30f9e19f2450b603e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-16T17:31:50Z (GMT). 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A maioria dos bovinos são heterozigotos em BoLA e apenas em ocasiões especiais (animais homozigotos ou que possuam informação de pedigree) seu haplótipo pode ser caracterizado. Portanto, este trabalho objetivou desenvolver uma nova abordagem para descrever haplótipos de BoLA de vacas heterozigotas, utilizando células do trofoblasto de embriões partenogenéticos bovinos. Dois métodos para validação desta abordagem foram utilizados: um painel de 445 SNPs em BoLA foi informativo acerca do efeito que a recombinação meiótica apresenta na zigose da região; e a comparação de alelos de BoLA-DRB3 entre a fêmea bovina e sua célula trofoblástica partenogenética (CTP) demonstrou ser um método confiável e prático para a investigação de homozigose em BoLA. A partir de ambos os métodos, a metodologia desenvolvida aqui foi validada, já que CTPs homozigotas em BoLA foram derivadas de vacas heterozigotas, permitindo a descrição de haplótipos de BoLA. A análise detalhada da região de Classe IIa de BoLA-DRB3-DQA-DQB revelou a presença de 18 haplótipos distintos, sendo 16 destes nunca antes descritos. Além disso, dois alelos de DQA e um de DQB presentes nestes haplótipos são novos. O método descrito aqui foi mais eficiente do que a investigação por fêmeas homozigotas ou inferir a composição haplotípica baseada em informação de pedigree, além de evitar ambiguidades nos resultados. Novas pesquisas buscando a otimização deste método podem aumentar a sua eficiência e torná-lo mais facilmente aplicável a uma variedade de estudos genéticos, usando espécies diferentes e com finalidades distintas. / The prospect of increasing the productivity of cattle by means of genetic improvement is increasingly investigated. Among the most studied and and promising genomic regions is the Major Histocompatibility Complex (MHC), since it includes key genes of the immune response of the animals, being able to select makers in this region for increased disease resistance and therefore greater production. The diversity of the cattle MHC, known as BoLA (Bovine Leukocyte Antigens), has been primarily studied using variants of serological specificities or sequencing some of its genes. Most cattle are heterozygous at BoLA and only in special occasions (homozygous animals or animals for which pedigree information is available) can the haplotypes be characterized. Therefore, this study aims to develop a novel approach to describe BoLA haplotypes from heterozygous cows, using trophoblast cells from parthenogenetic bovine embryos derived from slaughterhouse ovaries. Two methods for validating this approach were used: a panel of 445 SNPs spanning BoLA region was informative on the effect of meiotic recombination on the region zigosity; and the comparison of BoLA-DRB3 alleles between the dam and its parthenogenetic embryo derived trophoblast cells (PEDTC) proved to be a reliable and practical method for investigating BoLA homozigosity. Using both methods, the approach presented here was validated, since BoLA homozygous PEDTC were derived from heterozygous cows, allowing the description of BoLA haplotypes. Detailed analysis of the BoLA Class IIa region identified 18 different BoLA-DRB3-DQA-DQB haplotypes, including 16 novel haplotypes. Furthermore, two DQA and one DQB alleles included in these haplotypes were novel. This method was more efficient than to look for homozygous cows or infer haplotype composition based on pedigree information, in addition to avoid ambiguities on the results. New researches aiming for the improvement of this method can increase its efficiency and make it more easily applicable for a variety of genetic studies, using different species and for other purposes.