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Produção in vitro de embriões caprinos pré-púberes: efeito da melatonina nos meios de maturação in vitro e cultivo in vitro embrionário / In vitro production of prepubertal goats embryos: effect of melatonin in in vitro maturation and culture media

Chaya, Alberto Yukio 08 July 2016 (has links)
Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-29T17:51:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 573452 bytes, checksum: b30ab12e24dedee6f3cd4b820e641897 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-29T17:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 573452 bytes, checksum: b30ab12e24dedee6f3cd4b820e641897 (MD5) Previous issue date: 2016-07-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção in vitro de embriões caprinos ainda não é considerada uma biotecnologia rotineiramente efetiva. Um dos fatores mais importante e que dificulta a evolução no processo de todo o processo da PIV é o estresse oxidativo. A proposta adotada neste estudo foi avaliar os efeitos da adição de melatonina em meios de maturação e cultivo in vitro no desenvolvimento de embriões caprinos e na qualidade dos blastocistos oriundos de oocitos de cabras pré-púberes. O objetivo do primeiro estudo foi avaliar o efeito da melatonina no meio de cultura in vitro de embriões partenogenéticos através da taxa de desenvolvimento de blastocistos e vitrificação. Foi utilizado um meio de maturação e de cultivo in vitro e convencional com e sem melatonina (10-9 mol L-1). Os oocitos com células do Cumulus oophorus foram maturados in vitro naqueles meios de maturação por 27 h e então ativados. Estas células ativadas foram cultivadas nos respectivos meios de cultivo por oito dias e então aferidos as taxas de blastocistos. O método de vitrificação foi utilizado de acordo com Mermillod et al., 1998. A adição da melatonina a 10-9 mol L- aos meios de maturação e de cultivo in vitro não apresentou melhora na taxa de blastocistos produzidos. Na segunda parte deste estudo objetivou-se avaliar o efeito da melatonina no meio de cultura in vitro, porém em embriões fertilizados artificialmente, por meio da taxa de desenvolvimento de blastocistos. Utilizou-se um meio convencional para MIV com ou sem adição de melatonina a 10-9 mol L-1. Após a MIV, os oocitos maturados foram inseminados com semen a fresco, e os espermatozoides foram capacitados em meio de capacitação contendo heparina. Os possíveis zigotos foram separados e uma parte foi cultivado em meio de cultura padrão com adição da melatonina a 10-9 mol L-1. Ambos foram cultivados durante oito dias e a taxa de blastocisto foi aferida. Os resultados desta segunda etapa mostraram que ao utilizar melatonina a 10-9 mol L-1 adicionada ao meio de maturação in vitro convencional melhoraram quanto ao número de células fertilizadas (34,57% vs. 17,39%, p<0,05), embora, não houve melhora na taxa de clivagem e no número de blastocistos produzidos. A conclusão mostra que a melatonina a 10-9 mol L-1 adicionada tanto em MIV, quanto em CIV, não melhora o desenvolvimento e a produção dos embriões in vitro, embora possa aumentar a taxa fertilização in vitro. / The in vitro production of goat embryos is not considered a routinely effective biotechnology. There are a number of factors that hinder the progress in the process of maturation, fertilization, cultivation and freezing. One of the most important factors that cause deleterious effects throughout the IVP process is the oxidative stress. The proposal of this study in order to prevent and to control that stress condition was to supplement the in vitro maturation (IVM) and in vitro culture media (IVC) with melatonin evaluating it effects on the development of goat embryos and quality of embryos derived from prepubertal goats oocytes. The aim of the first experiment was to evaluate the effect of melatonin supplementation in the in vitro culture on development of parthenogenetic embryos. It was used two in vitro maturation media [conventional maturation media (CM) and CM + 10-9 M melatonin] and two in vitro culture media [conventional cultivation media (CC) and CC + 10-9 M melatonin. The oocytes with cumulus cells were randomly distributed in the IVM and then activated by ionomycin method followed by 6-DMAP. Afterwards, presumptive zygotes were randomly distributed in the IVC media and cultured for eight days. Supplementation of 10-9 M melatonin to the IVM and IVC media showed no improvement in the parthenogenetic blastocyst rate. The blastocyst rate diminished when melatonin was added in vitro culture medium. The second study was also evaluate the effect of melatonin in vitro culture medium, but using in vitro fertilization over the blastocyst development rate. We used a conventional medium (CM) to in vitro maturation media and other CM was supplemented with melatonin at 10-9 M. After IVM, the matured oocytes were inseminated with fresh semen, and then, that spermatozoa were capacitated and cultured for eight days. There was an in vitro culture media used and other one added with melatonin (10-9 M). The results of this second study demonstrated that the use of melatonin at 10-9 M added to the in vitro conventional maturation medium presented a beneficial effect on the number of fertilized cells (34.57 % vs. 17.39%, p<0.05). However, this addition there was no improvement in the cleavage rate nor the blastocyst rate. We concluded that melatonin at 10-9 M added in both IVM medium and IVC medium do not improve the development of embryos. However, it can be a gain in the in vitro fertilization rate when melatonin is added in the IVM medium.
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Desenvolvimento de embriões bovinos produzidos pela clonagem manual (handmade cloning) com distintos volumes citoplasmáticos / Developmental potential of bovine handmade clone embryos reconstructed by aggregation of fusion with distinct cytoplasmic volumes

Ortigari Júnior, Ivens 26 May 2008 (has links)
Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV08MA028.pdf: 640511 bytes, checksum: 7739954e4535ca25f1e1be5d8d3266a8 (MD5) Previous issue date: 2008-05-26 / Animal cloning has been associated with developmental abnormalities, with the level of heteroplasmy caused by the procedure per se being one of the potential determining factors for the appearance of the problems. Embryo aggregation may be an alternative to minimize such effects during cloning. The aim of this study was to determine the effect of the heteroplasmy caused by fusion of hemi-cytoplasts or by aggregation of hemi-embryos, varying the final cytoplasmic volume, on development and cell density of embryos produced by handmade cloning (HMC), parthenogenesis or in vitro fertilization (IVF). In vitro-matured bovine oocytes, selected by the presence of a polar body, were manually bisected, followed by fluorescence screening of hemi-cytoplasts. One or two enucleated hemi-cytoplasts were paired and fused with one skin somatic cell. Activated clone and zona-free parthenote embryos and hemi-embryos were in vitro-cultured in microwells (WOW system), being allocated to one of six experimental groups, based on the volume of cytoplasm used for embryo reconstruction either by fusion of hemi-cytoplasts or by aggregation of hemi-embryos or embryo, on a per WOW basis, as follows: single clone or parthenote hemi-embryos (G1: 1 x 50%); aggregation of two (G2: 2 x 50%), three (G3: 3 x 50%) or four (G4: 4 x 50%) clone or parthenote hemi-embryos; single clone or parthenote embryos (G5: 1 x 100%); or aggregation of two clone or parthenote embryos (G6: 2 x 100%). Zona-intact parthenote or IVF embryos (G7: Zona-intact, 100%), used as controls, were in vitro-cultured in 4-well dishes. Data were analyzed by &#967;2, ANOVA, Pearson s correlation or linear regression, for P<0.05. In general, results indicated that the increase in the number of aggregated structures within each WOW was followed by a linear increase in cleavage, blastocyst rate and cell density. Even though those observations were more pronounced in parthenotes, cell density and embryo quality were superior in clone embryos. The increase in cytoplasmic volume, either by fusion or by aggregation, had a positive effect on embryo development, supporting the establishment of pregnancies after transfer to female recipients. Nevertheless, the use of only half of the normal volume did not affect the developmental potential to the blastocyst stage, but reduced cell number. In conclusion, despite the increase in embryo development and cell density per WOW, embryo aggregation did not improve blastocyst yield or cell number, on a hemi-cytoplast basis / A clonagem animal tem sido associada a anormalidades de desenvolvimento, com o nível de heteroplasmia causados pela técnica per se sendo um dos potenciais fatores determinantes do aparecimento dos problemas. A agregação embrionária pode ser uma alternativa para minimizar tais efeitos causados pela clonagem. O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da heteroplasmia pela fusão de hemi-citoplastos ou da agregação de hemi-embriões, variando-se o volume citoplasmático final, no desenvolvimento e na densidade celular de embriões produzidos por handmade cloning (HMC), partenogênese ou fecundação in vitro (FIV). Oócitos bovinos maturados in vitro, selecionados pela presença do corpúsculo polar, foram bisseccionados manualmente, seguidos da seleção de hemi-citoplastos por fluorescência. Um ou dois hemi-citoplastos enucleados foram pareados e fusionados a uma célula somática cutânea. Embriões e hemi-embriões de clonagem e de partenogênese (sem zona pelúcida) foram ativados e cultivados in vitro em micropoços (sistema WOW), sendo alocados para um de seis grupos experimentais, baseado no volume de citoplasma utilizado para a reconstrução embrionária pela fusão de hemi-citoplastos ou agregação de hemi-embriões e embriões, por micropoço (WOW), conforme a seguir: um único hemi-embrião de clonagem ou de partenogênese (G1: 1 x 50%); agregação de dois (G2: 2 x 50%), três (G3: 3 x 50%) ou quatro (G4: 4 x 50%) hemi-embriões de clonagem ou de partenogênese; um único embrião de clonagem ou de partenogênese (G5: 1 x 100%); ou agregação de dois embriões de clonagem ou de partenogênese (G6: 2 x 100%). Embriões intactos oriundos de FIV ou de partenogênese (G7: Zona intacta, 100%), utilizados como controle, foram cultivados in vitro em placas de 4 poços. Os resultados foram analisados pelos testes do &#967;2, ANOVA, correlação de Pearson ou regressão linear, para P<0.05. Em termos gerais, os resultados indicaram que o aumento no número de estruturas agregadas em cada micropoço foi seguido por um aumento linear nas taxas de clivagem, de blastocisto e na densidade celular. Mesmo que tais observações tenham sido mais pronunciadas nos partenotos, a densidade celular e a qualidade embrionária foram superiores em embriões clonados. O aumento no volume citoplasmático por fusão ou agregação apresentou um efeito positivo no desenvolvimento embrionário, dando suporte ao estabelecimento de prenhezes após a transferência para fêmeas receptoras. No entanto, a utilização de apenas metade do volume normal não afetou o potencial de desenvolvimento até o estádio de blastocisto, mas reduziu o número de células. Em conclusão, apesar de haver um aumento no desenvolvimento e densidade celular em embriões por micropoço, a agregação embrionária não melhorou a taxa de blastocistos ou o número de células, com base no número de hemi-citoplastos utilizados por embrião
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Aspectos biológicos do desenvolvimento pré- implantacional de embriões bovinos partenogenéticos ou fecundados in vitro / Biological aspects of preimplantation development of parthenogenetic or fertilized in vitro bovine embryos

Miyauchi, Tochimara Aparecida 28 September 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TochimaraAparecidaMiyauchi-dissertacao.pdf: 1277501 bytes, checksum: 28f321c050df674dd0101fe282f265af (MD5) Previous issue date: 2012-09-28 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nïvel Superior / Parthenogenesis has been described as an alternative method to produce embryos for studies with embryonic cells, particularly in humans which have a restriction of fertilized embryos. Procedures used in parthenogenesis are also required to produce embryos by somatic cell nuclear transfer in domestic species. However, many biological, cellular and molecular aspects of parthenogenetic embryos are still unknown. This study aimed to compare the kinetics of development, apoptosis rate and gene expression of stress and celular metabolism in bovine parthenogenetic embryos and embryos fertilized in vitro. Oocytes (n = 1541) obtained from slaughterhouse ovaries were matured in vitro and submitted to parthenogenetic activation (4.62 µM ionomycin for 5 min followed by 2 mM 6-DMAP for 4 h) or in vitro fertilization (2 x 106 sperm/mL for 20h with semen from a single departure). 72h postactivation/fertilization (hpaf), embryos (8-cell) were frozen for subsequent analysis of gene expression and another part has been separated into groups of high or low potential of development: Part &#8805; 8 - parthenogenetic embryos with 8 or more cells (high development potential); Part < 8 - embryos less than 8 cells (low development potential); &#8805; 8 IVF - in vitro fertilized embryos with 8 or more cells; and IVF < 8 - embryos with less than 8 cells. Embryos were cultured in CR2aa medium with 2.5% BFS in 5% CO2, 5% O2, 90% N2 at 38.5° C and were evaluated rates of blastocyst 168hpaf (D7) and 196hpaf (D8). 8-cell embryos obtained after 72hpfa were analyzed for gene expression. D8 blastocysts were fixed and subsequently apoptotic index was analyzed by TUNEL. Data were compared by analysis of variance and means by Student Newman Keuls test. Gene expression was evaluated by REST® software. Values are shown as mean ± standard error. Embryos with 8 or more cells produced higher (P < 0.01) blastocysts rates in D7 and D8 compared to embryos with less than eight cells, showing its greatest development potential, regardless if they were parthenogenetic or fertilized. Embryos of Part &#8805; 8 group had higher (P <0.05) blastocyst rate in D7 (63.6 ± 3.4%) than IVF &#8805; 8 (45.3 ± 8.9%), but at D8 rate was similar (56.7 ± 3.0% and 44.2 ± 8.9% for Part &#8805; 8 and IVF &#8805; 8, respectively; P <0.05). There was no difference (P < 0.05) on blastocyst rates at D7 and D8 between embryos with less than 8 cells derived from parthenogenesis or fertilization. There was no difference in total cell number (92.0 ± 3.4, 102.30 ± 4.8), apoptotic cells (10.8 ± 1.22, 9.5 ± 1.07) and apoptotic index (11.4 ± 1.27, 9.8 ± 1.8) for parthenogenetic and IVF blastocysts, respectively. In 8-cell embryos analyzed, there was a subexpression of genes DNAJB1, HSPA1L, HSF1 and GLUT1 for Part in relation to FIV, while HSF2 was overexpressed in Part compared to FIV. In conclusion, bovine parthenogenetic embryos differ to embryos fertilized in vitro in hability of preimplantation development in vitro and gene expression, which may limit the use of parthenogenesis in studies of embryonic development. / A partenogênese tem sido descrita como um método alternativo para produzir embriões para estudos com células embrionárias, principalmente em humanos para os quais existe a restrição do uso de embriões fecundados. Procedimentos utilizados na partenogênese são também necessários para se produzir embriões por transferência nuclear com células somáticas nas espécies domésticas. Contudo, muitos aspectos biológicos, celulares e moleculares dos embriões partenogenéticos ainda são desconhecidos. Este estudo objetivou comparar a cinética do desenvolvimento, índice de apoptose e expressão de genes de estresse e metabolismo celular em embriões bovinos partenogenéticos e embriões fecundados in vitro. Oócitos (n=1541) obtidos de ovários de matadouro foram maturados in vitro e submetidos à ativação partenogenética (4,62 µM ionomicina por 5 min seguido de 2 mM 6-DMAP por 4h) ou fecundação in vitro (2 x 106 espermatozoides/ml por 20h, com sêmen de uma única partida). Com 72h pós-ativação/fecundação (hpaf) parte dos embriões (8 células) foram congelados para posterior análise da expressão gênica e outra parte foi separada em grupos de alto ou baixo potencial de desenvolvimento: Part&#8805;8 - embriões partenogenéticos com 8 ou mais células (alto potencial de desenvolvimento); Part<8 - embriões com menos de 8 células (baixo potencial de desenvolvimento); FIV&#8805;8 - embriões fecundados in vitro com 8 ou mais células; e FIV<8: embriões com menos de 8 células. Os embriões foram cultivados em meio CR2aa com 2,5% SFB em 5%CO2, 5%O2, 90% N2 a 38,5ºC e avaliadas as taxas de blastocistos com 168hpaf (D7) e 196hpaf (D8). Embriões com 8 células obtidos após 72hpfa foram analisados quanto à expressão gênica. Blastocistos em D8 foram fixados e posteriormente foram avaliados pela técnica de TUNEL o índice apoptótico. Os dados foram comparados por análise de variância e as médias por teste de Student Newman Keuls. A expressão gênica foi avaliada pelo software REST®. Os valores são mostrados como média±erro padrão. Embriões com 8 ou mais células produziram maiores (P<0,01) taxas de blastocistos no D7 e D8 do que os embriões com menos de oitos células mostrando seu maior potencial de desenvolvimento, independentemente se foram partenogenéticos ou fecundados. Embriões do grupo Part&#8805;8 apresentaram maior (P<0,05) taxa de blastocistos no D7 (63,6±3,4%) que os FIV&#8805;8 (45,3±8,9%), porém a taxa no D8 foi semelhante (56,7±3,0% e 44,2±8,9% para Part&#8805;8 e FIV&#8805;8, respectivamente; (P<0,05). Não houve diferença (P<0,05) quanto às taxas de blastocistos no D7 e D8 entre embriões com menos de 8 células oriundos da partenogênese ou fecundação. Não houve diferença quanto ao número total de células (92,0±3,4; 102,30±4,8), células apoptóticas (10,8±1,22; 9,5±1,07) e índice apoptótico (11,4±1,27; 9,8±1,8) nos blastocistos partenogenéticos e FIV, respectivamente. Nos embriões com 8 células analisados, houve subexpressão dos genes DNAJB1, HSPA1L, HSF1, GLUT1 nos Part em relação aos FIV, enquanto o HSF2 esteve sobrexpresso nos Part quando comparado aos FIV. Conclui-se que embriões partenogenéticos bovinos possuem diferenças se comparados aos embriões fecundados in vitro quanto à capacidade de desenvolvimento pré-implantacional in vitro e expressão gênica, o que pode limitar o uso da partenogênese em estudos sobre desenvolvimento embrionário.
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Aspectos biológicos do desenvolvimento pré- implantacional de embriões bovinos partenogenéticos ou fecundados in vitro / Biological aspects of preimplantation development of parthenogenetic or fertilized in vitro bovine embryos

Miyauchi, Tochimara Aparecida 28 September 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tochimara Aparecida Myauchi Dissertacao.pdf: 1469858 bytes, checksum: d9554237da81a72762ef7629c0dfa1b8 (MD5) Previous issue date: 2012-09-28 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nïvel Superior / Parthenogenesis has been described as an alternative method to produce embryos for studies with embryonic cells, particularly in humans which have a restriction of fertilized embryos. Procedures used in parthenogenesis are also required to produce embryos by somatic cell nuclear transfer in domestic species. However, many biological, cellular and molecular aspects of parthenogenetic embryos are still unknown. This study aimed to compare the kinetics of development, apoptosis rate and gene expression of stress and celular metabolism in bovine parthenogenetic embryos and embryos fertilized in vitro. Oocytes (n = 1541) obtained from slaughterhouse ovaries were matured in vitro and submitted to parthenogenetic activation (4.62 µM ionomycin for 5 min followed by 2 mM 6-DMAP for 4 h) or in vitro fertilization (2 x 106 sperm/mL for 20h with semen from a single departure). 72h postactivation/fertilization (hpaf), embryos (8-cell) were frozen for subsequent analysis of gene expression and another part has been separated into groups of high or low potential of development: Part &#8805; 8 - parthenogenetic embryos with 8 or more cells (high development potential); Part < 8 - embryos less than 8 cells (low development potential); &#8805; 8 IVF - in vitro fertilized embryos with 8 or more cells; and IVF < 8 - embryos with less than 8 cells. Embryos were cultured in CR2aa medium with 2.5% BFS in 5% CO2, 5% O2, 90% N2 at 38.5° C and were evaluated rates of blastocyst 168hpaf (D7) and 196hpaf (D8). 8-cell embryos obtained after 72hpfa were analyzed for gene expression. D8 blastocysts were fixed and subsequently apoptotic index was analyzed by TUNEL. Data were compared by analysis of variance and means by Student Newman Keuls test. Gene expression was evaluated by REST® software. Values are shown as mean ± standard error. Embryos with 8 or more cells produced higher (P < 0.01) blastocysts rates in D7 and D8 compared to embryos with less than eight cells, showing its greatest development potential, regardless if they were parthenogenetic or fertilized. Embryos of Part &#8805; 8 group had higher (P <0.05) blastocyst rate in D7 (63.6 ± 3.4%) than IVF &#8805; 8 (45.3 ± 8.9%), but at D8 rate was similar (56.7 ± 3.0% and 44.2 ± 8.9% for Part &#8805; 8 and IVF &#8805; 8, respectively; P <0.05). There was no difference (P < 0.05) on blastocyst rates at D7 and D8 between embryos with less than 8 cells derived from parthenogenesis or fertilization. There was no difference in total cell number (92.0 ± 3.4, 102.30 ± 4.8), apoptotic cells (10.8 ± 1.22, 9.5 ± 1.07) and apoptotic index (11.4 ± 1.27, 9.8 ± 1.8) for parthenogenetic and IVF blastocysts, respectively. In 8-cell embryos analyzed, there was a subexpression of genes DNAJB1, HSPA1L, HSF1 and GLUT1 for Part in relation to FIV, while HSF2 was overexpressed in Part compared to FIV. In conclusion, bovine parthenogenetic embryos differ to embryos fertilized in vitro in hability of preimplantation development in vitro and gene expression, which may limit the use of parthenogenesis in studies of embryonic development. / A partenogênese tem sido descrita como um método alternativo para produzir embriões para estudos com células embrionárias, principalmente em humanos para os quais existe a restrição do uso de embriões fecundados. Procedimentos utilizados na partenogênese são também necessários para se produzir embriões por transferência nuclear com células somáticas nas espécies domésticas. Contudo, muitos aspectos biológicos, celulares e moleculares dos embriões partenogenéticos ainda são desconhecidos. Este estudo objetivou comparar a cinética do desenvolvimento, índice de apoptose e expressão de genes de estresse e metabolismo celular em embriões bovinos partenogenéticos e embriões fecundados in vitro. Oócitos (n=1541) obtidos de ovários de matadouro foram maturados in vitro e submetidos à ativação partenogenética (4,62 µM ionomicina por 5 min seguido de 2 mM 6-DMAP por 4h) ou fecundação in vitro (2 x 106 espermatozoides/ml por 20h, com sêmen de uma única partida). Com 72h pós-ativação/fecundação (hpaf) parte dos embriões (8 células) foram congelados para posterior análise da expressão gênica e outra parte foi separada em grupos de alto ou baixo potencial de desenvolvimento: Part&#8805;8 - embriões partenogenéticos com 8 ou mais células (alto potencial de desenvolvimento); Part<8 - embriões com menos de 8 células (baixo potencial de desenvolvimento); FIV&#8805;8 - embriões fecundados in vitro com 8 ou mais células; e FIV<8: embriões com menos de 8 células. Os embriões foram cultivados em meio CR2aa com 2,5% SFB em 5%CO2, 5%O2, 90% N2 a 38,5ºC e avaliadas as taxas de blastocistos com 168hpaf (D7) e 196hpaf (D8). Embriões com 8 células obtidos após 72hpfa foram analisados quanto à expressão gênica. Blastocistos em D8 foram fixados e posteriormente foram avaliados pela técnica de TUNEL o índice apoptótico. Os dados foram comparados por análise de variância e as médias por teste de Student Newman Keuls. A expressão gênica foi avaliada pelo software REST®. Os valores são mostrados como média±erro padrão. Embriões com 8 ou mais células produziram maiores (P<0,01) taxas de blastocistos no D7 e D8 do que os embriões com menos de oitos células mostrando seu maior potencial de desenvolvimento, independentemente se foram partenogenéticos ou fecundados. Embriões do grupo Part&#8805;8 apresentaram maior (P<0,05) taxa de blastocistos no D7 (63,6±3,4%) que os FIV&#8805;8 (45,3±8,9%), porém a taxa no D8 foi semelhante (56,7±3,0% e 44,2±8,9% para Part&#8805;8 e FIV&#8805;8, respectivamente; (P<0,05). Não houve diferença (P<0,05) quanto às taxas de blastocistos no D7 e D8 entre embriões com menos de 8 células oriundos da partenogênese ou fecundação. Não houve diferença quanto ao número total de células (92,0±3,4; 102,30±4,8), células apoptóticas (10,8±1,22; 9,5±1,07) e índice apoptótico (11,4±1,27; 9,8±1,8) nos blastocistos partenogenéticos e FIV, respectivamente. Nos embriões com 8 células analisados, houve subexpressão dos genes DNAJB1, HSPA1L, HSF1, GLUT1 nos Part em relação aos FIV, enquanto o HSF2 esteve sobrexpresso nos Part quando comparado aos FIV. Conclui-se que embriões partenogenéticos bovinos possuem diferenças se comparados aos embriões fecundados in vitro quanto à capacidade de desenvolvimento pré-implantacional in vitro e expressão gênica, o que pode limitar o uso da partenogênese em estudos sobre desenvolvimento embrionário.
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Aspectos biológicos do desenvolvimento pré- implantacional de embriões bovinos partenogenéticos ou fecundados in vitro / Biological aspects of preimplantation development of parthenogenetic or fertilized in vitro bovine embryos

Miyauchi, Tochimara Aparecida 28 September 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TochimaraAparecidaMiyauchi-dissertacao.pdf: 849651 bytes, checksum: ef29d9bc544c7cef9bb8b27b98b198ea (MD5) Previous issue date: 2012-09-28 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nïvel Superior / Parthenogenesis has been described as an alternative method to produce embryos for studies with embryonic cells, particularly in humans which have a restriction of fertilized embryos. Procedures used in parthenogenesis are also required to produce embryos by somatic cell nuclear transfer in domestic species. However, many biological, cellular and molecular aspects of parthenogenetic embryos are still unknown. This study aimed to compare the kinetics of development, apoptosis rate and gene expression of stress and celular metabolism in bovine parthenogenetic embryos and embryos fertilized in vitro. Oocytes (n = 1541) obtained from slaughterhouse ovaries were matured in vitro and submitted to parthenogenetic activation (4.62 µM ionomycin for 5 min followed by 2 mM 6-DMAP for 4 h) or in vitro fertilization (2 x 106 sperm/mL for 20h with semen from a single departure). 72h postactivation/fertilization (hpaf), embryos (8-cell) were frozen for subsequent analysis of gene expression and another part has been separated into groups of high or low potential of development: Part &#8805; 8 - parthenogenetic embryos with 8 or more cells (high development potential); Part < 8 - embryos less than 8 cells (low development potential); &#8805; 8 IVF - in vitro fertilized embryos with 8 or more cells; and IVF < 8 - embryos with less than 8 cells. Embryos were cultured in CR2aa medium with 2.5% BFS in 5% CO2, 5% O2, 90% N2 at 38.5° C and were evaluated rates of blastocyst 168hpaf (D7) and 196hpaf (D8). 8-cell embryos obtained after 72hpfa were analyzed for gene expression. D8 blastocysts were fixed and subsequently apoptotic index was analyzed by TUNEL. Data were compared by analysis of variance and means by Student Newman Keuls test. Gene expression was evaluated by REST® software. Values are shown as mean ± standard error. Embryos with 8 or more cells produced higher (P < 0.01) blastocysts rates in D7 and D8 compared to embryos with less than eight cells, showing its greatest development potential, regardless if they were parthenogenetic or fertilized. Embryos of Part &#8805; 8 group had higher (P <0.05) blastocyst rate in D7 (63.6 ± 3.4%) than IVF &#8805; 8 (45.3 ± 8.9%), but at D8 rate was similar (56.7 ± 3.0% and 44.2 ± 8.9% for Part &#8805; 8 and IVF &#8805; 8, respectively; P <0.05). There was no difference (P < 0.05) on blastocyst rates at D7 and D8 between embryos with less than 8 cells derived from parthenogenesis or fertilization. There was no difference in total cell number (92.0 ± 3.4, 102.30 ± 4.8), apoptotic cells (10.8 ± 1.22, 9.5 ± 1.07) and apoptotic index (11.4 ± 1.27, 9.8 ± 1.8) for parthenogenetic and IVF blastocysts, respectively. In 8-cell embryos analyzed, there was a subexpression of genes DNAJB1, HSPA1L, HSF1 and GLUT1 for Part in relation to FIV, while HSF2 was overexpressed in Part compared to FIV. In conclusion, bovine parthenogenetic embryos differ to embryos fertilized in vitro in hability of preimplantation development in vitro and gene expression, which may limit the use of parthenogenesis in studies of embryonic development. / A partenogênese tem sido descrita como um método alternativo para produzir embriões para estudos com células embrionárias, principalmente em humanos para os quais existe a restrição do uso de embriões fecundados. Procedimentos utilizados na partenogênese são também necessários para se produzir embriões por transferência nuclear com células somáticas nas espécies domésticas. Contudo, muitos aspectos biológicos, celulares e moleculares dos embriões partenogenéticos ainda são desconhecidos. Este estudo objetivou comparar a cinética do desenvolvimento, índice de apoptose e expressão de genes de estresse e metabolismo celular em embriões bovinos partenogenéticos e embriões fecundados in vitro. Oócitos (n=1541) obtidos de ovários de matadouro foram maturados in vitro e submetidos à ativação partenogenética (4,62 µM ionomicina por 5 min seguido de 2 mM 6-DMAP por 4h) ou fecundação in vitro (2 x 106 espermatozoides/ml por 20h, com sêmen de uma única partida). Com 72h pós-ativação/fecundação (hpaf) parte dos embriões (8 células) foram congelados para posterior análise da expressão gênica e outra parte foi separada em grupos de alto ou baixo potencial de desenvolvimento: Part&#8805;8 - embriões partenogenéticos com 8 ou mais células (alto potencial de desenvolvimento); Part<8 - embriões com menos de 8 células (baixo potencial de desenvolvimento); FIV&#8805;8 - embriões fecundados in vitro com 8 ou mais células; e FIV<8: embriões com menos de 8 células. Os embriões foram cultivados em meio CR2aa com 2,5% SFB em 5%CO2, 5%O2, 90% N2 a 38,5ºC e avaliadas as taxas de blastocistos com 168hpaf (D7) e 196hpaf (D8). Embriões com 8 células obtidos após 72hpfa foram analisados quanto à expressão gênica. Blastocistos em D8 foram fixados e posteriormente foram avaliados pela técnica de TUNEL o índice apoptótico. Os dados foram comparados por análise de variância e as médias por teste de Student Newman Keuls. A expressão gênica foi avaliada pelo software REST®. Os valores são mostrados como média±erro padrão. Embriões com 8 ou mais células produziram maiores (P<0,01) taxas de blastocistos no D7 e D8 do que os embriões com menos de oitos células mostrando seu maior potencial de desenvolvimento, independentemente se foram partenogenéticos ou fecundados. Embriões do grupo Part&#8805;8 apresentaram maior (P<0,05) taxa de blastocistos no D7 (63,6±3,4%) que os FIV&#8805;8 (45,3±8,9%), porém a taxa no D8 foi semelhante (56,7±3,0% e 44,2±8,9% para Part&#8805;8 e FIV&#8805;8, respectivamente; (P<0,05). Não houve diferença (P<0,05) quanto às taxas de blastocistos no D7 e D8 entre embriões com menos de 8 células oriundos da partenogênese ou fecundação. Não houve diferença quanto ao número total de células (92,0±3,4; 102,30±4,8), células apoptóticas (10,8±1,22; 9,5±1,07) e índice apoptótico (11,4±1,27; 9,8±1,8) nos blastocistos partenogenéticos e FIV, respectivamente. Nos embriões com 8 células analisados, houve subexpressão dos genes DNAJB1, HSPA1L, HSF1, GLUT1 nos Part em relação aos FIV, enquanto o HSF2 esteve sobrexpresso nos Part quando comparado aos FIV. Conclui-se que embriões partenogenéticos bovinos possuem diferenças se comparados aos embriões fecundados in vitro quanto à capacidade de desenvolvimento pré-implantacional in vitro e expressão gênica, o que pode limitar o uso da partenogênese em estudos sobre desenvolvimento embrionário.
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Efeito da pré-maturação sobre o desenvolvimento embrionário de oócitos submetidos à ativação partenogenética e transferência de núcleo / Effect of pre-maturation on embryo development of oocytes submitted to parthenogenetic activation and nuclear transfer

Tiago Henrique Camara De Bem 03 June 2009 (has links)
As taxas de produção embrionária tanto da FIV (30-40%) como da TN (23%) ainda estão aquém do esperado. Desta forma, a pré-maturação com inibidores do ciclo celular é uma das alternativas que vem sendo estudada para aumentar a competência dos oócitos utilizados na PIV, na tentativa de otimizar o sucesso das biotécnicas. Sabe-se que neurotrofinas desempenham funções no sistema reprodutor. O BDNF é um exemplo de neurotrofina que parece estar relacionada com a maturação dos oócitos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi de aperfeiçoar a pré-maturação e a maturação in vitro de oócitos bovinos submetidos posteriormente à ativação partenogenética, visando seu uso na biotécnica de transferência de núcleo. Oócitos bovinos foram submetidos à maturação na presença (MIV/BD) ou ausência (MIV) de BDNF ou pré-maturados com BLI e suplementados (BL/BD) ou não (BL) com a neurotrofina. Posteriormente foram avaliados quanto à taxa de maturação (metáfase II), ativação (formação de prónúcleo) e desenvolvimento embrionário (produção e qualidade dos blastocistos). Não houve diferença (P>0,05) entre taxas de MII após a maturação com ou sem BDNF. Porém, o grupo pré-maturado e suplementado (BL/BD n=73; 91,2%) apresentou maior taxa de MII (P<0,05) em relação ao grupo não suplementado (BL n=66; 76,7%). Oócitos maturados nas mesmas condições foram ativados quimicamente para análise do desenvolvimento embrionário. Os grupos MIV/BD (n=30; 71,4%) e MIV (n=41; 91.1%) apresentaram diferença (P<0,05) em relação à taxa de ativação. Porém, não foi observada diferença quanto aos outros parâmetros do desenvolvimento. Quando os oócitos foram pré-maturados a taxa de clivagem do grupo suplementado (BL/BD: n=227; 65,2%) foi superior (P<0,05) ao grupo não suplementado (BL: n=187; 57,7%), mas não foram observadas diferenças (P>0,05) para os outros parâmetros de desenvolvimento. A qualidade dos embriões ativados também não foi afetada pelos tratamentos. Os grupos submetidos à TN (MIV e BL/BD) apresentaram diferenças (P<0,05) para extrusão do 1°CP (n=639; 63,5% e n=693; 69,5%, respectivamente) e para taxa de fusão (n=345; 72,9% e n=397; 79,2%, respectivamente) não havendo diferença para nenhum outro parâmetro avaliado. A qualidade dos embriões clonados também foi avaliada e não foi observada diferença. Após a transferência dos embriões dos grupos MIV (n=28) e BL/BD (n=26) para as receptoras, os grupos foram capazes de produzir gestação avançadas (10,7 e 11,5%, respectivamente) de forma similar (P>0,05). Com base nestes resultados podemos concluir que a suplementação, tanto da maturação como a pré-maturação não causa prejuízo no posterior desenvolvimento embrionário. Ainda, embriões clonados produzidos a partir de oócitos bloqueados são capazes de estabelecer gestações avançadas em bovinos. / Embryo production rates obtained from both IVF (30-40%) and NT (23%) are still below the expected values. Therefore, oocyte pre-maturation using cell cycle inhibitors is one of the alternatives which has been studied to increase the competence of oocytes used for IVP, as an attempt to optimize the success rates of these biotechniques. Neurotrophins are known to play several roles in the reproductive system. BDNF is an example of a neurotrophin that seems to be related to oocyte maturation. Therefore, the objective of this study was to improve techniques of pre-maturation and maturation of bovine oocytes submitted to parthenogenetic activation, aiming for its use on cloning by nuclear transfer. Bovine oocytes were submitted to maturation either in presence (IVM/BD) or absence (IVM) of BDNF or pre-matured with BLI and supplemented (BL/BD) or not (BL) with the neurotrophin. Groups were evaluated for maturation rates (metaphase II), activation (pro-nucleus formation) and embryo development (blastocyst formation rate and quality). There was no difference (P>0.05) in MII rate after the maturation with or without BDNF. However, pre-maturation in the supplemented group (BL/BD, n=73; 91.2%) resulted in higher MII rate (P<0.05) when compared with the nonsupplemented group (BL, n=66; 76.7%). Oocytes which were matured under the same conditions were also activated chemically for embryonic development analysis. Activation rates were different (P<0.05) from IVM/BD groups (n=30; 71.4%) and IVM (n=41; 91.1%). However, no difference were observed for development parameters. When the oocytes were prematured, cleavage rates in the supplemented group were superior (P<0.05) than non supplemented group (BL/BD: n=227; 65.2%) and (BL: n=187; 57.7%), but no difference was observed for other developmental parameters. Embryo quality was also evaluated and no difference was observed between treatments. Groups submitted to NT (IVM and BL/BD) differed regarding (P<0.05) the 1stPB extrusion (n=639; 63.5% and n=693; 69.5%, respectively) and fusion rate (n=345; 72.9% and n=397; 79.2%, respectively), but did not present differences for other evaluated parameters. Embryo quality was evaluated again and no differences were observed. After the embryos were transferred to recipient cows, groups IVM (n=3; 10.7%) and BL/BD (n=3; 11.5%) were capable of producing advanced gestations at similar rates (P>0.05). Based on these results, it may be concluded that supplementation of both maturation and pre-maturation does not impair embryonic development. Additionally, cloned embryos produced from blocked oocytes are able to establish advanced gestation in cattle.
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Ativação partenogenética de oócitos bovinos jovens com ionomicina e 6-dimetilaminopurina associado ou não ao estrôncio / Parthenogenetic activation of young bovine oocytes with ionomycin and 6-dimethylaminopurine associated or not with strontium

Patrícia Marafon Porciuncula 05 October 2007 (has links)
Tendo em vista a possibilidade da associação de agentes ativadores aliada à influência da idade do oócito no desenvolvimento embrionário, a proposta deste trabalho foi estudar a relação entre o envelhecimento do oócito e a ativação partenogenética. Para tal, oócitos bovinos foram maturados in vitro por um período de 22 h (jovens) e 28 h (envelhecidos). Em seguida, os dois grupos de oócitos foram ativados com os tratamentos: ID3: ionomicina (5 µM por 5 min) + 6DMAP (2 mM por 3 h de incubação); ID6: ionomicina (5 µM por 5 min) + 6DMAP (2 mM por 6 h de incubação); IDS: ionomicina + associação 6DMAP (2 mM) e estrôncio (20 mM; SrCl2) por 6 h e IDSS: ionomicina + (6DMAP+Sr) nas primeiras 3 h, seguido de lavagem e incubação com estrôncio (Sr2+) isoladamente por mais 3 h de incubação. O grupo controle foi cultivado na ausência de qualquer agente ativador (ativação espontânea). Após a ativação os oócitos foram avaliados quanto a: 1) taxa de ativação (formação de pronúcleo às 12 hpa); 2) atividade do fator promotor de maturação (MPF) e proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK) nos intervalos de 5 min, 3 h, 6 h e 10 h; 3) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem às 48 h, dia 7 e 9 taxas de blastocisto e eclosão); 4) qualidade dos embriões (dia 9 pelo número total de células, apoptose e expressão de interferon-t). Em geral, oócitos jovens apresentaram menor taxa de ativação e maior atividade de MPF e MAPK em relação aos envelhecidos. No entanto, a incubação dos oócitos em 6DMAP por 6 h permitiu taxas semelhantes aos envelhecidos com pequeno prejuízo em número de células, sem efeitos em outros critérios de qualidade do embrião. Os dados sugerem possíveis aplicações destes resultados de maneira a contribuir para a TN com flexibilidade de horários e produção de embriões de boa qualidade. / Considering the possibility of the combination of different activating agents associated to the influence of oocyte ageing on embryo development, the purpose of this work to study the relationship between oocyte ageing and parthenogenetic activation. Bovine oocytes were in vitro maturated for 22 (young) and 28 h (aged). Next, both groups of oocytes were activated using the following treatments: ID3: ionomycin (5 µM for 5 min) + 6DMAP (2 mM for 3 h); ID6: ionomycin (5 µM for 5 min) + 6DMAP (2 mM for 6 h); IDS: ionomicyn + 6DMAP (2 mM) and strontium (20 mM; SrCl2) for 6 h and IDSS: ionomicyn + (6DMAP+Sr2+) for the first 3h, followed by incubation with Sr2+ alone for another 3 h. The control group was cultured in the absence of any activating agents (spontaneous activation). After activation, the oocytes were evaluated for: 1) activation rate (pronuclei formation at 12 hpa); 2) activity of maturation promoting factor (MPF) and mitogen activated protein kinase (MAPK) at 5 min, 3 h, 6 h and 10 hpa; 3) embryo development (cleavage rate at 48 h and blastocyst and hatching rates on days 7 and 9); 4) embryo quality (day 9 regarding total cell numbers, apoptosis and interferon-t expression). In general, young oocytes showed lower activation rates and higher MPF and MAPK activity when compared with aged oocytes. However, incubation of the oocytes with 6DMAP for 6 h allowed development rates similar to aged oocytes with a small decrease in total cell number, but without effects on other criteria of embryo quality. The data suggest a possible application of these results in such a way to contribute for timing flexibilization in NT experiments and production of good quality embryos.
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Efeito da pré-maturação sobre o desenvolvimento embrionário de oócitos submetidos à ativação partenogenética e transferência de núcleo / Effect of pre-maturation on embryo development of oocytes submitted to parthenogenetic activation and nuclear transfer

De Bem, Tiago Henrique Camara 03 June 2009 (has links)
As taxas de produção embrionária tanto da FIV (30-40%) como da TN (23%) ainda estão aquém do esperado. Desta forma, a pré-maturação com inibidores do ciclo celular é uma das alternativas que vem sendo estudada para aumentar a competência dos oócitos utilizados na PIV, na tentativa de otimizar o sucesso das biotécnicas. Sabe-se que neurotrofinas desempenham funções no sistema reprodutor. O BDNF é um exemplo de neurotrofina que parece estar relacionada com a maturação dos oócitos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi de aperfeiçoar a pré-maturação e a maturação in vitro de oócitos bovinos submetidos posteriormente à ativação partenogenética, visando seu uso na biotécnica de transferência de núcleo. Oócitos bovinos foram submetidos à maturação na presença (MIV/BD) ou ausência (MIV) de BDNF ou pré-maturados com BLI e suplementados (BL/BD) ou não (BL) com a neurotrofina. Posteriormente foram avaliados quanto à taxa de maturação (metáfase II), ativação (formação de prónúcleo) e desenvolvimento embrionário (produção e qualidade dos blastocistos). Não houve diferença (P>0,05) entre taxas de MII após a maturação com ou sem BDNF. Porém, o grupo pré-maturado e suplementado (BL/BD n=73; 91,2%) apresentou maior taxa de MII (P<0,05) em relação ao grupo não suplementado (BL n=66; 76,7%). Oócitos maturados nas mesmas condições foram ativados quimicamente para análise do desenvolvimento embrionário. Os grupos MIV/BD (n=30; 71,4%) e MIV (n=41; 91.1%) apresentaram diferença (P<0,05) em relação à taxa de ativação. Porém, não foi observada diferença quanto aos outros parâmetros do desenvolvimento. Quando os oócitos foram pré-maturados a taxa de clivagem do grupo suplementado (BL/BD: n=227; 65,2%) foi superior (P<0,05) ao grupo não suplementado (BL: n=187; 57,7%), mas não foram observadas diferenças (P>0,05) para os outros parâmetros de desenvolvimento. A qualidade dos embriões ativados também não foi afetada pelos tratamentos. Os grupos submetidos à TN (MIV e BL/BD) apresentaram diferenças (P<0,05) para extrusão do 1°CP (n=639; 63,5% e n=693; 69,5%, respectivamente) e para taxa de fusão (n=345; 72,9% e n=397; 79,2%, respectivamente) não havendo diferença para nenhum outro parâmetro avaliado. A qualidade dos embriões clonados também foi avaliada e não foi observada diferença. Após a transferência dos embriões dos grupos MIV (n=28) e BL/BD (n=26) para as receptoras, os grupos foram capazes de produzir gestação avançadas (10,7 e 11,5%, respectivamente) de forma similar (P>0,05). Com base nestes resultados podemos concluir que a suplementação, tanto da maturação como a pré-maturação não causa prejuízo no posterior desenvolvimento embrionário. Ainda, embriões clonados produzidos a partir de oócitos bloqueados são capazes de estabelecer gestações avançadas em bovinos. / Embryo production rates obtained from both IVF (30-40%) and NT (23%) are still below the expected values. Therefore, oocyte pre-maturation using cell cycle inhibitors is one of the alternatives which has been studied to increase the competence of oocytes used for IVP, as an attempt to optimize the success rates of these biotechniques. Neurotrophins are known to play several roles in the reproductive system. BDNF is an example of a neurotrophin that seems to be related to oocyte maturation. Therefore, the objective of this study was to improve techniques of pre-maturation and maturation of bovine oocytes submitted to parthenogenetic activation, aiming for its use on cloning by nuclear transfer. Bovine oocytes were submitted to maturation either in presence (IVM/BD) or absence (IVM) of BDNF or pre-matured with BLI and supplemented (BL/BD) or not (BL) with the neurotrophin. Groups were evaluated for maturation rates (metaphase II), activation (pro-nucleus formation) and embryo development (blastocyst formation rate and quality). There was no difference (P>0.05) in MII rate after the maturation with or without BDNF. However, pre-maturation in the supplemented group (BL/BD, n=73; 91.2%) resulted in higher MII rate (P<0.05) when compared with the nonsupplemented group (BL, n=66; 76.7%). Oocytes which were matured under the same conditions were also activated chemically for embryonic development analysis. Activation rates were different (P<0.05) from IVM/BD groups (n=30; 71.4%) and IVM (n=41; 91.1%). However, no difference were observed for development parameters. When the oocytes were prematured, cleavage rates in the supplemented group were superior (P<0.05) than non supplemented group (BL/BD: n=227; 65.2%) and (BL: n=187; 57.7%), but no difference was observed for other developmental parameters. Embryo quality was also evaluated and no difference was observed between treatments. Groups submitted to NT (IVM and BL/BD) differed regarding (P<0.05) the 1stPB extrusion (n=639; 63.5% and n=693; 69.5%, respectively) and fusion rate (n=345; 72.9% and n=397; 79.2%, respectively), but did not present differences for other evaluated parameters. Embryo quality was evaluated again and no differences were observed. After the embryos were transferred to recipient cows, groups IVM (n=3; 10.7%) and BL/BD (n=3; 11.5%) were capable of producing advanced gestations at similar rates (P>0.05). Based on these results, it may be concluded that supplementation of both maturation and pre-maturation does not impair embryonic development. Additionally, cloned embryos produced from blocked oocytes are able to establish advanced gestation in cattle.
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Ativação partenogenética de oócitos bovinos jovens com ionomicina e 6-dimetilaminopurina associado ou não ao estrôncio / Parthenogenetic activation of young bovine oocytes with ionomycin and 6-dimethylaminopurine associated or not with strontium

Porciuncula, Patrícia Marafon 05 October 2007 (has links)
Tendo em vista a possibilidade da associação de agentes ativadores aliada à influência da idade do oócito no desenvolvimento embrionário, a proposta deste trabalho foi estudar a relação entre o envelhecimento do oócito e a ativação partenogenética. Para tal, oócitos bovinos foram maturados in vitro por um período de 22 h (jovens) e 28 h (envelhecidos). Em seguida, os dois grupos de oócitos foram ativados com os tratamentos: ID3: ionomicina (5 µM por 5 min) + 6DMAP (2 mM por 3 h de incubação); ID6: ionomicina (5 µM por 5 min) + 6DMAP (2 mM por 6 h de incubação); IDS: ionomicina + associação 6DMAP (2 mM) e estrôncio (20 mM; SrCl2) por 6 h e IDSS: ionomicina + (6DMAP+Sr) nas primeiras 3 h, seguido de lavagem e incubação com estrôncio (Sr2+) isoladamente por mais 3 h de incubação. O grupo controle foi cultivado na ausência de qualquer agente ativador (ativação espontânea). Após a ativação os oócitos foram avaliados quanto a: 1) taxa de ativação (formação de pronúcleo às 12 hpa); 2) atividade do fator promotor de maturação (MPF) e proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK) nos intervalos de 5 min, 3 h, 6 h e 10 h; 3) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem às 48 h, dia 7 e 9 taxas de blastocisto e eclosão); 4) qualidade dos embriões (dia 9 pelo número total de células, apoptose e expressão de interferon-t). Em geral, oócitos jovens apresentaram menor taxa de ativação e maior atividade de MPF e MAPK em relação aos envelhecidos. No entanto, a incubação dos oócitos em 6DMAP por 6 h permitiu taxas semelhantes aos envelhecidos com pequeno prejuízo em número de células, sem efeitos em outros critérios de qualidade do embrião. Os dados sugerem possíveis aplicações destes resultados de maneira a contribuir para a TN com flexibilidade de horários e produção de embriões de boa qualidade. / Considering the possibility of the combination of different activating agents associated to the influence of oocyte ageing on embryo development, the purpose of this work to study the relationship between oocyte ageing and parthenogenetic activation. Bovine oocytes were in vitro maturated for 22 (young) and 28 h (aged). Next, both groups of oocytes were activated using the following treatments: ID3: ionomycin (5 µM for 5 min) + 6DMAP (2 mM for 3 h); ID6: ionomycin (5 µM for 5 min) + 6DMAP (2 mM for 6 h); IDS: ionomicyn + 6DMAP (2 mM) and strontium (20 mM; SrCl2) for 6 h and IDSS: ionomicyn + (6DMAP+Sr2+) for the first 3h, followed by incubation with Sr2+ alone for another 3 h. The control group was cultured in the absence of any activating agents (spontaneous activation). After activation, the oocytes were evaluated for: 1) activation rate (pronuclei formation at 12 hpa); 2) activity of maturation promoting factor (MPF) and mitogen activated protein kinase (MAPK) at 5 min, 3 h, 6 h and 10 hpa; 3) embryo development (cleavage rate at 48 h and blastocyst and hatching rates on days 7 and 9); 4) embryo quality (day 9 regarding total cell numbers, apoptosis and interferon-t expression). In general, young oocytes showed lower activation rates and higher MPF and MAPK activity when compared with aged oocytes. However, incubation of the oocytes with 6DMAP for 6 h allowed development rates similar to aged oocytes with a small decrease in total cell number, but without effects on other criteria of embryo quality. The data suggest a possible application of these results in such a way to contribute for timing flexibilization in NT experiments and production of good quality embryos.
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Interação núcleo-citoplasmática em embriões e expressão de genes "imprinted" em fetos bovinos produzidos in vivo, in vitro e partenogenéticos /

Niciura, Simone Cristina Méo. January 2005 (has links)
Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão da meiose, com progressão do estádio de Vesícula Germinativa (GV) da Prófase I até a Metáfase II (MII), e inclui todos os eventos necessários para que o oócito expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Para avaliarmos a eficiência da maturação in vitro (MIV), utilizamos oócitos classificados em viáveis (graus I, II e III) e inviáveis (atrésico e desnudo), e acompanhamos a progressão nuclear e a distribuição dos grânulos corticais (GC) como indício de maturação citoplasmática, após MIV em TCM 199 com soro fetal bovino, hormônios, antibiótico e piruvato, por 24h em 5% de CO2 em ar. Maturação nuclear (78,4-87,8%) e citoplasmática (GC periféricos; 67,2-79,3%) foram semelhantes entre as diferentes classes de oócitos e apresentaramse como eventos independentes. Para o acompanhamento dos eventos desencadeados pelo espermatozóide, avaliamos a dinâmica nuclear e de microtúbulos, em intervalos de 2h, após fecundação in vitro (FIV), em meio TALP com heparina, PHE e sêmen preparado em gradiente de Percoll. Observamos que o estádio de MII foi predominante de 2 a 8h; MII e Anáfase/Telófase (A/T) predominaram às 10h; MII, A/T e estádio pronuclear (PN) de 14 a 16h; e PN a partir de 18h. A penetração do espermatozóide ocorreu após 4h da inseminação dos oócitos; a diferenciação dos PN 14 masculino e feminino pelo tamanho foi possível de 14 a 18h e a singamia ocorreu a partir de 24h. O período de 10h pode ser suficiente para que a FIV seja efetiva em oócitos bovinos, nas condições aqui descritas. / Abstract: We aimed to evaluate events involved in in vitro maturation, fertilization and development, and parthenogenetic activation of bovine oocytes assessed by nuclear-cytoplasmic interaction and gene expression. Oocyte morphological selection did not affect nuclear maturation (78.4-87.8%) and cytoplasmic cortical granule distribution (67.2-79.3%). Following nuclear and microtubular dynamics after fertilization (IVF), we observed sperm penetration 4h after insemination; male and female pronuclei differentiation by size from 14 to 18h; syngamy after 24h; and sufficient co-incubation of spermatozoa and oocytes for 10h. Pronuclear transfer to study the interaction between nucleus (N) and cytoplasm (C) in parthenogenetic embryos produced by ionomycin followed by strontium (S) or 6-DMAP (D) was assessed by cleavage, eight-cell, and blastocyst development rates: CSND (76.5, 36.4, and 6.8%) and CDNS (69.5, 25.0, and 4.9%). S cytoplasm promoted dominant effect on D nucleus. Higher rates of developmental arrest up to the eight-cell stage were observed by the combination of cytoplasm and nucleus produced by the two different activation treatments. We recovered parthenogenetic D fetuses on Day 35, which were small but normal in formation and in appearance of chorio-alantoic membranes. Genomic imprinting of IGF2 was observed, but XIST was maternally expressed in extra-embryonic tissues. In vitro culture promoted higher expression of IGF2 and H19 genes and also increased IGF2/IGF2r ratio in IVF embryos compared to in vivo produced ones. / Doutor

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