Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-03T17:25:03Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_IngridOliveiraSilva.pdf: 1065354 bytes, checksum: 5c704b05ad9fbdc93257f3bf700ca39a (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-01-22T13:45:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_IngridOliveiraSilva.pdf: 1065354 bytes, checksum: 5c704b05ad9fbdc93257f3bf700ca39a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-01-22T13:45:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_IngridOliveiraSilva.pdf: 1065354 bytes, checksum: 5c704b05ad9fbdc93257f3bf700ca39a (MD5) / O presente trabalho teve o objetivo de padronizar um protocolo de pré-maturação, onde complexos cumulus oophorus (COCs- do inglês cumulus oocyte complex) bovinos imaturos são co-cultivados com hemi-secções foliculares (HS) em meio definido (α-MEM+PVA). No experimento 1 foi avaliado, o efeito deste co-cultivo pelo período de 24 horas na manutenção do estágio imaturo dos COCs. Os grupos experimentais avaliados foram: G1=TCM- 199+SFB+COCs; G2=TCM-199+SFB+HS+COCs; G3=α-MEM+PVA+COCs; G4=α- MEM+PVA+HS+COCs. No experimento 2, foi feita a avaliação do potencial de reversibilidade do processo inibitório após a pré-maturação, cultivando os COCs previamente pré-maturados em meio de maturação padrão (TCM-199+SFB). Os meios de cultivo destes experimentos foram armazenados a –20° C para posterior dosagem dos hormônios estradiol (E2) e progesterona (P4) com a utilização de kits de radioimunoensaio. Em média 4 COCs de cada tratamento dos experimentos 1 e 2 foram processados para análise da maturação citoplasmática ao microscópio eletrônico de transmissão. Os resultados do experimento 1 mostram que, os tratamentos G2, G3 e G4 foram efetivos na inibição da progressão da meiose, com respectivamente 81,2; 74,0 e 96,3% dos COCs imaturos. O tratamento G1 (controle) apresentou ao final do tempo de cultivo 83,1% de COCs maduros; P<0,05. No experimento 2, somente os grupos G1 e G3 apresentaram mais de 80% de oócitos maduros ao final das 24 horas de cultura em meio padrão. Os grupos G2 e G4 apresentaram apenas 29,1 e 16,3% respectivamente dos COCs maduros ao final do cultivo; P<0,05. A dosagem dos hormônios esteróides mostrou no experimento 1, que o grupo G3 apresentou a maior produção de E2 (2444,24 pg/mL) e menor produção de P4 (3,47 ng/mL); P<0,0001. A produção de P4 foi máxima no grupo G2 (77,87 ng/mL). A presença das HS promoveu o aumento da produção deste hormônio nos grupos G2 e G4. No experimento 2, a concentração de E2 foi maior no grupo pré-maturado em meio definido, assim como a concentração de P4, que foi significativamente maior neste tratamento (G3), 42,82 ng/mL; P< 0,0032. A análise ultraestrutural dos COCs mostrou que a presença das HS (grupos G2 e G4) provoca a morte destes ainda no período de pré-maturação. No grupo G3, foi observado que o meio de cultivo α-MEM+PVA promoveu o início da maturação citoplasmática durante a pré-maturação. No experimento 2, este processo foi completado após o cultivo em meio de maturação padrão. Conclui-se portanto que o meio de cultura α-MEM+PVA fornece um ambiente adequado para que os COCs sofram a pré-maturação, já que a relação E2:P4 neste sistema é condizente com a fase em que os COCs se encontram, além de que este meio propicia uma alta taxa de inibição da maturação nuclear seguida de uma grande porcentagem de reversão desta inibição. Outro fato importante foi que a maturação citoplasmática foi iniciada ainda no período de prématuração, e chegou a termo durante a maturação in vitro. O co-cultivo com HS, no entanto, não gerou resultados promissores. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study aimed to standardize a physiological protocol of pre- maturation, where immature bovine cumulus oocyte complex (COCs) are co-cultured with follicular hemissections (HS) in defined medium (α-MEM + PVA). In the first experiment it was evaluated, the effect of this co-culture for the period of 24 hours in the maintenance of COCs’ immature stage. The following experimental groups evaluated were: G1=TCM-199 +FCS+COCs; G2=TCM- 199+FCS+HS+COCs; G3=α-MEM+PVA+COCs; G4=α-MEM+PVA+HS+COCs. The experiment 2 was performed to assess the reversibility potential of the inhibitory process after the pre-maturation. COCs previously pre-matured were cultured in standard medium of maturation (TCM-199 + SFB). The culture medium of these experiments were stored at -20° C for later dosage of hormones estradiol (E2) and progesterone (P4) with radioimmunoassay kits. On average 4 COCs of each treatment of experiments 1 and 2 were processed for cytoplasmic maturation analysis at the transmission electron microscope. The results of the experiment 1 show that the treatments G2, G3 and G4 were effective in maintain meiotic arrest, with 81.2, 74.0 and 96.3% respectively of immature COCs. Treatment G1 (control) showed at the end of culture 83.1% of mature COCs, P <0.05. In experiment 2, only the groups G1 and G3 showed more than 80% of mature oocytes at the end of 24 hours of culture in the medium standard. The groups G2 and G4 had only 29.1 and 16.3% respectively of the mature COCs at the end of the culture, P<0.05. The dosage of steroid hormones in Experiment 1 showed that the G3 had the highest production of E2 (2444.24 pg / mL) and lower production of P4 (3.47 ng / mL), P <0.0001. The production of P4 was the highest in group G2 (77.87 ng / mL). Due the presence of HS there was an increasing production of this hormone in groups G2 and G4. In experiment 2, the concentration of E2 was higher in group pre-matured in defined medium, as well as the concentration of P4, which was significantly higher in this treatment, 42.82 ng / mL, P<0.0032.The ultrastructural analysis of the COCs showed that the presence of HS (groups G2 and G4) causes the cellular death still in the prematuration culture. In group G3, it was observed that the medium α-MEM + PVA promoted the beginning of the cytoplasmic maturation during the pre-maturation. In experiment 2, this process has been completed after culture in standard maturation medium. It comes to the conclusion that the culture α-MEM + PVA provides a suitable environment for the COCs suffer a pre-maturation, as the relationship E2: P4 in this system is consistent with the stage in which the COCs are. In addition, this system provides a high rate of inhibition of nuclear maturation followed by a large percentage of reversal of this inhibition. Another important fact is that the cytoplasmic maturation began still in the prematuration period, and finished during in vitro maturation. The co-culture with HS, didn’t generate promising results.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-07T16:22:11Z No. of bitstreams: 1 2015_MateusNunesDiogenes.pdf: 1103328 bytes, checksum: 8cd40e41b96f59fa3592a60611351199 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-12T15:14:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MateusNunesDiogenes.pdf: 1103328 bytes, checksum: 8cd40e41b96f59fa3592a60611351199 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-12T15:14:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MateusNunesDiogenes.pdf: 1103328 bytes, checksum: 8cd40e41b96f59fa3592a60611351199 (MD5) / O presente estudo visou avaliar o efeito do FGF10 durante a pré-maturação e/ou maturação in vitro (MIV) de ovócitos na produção in vitro de embriões bovinos. No primeiro experimento, os ovócitos foram maturados na presença ou não de FGF10. No segundo experimento, foi avaliado o efeito da suplementação de FGF10 durante a pré-maturação e/ou maturação, utilizando cinco grupos: T1: ovócitos maturados por 22h (controle); T2: ovócitos pré-maturados por 22h e maturados por 22h; T3: ovócitos pré-maturados por 22h e maturados por 22h com FGF10; T4: ovócitos pré-maturados por 22h com FGF10 e maturados por 22h; T5: pré-maturados por 22h com FGF10 e maturados por 22h com FGF10. Em ambos os experimentos foram avaliadas a maturação nuclear, a expansão das células do cumulus, a produção embrionária e a expressão dos genes: KRT8, PLAC8, CD9, PAG2, HSPB1 e MSH6 em embriões no D7 (experimento 1) ou D8 (experimento 2). Os dados de maturação nuclear e desenvolvimento embrionário foram analisados pelo teste do Qui-quadrado, e os da expansão das células do cumulus e expressão gênica por análise de variância, sendo P<0,05 considerado significativo. No primeiro experimento, a suplementação com FGF10 durante a MIV não afetou (P>0,05) nenhum dos parâmetros avaliados. No segundo experimento, após a maturação, a expansão em todos os tratamentos submetidos à pré-maturação, independente da presença de FGF10 (P<0,05), foi menor do que no grupo controle. A presença de FGF10 na pré-maturação/maturação não aumentou a quantidade de embriões sendo a taxa de blastocisto em D7 similar (P>0,05) entre T2 (43,7%), T3 (38,7%), T4 (39,6%) e T5 (47,3%). Entretanto, nos grupos T2 e T5 a taxa de blastocisto no D7 foi similar ao controle (53,4%). Todos os grupos apresentaram taxas de embriões eclodidos do D8 semelhantes. O nível de transcritos para o PLAC8 foi superior no grupo T4 quando comparado ao T1, os demais grupos foram iguais entre si. Já para o gene MSH6, somente foi detecta diferença no nível de transcritos entre os grupos T5 e T1, sendo inferior no T5. Conclui-se que a presença de FGF10 durante a MIV e/ou pré-MIV não tem efeito benéfico na produção e a qualidade dos embriões. Da mesma forma, a pré-maturação, independente da presença do FGF10, afeta a expansão das célullas do cumulus mas não tem efeito na produção embrionária. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study aimed to evaluate the effect of FGF10 during pre-maturation and in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on in vitro embryo production (IVP). In the first experiment oocytes were matured in the presence or not of FGF10. In the second experiment, the effect of FGF10 during prematuration and/or maturation was evaluated using 5 experimental groups: T1: oocytes matured for 22h (control); T2: oocytes prematured for 22h and matured for 22h; T3: oocytes prematured for 22h and matured for 22h with FGF10; T4: oocytes prematured with FGF10 for 22h and matured for 22h; T5: oocytes prematured for 22h with FGF10 and matured for matured 22h with FGF10. In both experiments, nuclear maturation, cumulus cells expansion, embryo production and the relative expression of genes: KRT8, PLAC8, CD9, PAGE2, HSPB1 and MSH6 were evaluated. Data of nuclear maturation and embryo development were analyzed by chi-square test and those of cumulus cells expansion and gene expression by analysis of variance. P <0.05 was considered statistically significant. There was no effect of FGF10 supplementation during IVM on any of the parameters evaluated in the first experiment. On the second experiment after maturation a lower cumulus expansion was observed in all treatments submitted to prematuration, irrespective of FGF10 presence, than the control. The supplementation of prematuration or maturation medium with FGF10 did not cause an increase in embryo production on D7, being the blastocyst rate similar among T2 (43.7%), T3 (38.7%), T4 (39.6%) e T5 (47.3%). However, blastocyst rate was similar between T2, T5 and control (53, 4%). All groups had similar hatching rates on D8. Transcripts level for PLAC8 was higher on T4 compared to T1, and similar for the other groups. For MSH6 gene, differences in transcripts level were only observed between T5 and T1. It can be concluded that presence of FGF10 during IVM and/or prematuration have not affected embryo production or quality. Prematuration, regardless presence of FGF10, affected cumulus expansion but not embryo production.

As taxas de produção embrionária tanto da FIV (30-40%) como da TN (23%) ainda estão aquém do esperado. Desta forma, a pré-maturação com inibidores do ciclo celular é uma das alternativas que vem sendo estudada para aumentar a competência dos oócitos utilizados na PIV, na tentativa de otimizar o sucesso das biotécnicas. Sabe-se que neurotrofinas desempenham funções no sistema reprodutor. O BDNF é um exemplo de neurotrofina que parece estar relacionada com a maturação dos oócitos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi de aperfeiçoar a pré-maturação e a maturação in vitro de oócitos bovinos submetidos posteriormente à ativação partenogenética, visando seu uso na biotécnica de transferência de núcleo. Oócitos bovinos foram submetidos à maturação na presença (MIV/BD) ou ausência (MIV) de BDNF ou pré-maturados com BLI e suplementados (BL/BD) ou não (BL) com a neurotrofina. Posteriormente foram avaliados quanto à taxa de maturação (metáfase II), ativação (formação de prónúcleo) e desenvolvimento embrionário (produção e qualidade dos blastocistos). Não houve diferença (P>0,05) entre taxas de MII após a maturação com ou sem BDNF. Porém, o grupo pré-maturado e suplementado (BL/BD n=73; 91,2%) apresentou maior taxa de MII (P<0,05) em relação ao grupo não suplementado (BL n=66; 76,7%). Oócitos maturados nas mesmas condições foram ativados quimicamente para análise do desenvolvimento embrionário. Os grupos MIV/BD (n=30; 71,4%) e MIV (n=41; 91.1%) apresentaram diferença (P<0,05) em relação à taxa de ativação. Porém, não foi observada diferença quanto aos outros parâmetros do desenvolvimento. Quando os oócitos foram pré-maturados a taxa de clivagem do grupo suplementado (BL/BD: n=227; 65,2%) foi superior (P<0,05) ao grupo não suplementado (BL: n=187; 57,7%), mas não foram observadas diferenças (P>0,05) para os outros parâmetros de desenvolvimento. A qualidade dos embriões ativados também não foi afetada pelos tratamentos. Os grupos submetidos à TN (MIV e BL/BD) apresentaram diferenças (P<0,05) para extrusão do 1°CP (n=639; 63,5% e n=693; 69,5%, respectivamente) e para taxa de fusão (n=345; 72,9% e n=397; 79,2%, respectivamente) não havendo diferença para nenhum outro parâmetro avaliado. A qualidade dos embriões clonados também foi avaliada e não foi observada diferença. Após a transferência dos embriões dos grupos MIV (n=28) e BL/BD (n=26) para as receptoras, os grupos foram capazes de produzir gestação avançadas (10,7 e 11,5%, respectivamente) de forma similar (P>0,05). Com base nestes resultados podemos concluir que a suplementação, tanto da maturação como a pré-maturação não causa prejuízo no posterior desenvolvimento embrionário. Ainda, embriões clonados produzidos a partir de oócitos bloqueados são capazes de estabelecer gestações avançadas em bovinos. / Embryo production rates obtained from both IVF (30-40%) and NT (23%) are still below the expected values. Therefore, oocyte pre-maturation using cell cycle inhibitors is one of the alternatives which has been studied to increase the competence of oocytes used for IVP, as an attempt to optimize the success rates of these biotechniques. Neurotrophins are known to play several roles in the reproductive system. BDNF is an example of a neurotrophin that seems to be related to oocyte maturation. Therefore, the objective of this study was to improve techniques of pre-maturation and maturation of bovine oocytes submitted to parthenogenetic activation, aiming for its use on cloning by nuclear transfer. Bovine oocytes were submitted to maturation either in presence (IVM/BD) or absence (IVM) of BDNF or pre-matured with BLI and supplemented (BL/BD) or not (BL) with the neurotrophin. Groups were evaluated for maturation rates (metaphase II), activation (pro-nucleus formation) and embryo development (blastocyst formation rate and quality). There was no difference (P>0.05) in MII rate after the maturation with or without BDNF. However, pre-maturation in the supplemented group (BL/BD, n=73; 91.2%) resulted in higher MII rate (P<0.05) when compared with the nonsupplemented group (BL, n=66; 76.7%). Oocytes which were matured under the same conditions were also activated chemically for embryonic development analysis. Activation rates were different (P<0.05) from IVM/BD groups (n=30; 71.4%) and IVM (n=41; 91.1%). However, no difference were observed for development parameters. When the oocytes were prematured, cleavage rates in the supplemented group were superior (P<0.05) than non supplemented group (BL/BD: n=227; 65.2%) and (BL: n=187; 57.7%), but no difference was observed for other developmental parameters. Embryo quality was also evaluated and no difference was observed between treatments. Groups submitted to NT (IVM and BL/BD) differed regarding (P<0.05) the 1stPB extrusion (n=639; 63.5% and n=693; 69.5%, respectively) and fusion rate (n=345; 72.9% and n=397; 79.2%, respectively), but did not present differences for other evaluated parameters. Embryo quality was evaluated again and no differences were observed. After the embryos were transferred to recipient cows, groups IVM (n=3; 10.7%) and BL/BD (n=3; 11.5%) were capable of producing advanced gestations at similar rates (P>0.05). Based on these results, it may be concluded that supplementation of both maturation and pre-maturation does not impair embryonic development. Additionally, cloned embryos produced from blocked oocytes are able to establish advanced gestation in cattle.

Orientador: Marcelo Fabio Gouveia Nogueira / Resumo: Além de permitir a produção em larga escala de embriões, a maturação in vitro (MIV) não utiliza hormônios superestimulatórios, evitando prejuízos econômicos e efeitos iatrogênicos da superestimulação. Entretanto, a MIV ainda está aquém das expectativas devido à incapacidade em simular eventos fisiológicos que ocorrem in vivo. Um artefato da MIV consiste na retomada espontânea da meiose após a remoção do oócito do ambiente folicular. Sem o aparato molecular que retém a meiose, a maturação nuclear ocorre sem o estímulo hormonal fisiológico, impedindo a reorganização adequada das organelas durante a maturação citoplasmática, o que pode comprometer a competência oocitária in vitro. A temática primordial desta tese foi testar um sistema de pré-maturação oocitária (Pré-MIV), no qual dois fármacos (forskolin e 3-isobutil- metilxantina) são utilizados antes da MIV para retardar a meiose. O desempenho da Pré-MIV foi comparado à MIV convencional, em contexto comercial e de pesquisa. Em um primeiro momento, comparamos os sistemas convencional e Pré-MIV de forma holística, ou seja, testamos os sistemas comerciais completos. Aqui, o critério avaliativo foi a análise ultraestrutural de oócitos e blastocistos, e a análise da expressão de 96 genes relacionados à qualidade embrionária. Na segunda abordagem, adaptamos os fármacos da Pré- MIV em nossa MIV rotineira. Por estes fármacos afetarem o metabolismo lipídico, e, frente a importância deste no metabolismo energético celular, a segunda inv... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Eduardo Montanari Razza null (32896431829) on 2017-04-24T13:06:14Z No. of bitstreams: 1 Tese_E_M_Razza.compressed.pdf: 2567237 bytes, checksum: 79286963f030ebbfef3c6033007b2f31 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-25T20:37:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 razza_em_dr_bot.pdf: 2567237 bytes, checksum: 79286963f030ebbfef3c6033007b2f31 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-25T20:37:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 razza_em_dr_bot.pdf: 2567237 bytes, checksum: 79286963f030ebbfef3c6033007b2f31 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Além de permitir a produção em larga escala de embriões, a maturação in vitro (MIV) não utiliza hormônios superestimulatórios, evitando prejuízos econômicos e efeitos iatrogênicos da superestimulação. Entretanto, a MIV ainda está aquém das expectativas devido à incapacidade em simular eventos fisiológicos que ocorrem in vivo. Um artefato da MIV consiste na retomada espontânea da meiose após a remoção do oócito do ambiente folicular. Sem o aparato molecular que retém a meiose, a maturação nuclear ocorre sem o estímulo hormonal fisiológico, impedindo a reorganização adequada das organelas durante a maturação citoplasmática, o que pode comprometer a competência oocitária in vitro. A temática primordial desta tese foi testar um sistema de pré-maturação oocitária (Pré-MIV), no qual dois fármacos (forskolin e 3-isobutil- metilxantina) são utilizados antes da MIV para retardar a meiose. O desempenho da Pré-MIV foi comparado à MIV convencional, em contexto comercial e de pesquisa. Em um primeiro momento, comparamos os sistemas convencional e Pré-MIV de forma holística, ou seja, testamos os sistemas comerciais completos. Aqui, o critério avaliativo foi a análise ultraestrutural de oócitos e blastocistos, e a análise da expressão de 96 genes relacionados à qualidade embrionária. Na segunda abordagem, adaptamos os fármacos da Pré- MIV em nossa MIV rotineira. Por estes fármacos afetarem o metabolismo lipídico, e, frente a importância deste no metabolismo energético celular, a segunda investigação focou na quantificação lipídica de oócitos e blastocistos, além de avaliar o perfil lipídico de membrana dos blastocistos produzidos, dada sua relação com seu potencial de criopreservação. Coletamos amostras de células do cumulus e blastocistos e, respectivamente, verificamos a expressão de 96 genes associados à competência oocitária e 96 genes relacionados à qualidade embrionária. Resultados indicaram que a Pré-MIV afetou a ultraestrutura de oócitos e que o perfil de expressão gênica de blastocistos foi afetado pelo tratamento, mas com variações quanto ao sistema de produção utilizado. Além disso, a Pré-MIV aumentou o conteúdo lipídico de oócitos, mas diminuiu nos blastocistos, afetando positivamente o perfil lipídico de membranas do embrião. Finalmente, a Pré-MIV também afetou a expressão gênica de células do cumulus (positivamente) e de blastocistos (diferencialmente). / Besides allowing for the large-scale in vitro production of embryos, the in vitro maturation (IVM) dismiss the use of superstimulation hormones, preventing excessive financial expenses and avoiding iatrogenic effects of ovarian overstimulation. However, the outcome of IVM is still below expectations due to the inability in simulating the physiological events occurring in vivo. An artifact of IVM consists on the spontaneous resumption of meiosis after oocyte removal from the follicular environment. In this regard, without the molecular apparatus for arresting meiosis, the nuclear maturation is triggered irrespective of the physiological hormonal stimulation. As a result, the cytoplasmic maturation, i.e., the adequate reorganization of organelles in the oocyte is bypassed, compromising the oocyte competence. The general idea in this thesis was to test the pre-maturation system (Pre-IVM), in which two drugs (forskolin and 3- isobutyl-methylxanthine) are used prior to IVM to sustain meiotic arrest. The Pre-IVM performance was compared to the conventional IVM in the context of either commercial routines or research laboratories. At first, we aimed to compare the conventional IVM and the Pre-IVM in a holistic way, i.e., challenging each other using commercial systems. In this approach, we evaluated the ultrastructural aspects of oocytes and blastocysts, and associated with the expression of 96 genes related to embryo quality. In the second approach, we adapted the Pre-IVM drugs in our own IVM. Those drugs are known to affect the lipid metabolism, which is extremely relevant for the cellular energy metabolism in oocytes and embryo. Hence, we focus on the lipid quantification in oocytes and blastocysts, and, in addition, we assessed the membrane lipid profile of the blastocysts, since it is directly related to embryo cryopreservation potential. We collected cumulus cells and blastocysts and assessed the expression of 96 genes of oocyte competence and 96 genes of embryo quality. Results indicated that the Pre-IVM affected oocyte ultrastructure, the gene expression of blastocysts was differentially affected, but there was variation according to the systems used. Also the Pre- IVM increased the lipid content in oocytes and reduced in blastocysts. The membrane lipid profile of blastocysts was positively modulated by the Pre-IVM. Finally, the Pre-IVM affected the gene expression of cumulus (positively) and blastocysts (differentially). / FAPESP: 2012/23409-9 / FAPESP: 2015/02557-8

As taxas de produção embrionária tanto da FIV (30-40%) como da TN (23%) ainda estão aquém do esperado. Desta forma, a pré-maturação com inibidores do ciclo celular é uma das alternativas que vem sendo estudada para aumentar a competência dos oócitos utilizados na PIV, na tentativa de otimizar o sucesso das biotécnicas. Sabe-se que neurotrofinas desempenham funções no sistema reprodutor. O BDNF é um exemplo de neurotrofina que parece estar relacionada com a maturação dos oócitos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi de aperfeiçoar a pré-maturação e a maturação in vitro de oócitos bovinos submetidos posteriormente à ativação partenogenética, visando seu uso na biotécnica de transferência de núcleo. Oócitos bovinos foram submetidos à maturação na presença (MIV/BD) ou ausência (MIV) de BDNF ou pré-maturados com BLI e suplementados (BL/BD) ou não (BL) com a neurotrofina. Posteriormente foram avaliados quanto à taxa de maturação (metáfase II), ativação (formação de prónúcleo) e desenvolvimento embrionário (produção e qualidade dos blastocistos). Não houve diferença (P>0,05) entre taxas de MII após a maturação com ou sem BDNF. Porém, o grupo pré-maturado e suplementado (BL/BD n=73; 91,2%) apresentou maior taxa de MII (P<0,05) em relação ao grupo não suplementado (BL n=66; 76,7%). Oócitos maturados nas mesmas condições foram ativados quimicamente para análise do desenvolvimento embrionário. Os grupos MIV/BD (n=30; 71,4%) e MIV (n=41; 91.1%) apresentaram diferença (P<0,05) em relação à taxa de ativação. Porém, não foi observada diferença quanto aos outros parâmetros do desenvolvimento. Quando os oócitos foram pré-maturados a taxa de clivagem do grupo suplementado (BL/BD: n=227; 65,2%) foi superior (P<0,05) ao grupo não suplementado (BL: n=187; 57,7%), mas não foram observadas diferenças (P>0,05) para os outros parâmetros de desenvolvimento. A qualidade dos embriões ativados também não foi afetada pelos tratamentos. Os grupos submetidos à TN (MIV e BL/BD) apresentaram diferenças (P<0,05) para extrusão do 1°CP (n=639; 63,5% e n=693; 69,5%, respectivamente) e para taxa de fusão (n=345; 72,9% e n=397; 79,2%, respectivamente) não havendo diferença para nenhum outro parâmetro avaliado. A qualidade dos embriões clonados também foi avaliada e não foi observada diferença. Após a transferência dos embriões dos grupos MIV (n=28) e BL/BD (n=26) para as receptoras, os grupos foram capazes de produzir gestação avançadas (10,7 e 11,5%, respectivamente) de forma similar (P>0,05). Com base nestes resultados podemos concluir que a suplementação, tanto da maturação como a pré-maturação não causa prejuízo no posterior desenvolvimento embrionário. Ainda, embriões clonados produzidos a partir de oócitos bloqueados são capazes de estabelecer gestações avançadas em bovinos. / Embryo production rates obtained from both IVF (30-40%) and NT (23%) are still below the expected values. Therefore, oocyte pre-maturation using cell cycle inhibitors is one of the alternatives which has been studied to increase the competence of oocytes used for IVP, as an attempt to optimize the success rates of these biotechniques. Neurotrophins are known to play several roles in the reproductive system. BDNF is an example of a neurotrophin that seems to be related to oocyte maturation. Therefore, the objective of this study was to improve techniques of pre-maturation and maturation of bovine oocytes submitted to parthenogenetic activation, aiming for its use on cloning by nuclear transfer. Bovine oocytes were submitted to maturation either in presence (IVM/BD) or absence (IVM) of BDNF or pre-matured with BLI and supplemented (BL/BD) or not (BL) with the neurotrophin. Groups were evaluated for maturation rates (metaphase II), activation (pro-nucleus formation) and embryo development (blastocyst formation rate and quality). There was no difference (P>0.05) in MII rate after the maturation with or without BDNF. However, pre-maturation in the supplemented group (BL/BD, n=73; 91.2%) resulted in higher MII rate (P<0.05) when compared with the nonsupplemented group (BL, n=66; 76.7%). Oocytes which were matured under the same conditions were also activated chemically for embryonic development analysis. Activation rates were different (P<0.05) from IVM/BD groups (n=30; 71.4%) and IVM (n=41; 91.1%). However, no difference were observed for development parameters. When the oocytes were prematured, cleavage rates in the supplemented group were superior (P<0.05) than non supplemented group (BL/BD: n=227; 65.2%) and (BL: n=187; 57.7%), but no difference was observed for other developmental parameters. Embryo quality was also evaluated and no difference was observed between treatments. Groups submitted to NT (IVM and BL/BD) differed regarding (P<0.05) the 1stPB extrusion (n=639; 63.5% and n=693; 69.5%, respectively) and fusion rate (n=345; 72.9% and n=397; 79.2%, respectively), but did not present differences for other evaluated parameters. Embryo quality was evaluated again and no differences were observed. After the embryos were transferred to recipient cows, groups IVM (n=3; 10.7%) and BL/BD (n=3; 11.5%) were capable of producing advanced gestations at similar rates (P>0.05). Based on these results, it may be concluded that supplementation of both maturation and pre-maturation does not impair embryonic development. Additionally, cloned embryos produced from blocked oocytes are able to establish advanced gestation in cattle.

Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-12T15:28:06Z No. of bitstreams: 1 GBN VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO P IMPRESSÃO.pdf: 1111649 bytes, checksum: f77c4c688d28fc8ca13182c8832085f8 (MD5) / Rejected by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: No arquivo submetido ao repositório deve estar inserido o certificado de aprovação (documento obrigatório). A informação sobre a lombada não precisa conter no arquivo pdf inserido. Favor inserir o certificado de aprovação e submeter novamente a sua dissertação no repositório. Agradecemos a compreensão on 2018-04-13T11:25:20Z (GMT) / Submitted by Giovana Barros Nunes (giovanabnunes@hotmail.com) on 2018-04-13T14:08:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação GIOVANA BARROS NUNES VERSÃO DEFINITIVA Repositório.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-13T17:17:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_gb_me_jabo.pdf: 1276204 bytes, checksum: 3aba64a51e863966cadeab46cfa01561 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito do precursor do peptídeo natriurético tipo C (NPPC) durante o cultivo de pré-maturação in vitro (pré-MIV) de oócitos bovinos sobre: 1) a progressão da maturação nuclear; 2) a expressão gênica das células do cumulus e 3) a aquisição da competência do oócito para o desenvolvimento embrionário in vitro. Os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram pré-MIV com 100 nM NPPC por 8 horas (grupo NPPC) e, ao final do período, foram lavados para completa remoção do NPPC e submetidos à MIV por 22h. Após 8h de pré-MIV e após 8h de pré-MIV seguidas de 22h de MIV (duração total do cultivo = 30h) foram avaliadas a progressão da maturação nuclear e a expressão relativa de mRNA nas células do cumulus. O grupo controle (C) foi maturado na ausência de NPPC por até 30h, e as mesmas avaliações anteriores foram realizadas imediatamente após a remoção do ambiente folicular (C0), após 8h de cultivo (C8), após 22h de cultivo (C22) e após 30h de cultivo (C30). Em outro experimento, cujos tratamentos foram idênticos aos supramencionados, os oócitos foram fecundados ao término da MIV e foi avaliado o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos. Após 8h de cultivo de pré-MIV, a análise da progressão da meiose demonstrou que o grupo C0 apresentou 58,9% de estruturas com configuração de GV1, enquanto que o grupo C8 apresentou apenas 13,9% de estruturas nesta configuração (P<0,05). A proporção de GV1 no grupo NPPC foi semelhante a ambos estes grupos (22,8%; P>0,05). Por outro lado, o grupo C8 apresentou maior taxa de GV3 em relação ao C0 (53,1% vs. 3,62%; P<0,05), sem diferenças com o grupo NPPC (38,7%; P>0,05). Ao final do cultivo de MIV, não foi observada diferença entre os grupos (C22 vs. NPPC vs. C30) com relação à maturação nuclear, todavia, houve maior taxa de oócitos degenerados no C30 em comparação com C22 (11,4% vs. 2,8%; P<0,05). A análise da expressão relativa de genes das células do cumulus após 8h de pré-MIV com NPPC evidenciou aumento (P<0,05) na expressão de genes relacionados à expansão destas células (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 e VCAN), à maturação oocitária (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) e ao desenvolvimento embrionário (IGF1R, KRT8 e LUM). Ao final do cultivo de MIV, observou-se no grupo NPPC que o gene PTX3, relacionado à expansão das células do cumulus, além dos genes AREG e BDNF, relacionados à maturação oocitária, e o gene LUM, relacionado ao desenvolvimento embrionário estavam mais expressos em comparação com o grupo C30 (P<0,05). Com relação ao desenvolvimento embrionário, os grupos experimentais não apresentaram diferença (P>0,05) quanto à taxa de clivagem (média de 73,22%). Embora o grupo NPPC não tenha diferido (P>0,05) de C22 e C30 quanto à taxa de blastocistos, houve diferença entre C22 e C30 (69,3 vs. 37,4; P<0,05). Todavia, não houve diferença entre os grupos com relação ao número de células totais (blastômeros) e apoptóticas (P>0,05). Em conclusão, o cultivo de pré-MIV de oócitos bovinos por 8h com 100nM NPPC não bloqueou a retomada da meiose, mas a progressão da meiose ocorreu de forma mais lenta e impediu o envelhecimento e degeneração dos oócitos. O cultivo de oócitos por tempo prolongado (30h) na ausência de NPPC foi prejudicial para o desenvolvimento embrionário, mas o tratamento com NPPC (8h pré-MIV+22h MIV = duração total de 30h) reverteu parcialmente este índice. / The aim of this study was to evaluate the effect of the C-type natriuretic peptide precursor (NPPC) during pre in vitro maturation culture (pre-IVM) of bovine oocytes on: 1) nuclear maturation progress; 2) gene expression in cumulus cells and 3) acquisition of competence for in vitro embryo development. Cumulus oocyte complexes (COCs) were pre-IVM with 100 nM NPPC for 8 hours (NPPC group) and then were washed for the complete removal of NPPC and submitted to IVM for 22h. After 8h pre-IVM followed by 22h IVM (total culture time = 30h) oocytes were evaluated for nuclear maturation progress and cumulus cells for relative mRNA expression. Control group (C) was IVM in the absence of NPPC for up to 30h and the same evaluations were made immediately after follicle removal (C0) and after 8h (C8), 22h (C22) and after 30h of culture (C30). In another experiment with the same treatment, the oocytes were fertilized at the end of IVM and embryo development to the blastocyst stage was evaluated. After 8 hours of pre-IVM culture, meiosis progression analysis showed 58.9% of oocytes in GV1 configuration in C0, while C8 had only 13.9% (P<0.05). The GV1 rates in NPPC did not differ from any group (22.8%; P>0.05). On the other hand, C8 showed higher rates of GV3 in comparison with C0 (53.1% vs. 3.62%; p<0.05) and no differences compared to NPPC (38.7%; P<0.05). At the end of IVM culture, no differences between groups (C22 vs. NPPC vs. C30) were observed in nuclear maturation, however, higher rates of degenerated oocytes were observed in C30 in comparison with C22 (11.4% vs. 2.8%; P<0.05). The relative gene expression analysis in cumulus cells after 8h pre-IVM with NPPC showed an up-regulation in genes related to cumulus cells expansion (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 and VCAN), oocyte maturation (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) and embryo development (IGF1R, KRT8 and LUM). At the end of IVM culture, the cumulus cells expansion related gene, PTX3, the oocyte maturation genes, AREG and BDNF, and the embryo development gene, LUM, were up-regulated in NPPC in comparison with C30 (p<0.05). Regarding embryo development, the cleavage rates did not differ in experimental groups (mean around 73,22%). Besides, blastocyst rates did not differ between NPPC (P>0.05) and the other groups, but there was a difference between C22 and C30 (69.3 vs. 37.4%; P<0.05). There was no difference between the groups in total cell number (blastomeres) and apoptotic cells (P<0.05). In conclusion, the pre-IVM culture of bovine oocytes for 8h with 100nM NPPC did not block meiosis resumption, but meiosis progression occurred more slowly and prevented aging and degeneration of the oocytes. The prolonged time of oocyte culture (30h) in the absence of NPPC was detrimental to embryo development, but NPPC treatment (8h pre-IVM + 22h IVM = total duration of 30h) partially reversed this effect.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA161.pdf: 119035 bytes, checksum: a5dfaf04161545272882e1423c258dc0 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The in vitro embryo production has a strong commercial and preservationist impact in Brazil. However, there are still barriers to be overcome, since the in vitro maturation does not mimic the in vivo maturation. The maturation optimization increases the embryo competence and quality, making them more cryotolerants. The meiotic blockage, after oocytes removal from their follicular environment, may be a good alternative. Three experiments (n = 2848) evaluated the Cordicepim as a meiotic blocker in bovine oocytes in different culture media, and its influence on embryonic development. Follicles 3-8 mm diameter, were punctured from abattoir ovaries and allocated into 4 groups: Control (TCM-199 + pyruvate, FSH, LH and SFB); MIVCord (TCM-199 + Pyruvate, FH, LH, FCS, Cordicepim); TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) and TCMCont (TCM-199), followed by standard maturation (IVM) for 20 or 24 h. The effect of meiosis blockage in embryo production was assessed by cleavage and blastocyst rate, and total number of cells assessed. To evaluate the stage of maturation, oocytes were stained with Hoechst and evaluated by microscopy. Quantitative data were analyzed by ANOVA and Tukey test and the qualitative data by chi-square, with 5% significance. Cordicepim did not affect cleavage (60.7 vs. 56.4%) and blastocysts (30.7 vs. 24.8%) rates when added to supplemented medium (MIVCord). However, there was a reduction in cleavage (42%) and blastocysts (12.1%) rates when added to a medium without supplements (TCMCord). On the kinetics of maturation after 6 hours of pre culture, only TCMCord group maintained most oocytes blocked. Cell density of the produced embryos (26 h maturation) in MIVcont groups (189.2 ± 11.4), MIVCord (187.1 ± 12.1) and TCMCont (171.2 ± 10.4) did not differ and were higher than TCMCord group (119.7 ± 11.4). Already, with 30 h maturation cell density was similar between embryos from control group (224.2 ± 17.5) and TCMCord group (240.1 ± 10.4). However, even with 30 h maturation, only 64.8% of the oocytes completed maturation in TCMCord group, while 100% maturated in Control group. We conclude that 6 h of culture in cordicepim in the absence of gonadotropins, partially inhibits the meiosis in oocytes, and this inhibition is not successfully reversed even after 24 hours of maturation pattern in the absence of cordicepim. The cordicepim reduces embryo production when in vitro maturation is performed for 26 h. However, within 30 h maturation time, the Cordicepim does not affect embryo production rate. Yet, the cordicepim prevents the cumulus cells expansion in an irreversible manner / A produção in vitro de embriões tem um forte impacto comercial e preservacionista no Brasil. Entretanto ainda existem barreiras a serem superadas, já que a maturação in vivo não é totalmente mimetizada pela maturação in vitro. A otimização da maturação pode aumentar a competência e a qualidade embrionária, tornando-os mais criotolerantes. Uma boa alternativa pode ser o bloqueio meiótico reversível. Três experimentos (n = 2848) avaliaram o Cordicepim como bloqueador meiótico para oócitos bovinos, em diferentes meios de cultivo e sua influência no desenvolvimento embrionário. Folículos de 3-8 mm, obtidos por aspiração de ovários de frigorífico foram distribuídos em 4 grupos: Controle (TCM-199 + piruvato, FSH, LH e SFB) MIVCord (TCM-199 +Piruvato, FH, LH, SFB, Cordicepim) TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) e TCMCont (TCM-199), seguido de maturação padrão (MIV) por 20 ou 24 horas. O efeito do bloqueio meiótico na produção de embriões foi avaliado pela taxa de clivagem, blastocisto e número total de células. Para avaliação do estágio de maturação, os oócitos foram corados com Hoechst e avaliados por microscopia. Os dados quantitativos foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey e os qualitativos ao qui-quadrado, com 5% de significância. O Cordicepim não influenciou as taxas de clivagem (60,7 vs 56,4%) e blastocistos (30,7 vs 24,8%), quando empregado em meio suplementado (MIVCord). Porém, houve uma redução na taxa de clivagem (42%) e blastocistos (12,1%), quando empregado em meio sem suplementos (TCMCord). Na cinética de maturação nuclear após 6 horas de pré-maturação, apenas o grupo TCMCord manteve a maioria dos oócitos bloqueados (67%). A densidade celular dos embriões produzidos (26 h maturação) nos grupos controle (189,2 ± 11,4), MIVCord (187,1 ± 12,1) e TCMCont (171,2 ± 10,4) não diferiram entre si e foram superiores ao grupo TCMCord (119,7 ± 11,4). Já com 30 h de maturação a densidade celular dos embriões foi semelhante entre os grupos controle 30 (224,2 ± 17,5) e TCMCord 30 (240,1 ± 10,4). Porém, mesmo com 24 h de maturação padrão, apenas 64,8% dos oócitos do grupo TCMCord 30 completaram a maturação, enquanto no grupo controle 100% maturaram. Conclui-se que 6 h de pré-maturação em cordicepim, na ausência de suplementos, inibe parcialmente a meiose em oócitos bovinos, porém esta inibição não é revertida com êxito mesmo após 24 horas de maturação padrão na ausência de cordicepim. O cordicepim reduz a produção de embriões in vitro com 26 h de maturação. Já com 30 h de maturação, o Cordicepim não influencia a taxa de produção embrionária. Ainda, o cordicepim impede de forma irreversível a expansão das células do cumulus