Die hier vorliegende Arbeit gehört zu eine der ersten im deutschsprachigen Raum durchgeführten Studien zu den Einstellungen von deutschen Kinderwunschpaaren im Umgang mit kryokonservierten Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen sowie gegenüber der Legalisierung in Deutschland bisher unklar geregelter Verfahren. Insbesondere lag dabei der Fokus auf Einstellungen bezüglich der durch das EschG unklar geregelten Embryonenspende, der verbotenen routinemäßigen Kryokonser-vierung von Embryonen sowie dem weiteren Verbleib überzähliger Embryonen. Dabei wurden im Rahmen einer prospektiven Querschnittsstudie insgesamt 700 Kinderwunschpaare (in Behandlung im Fertility Center Berlin), die im Besitz krykon-servierter Eizellen im Vorkernstadium sind oder waren per standardisiertem Frage-bogen anonym befragt. Männer und Frauen wurden dabei getrennt voneinander befragt. Insgesamt sendeten 272 Patienten den Fragebogen korrekt ausgefüllt zu-rück. In der Mehrheit sprachen sich die befragten Kinderwunschpatienten für eine Legali-sierung der Embryonen- und Eizellspende aus. Außerdem sollte eine routinemäßige Kryokonservierung von Embryonen im Rahmen einer Kinderwunschbehandlung möglich sein. Die Paare würden dabei sog. überzählige Embryonen vorrangig für die eigene Kinderwunschbehandlung verwenden. Allerdings fand sich ebenso eine hohe Akzeptanz gegenüber einer Spende überzähliger Embryonen nach Beendigung des Kinderwunsches sowohl an andere Kinderwunschpaare als auch zu Forschungszwe-cken. Dabei machte es keinen signifikanten Unterschied, um welche Art der For-schung es sich dabei handeln würde (embryonale Stammzellforschung oder repro-duktionsmedizinische Forschung). Interessanterweise votierten jedoch mehr Patien-ten für eine Legalisierung der genannten Verfahren, persönlich dafür entscheiden, würden sich jedoch weniger Paare. Außerdem unterschieden die von uns befragten Patienten nach dem ethisch-moralischen Status gefragt nicht so rigoros wie das EschG zwischen Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen. In der Mehrheit stell-ten diese frühen Formen menschlichen Lebens entweder Zellen mit hohem Schutz-anspruch dar oder beide hätten laut der Befragten sogar den Status eines Menschen mit vollem Schutzanspruch. Ob die Kinderwunschpaare dabei allerdings den Eizellen im Vorkernstadium oder Embryonen den höheren Schutzanspruch zugestehen, lässt sich anhand der Ergebnisse nicht zweifelsfrei belegen. Kryokonservierte Embryonen haben laut der Paare einen leicht höheren Schutzanspruch, in dem die Befragten diese eher als vollwertige Menschen gesehen haben. Insgesamt bleibt also festzuhalten, dass die Einstellungen der von uns befragten Kinderwunschpaare bezüglich früher Formen menschlichen Lebens nicht immer deckungsgleich sind mit denen des EschG. Die Paare sprechen sich mehrheitlich für eine Legalisierung verbotener Verfahren im Rahmen einer Kinderwunschbehandlung in Deutschland aus und unterscheiden in Bezug auf den moralischen Status nicht signifikant zwischen Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen. Da diese Studie allerdings den Charakter einer Pilotstudie darstellt, konnten keine Einflussfaktoren ermittelt werden, die Daten stammen aus einem vorselektierten Kollektiv und müssen daher vorsichtig interpretiert werden. Nichtsdestotrotz können die Ergebnisse einen wertvollen Beitrag in der Diskussion um die Novellierung des EschG bzw. um die Notwendigkeit eines sog. „Fortpflanzungsmedizingesetzes“ leisten und damit zu einer Verbesserung der Ergebnisse, Effektivität und Sicherheit der Patienten im Rahmen der assistierten Reproduktion in Deutschland bieten.

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is an ultra-sensitive optical technique to investigate the dynamic properties of ensembles of single fluorescent molecules in solution. It is in particular suited for measurements in biological samples. High sensitivity is obtained by employing confocal microscopy setups with diffraction limited small detection volumes, and by using single-photon sensitive detectors, for example avalanche photo diodes (APD). However, fluorescence signal is hence typically collected from a single focus position in the sample only, and several measurements at different positions have to be performed successively. To overcome the time-consuming successive FCS measurements, we introduce electron multiplying CCD (EMCCD) camera-based spatially resolved detection for FCS. With this new detection method, multiplexed FCS measurements become feasible. Towards this goal, we perform FCS measurements with two focal volumes. As an application, we demonstrate spatial cross-correlation measurements between the two detection volumes, which allow to measure calibration-free diffusion coefficients and direction-sensitive processes like molecular flow in microfluidic channels. FCS is furthermore applied to living zebrafish embryos, to investigate the concentration gradient of the morphogen fibroblast growth factor 8 (Fgf8). It is shown by one-focus APD-based and two-focus EMCCD-based FCS, that Fgf8 propagates largely by random diffusion through the extracellular space in developing tissue. The stable concentration gradient is shown to arise from the equilibrium between a local morphogen production and the sink function of the receiving cells by receptor-mediated removal from the extracellular space. The study shows the applicability of FCS to whole model organisms. Especially in such dynamically changing systems in vivo, the perspective of fast parallel FCS measurements is of great importance. In this work, we exemplify parallel, spatially resolved FCS by utilizing an EMCCD camera. The approach, however, can be easily adapted to any other class of two-dimensional array detector. Novel generations of array detectors might become available in the near future, so that multiplexed spatial FCS could then emerge as a standard extension to classical one-focus FCS. / Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) ist eine hochempfindliche optische Methode, um die dynamischen Eigenschaften eines Ensembles von einzelnen, fluoreszierenden Molekülen in Lösung zu erforschen. Sie ist insbesondere geeignet für Messungen in biologischen Proben. Die hohe Empfindlichkeit wird erreicht durch Verwendung konfokaler Mikroskop-Aufbauten mit beugungsbegrenztem Detektionsvolumen, und durch Messung der Fluoreszenz mit Einzelphotonen-empfindlichen Detektoren, zum Beispiel Avalanche-Photodioden (APD). Dadurch wird das Fluoreszenzsignal allerdings nur von einer einzelnen Fokusposition in der Probe eingesammelt, und mehrfache Messungen an verschiedenen Positionen in der Probe müssen nacheinander durchgeführt werden. Um die zeitaufwendigen, aufeinanderfolgenden FCS-Einzelmessungen zu überwinden, entwickeln wir in dieser Arbeit Elektronenvervielfachungs-CCD (EMCCD) Kamera-basierte räumlich aufgelöste Detektion für FCS. Mit dieser neuartigen Detektionsmethode werden Multiplex-FCS Messungen möglich. Darauf abzielend führen wir FCS Messungen mit zwei Detektionsvolumina durch. Als Anwendung nutzen wir die räumliche Kreuzkorrelation zwischen dem Signal beider Fokalvolumina. Sie ermöglicht die kalibrationsfreie Bestimmung von Diffusionskoeffizienten und die Messung von gerichteter Bewegung, wie zum Beispiel laminarem Fluss in mikrostrukturierten Kanälen. FCS wird darüber hinaus angewendet auf Messungen in lebenden Zebrafischembryonen, um den Konzentrationsgradienten des Morphogens Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 (Fgf8) zu untersuchen. Mit Hilfe von APD-basierter ein-Fokus FCS und EMCCD-basierter zwei-Fokus FCS zeigen wir, dass Fgf8 hauptsächlich frei diffffundiert im extrazellulären Raum des sich entwickelnden Embryos. Der stabile Konzentrationsgradient entsteht durch ein Gleichgewicht von lokaler Morphogenproduktion und globalem Morphogenabbau durch Rezeptor vermittelte Entfernung aus dem extrazellulären Raum. Die Studie zeigt die Anwendbarkeit von FCS in ganzen Modell-Organismen. Gerade in diesen sich dynamisch ändernden Systemen in vivo ist die Perspektive schneller, paralleler FCS-Messungen von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird räumlich aufgelöste FCS am Beispiel einer EMCCD Kamera durchgeführt. Die Herangehensweise ist jedoch einfach übertragbar auf jede andere Art von zwei-dimensionalem Flächendetektor. Neuartige Flächendetektoren könnten in naher Zukunft verfügbar sein. Dann könnte räumlich aufgelöste Multiplex-FCS eine standardisierte Erweiterung zur klassischen ein-Fokus FCS werden.

Die hier vorliegende Arbeit gehört zu eine der ersten im deutschsprachigen Raum durchgeführten Studien zu den Einstellungen von deutschen Kinderwunschpaaren im Umgang mit kryokonservierten Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen sowie gegenüber der Legalisierung in Deutschland bisher unklar geregelter Verfahren. Insbesondere lag dabei der Fokus auf Einstellungen bezüglich der durch das EschG unklar geregelten Embryonenspende, der verbotenen routinemäßigen Kryokonser-vierung von Embryonen sowie dem weiteren Verbleib überzähliger Embryonen. Dabei wurden im Rahmen einer prospektiven Querschnittsstudie insgesamt 700 Kinderwunschpaare (in Behandlung im Fertility Center Berlin), die im Besitz krykon-servierter Eizellen im Vorkernstadium sind oder waren per standardisiertem Frage-bogen anonym befragt. Männer und Frauen wurden dabei getrennt voneinander befragt. Insgesamt sendeten 272 Patienten den Fragebogen korrekt ausgefüllt zu-rück. In der Mehrheit sprachen sich die befragten Kinderwunschpatienten für eine Legali-sierung der Embryonen- und Eizellspende aus. Außerdem sollte eine routinemäßige Kryokonservierung von Embryonen im Rahmen einer Kinderwunschbehandlung möglich sein. Die Paare würden dabei sog. überzählige Embryonen vorrangig für die eigene Kinderwunschbehandlung verwenden. Allerdings fand sich ebenso eine hohe Akzeptanz gegenüber einer Spende überzähliger Embryonen nach Beendigung des Kinderwunsches sowohl an andere Kinderwunschpaare als auch zu Forschungszwe-cken. Dabei machte es keinen signifikanten Unterschied, um welche Art der For-schung es sich dabei handeln würde (embryonale Stammzellforschung oder repro-duktionsmedizinische Forschung). Interessanterweise votierten jedoch mehr Patien-ten für eine Legalisierung der genannten Verfahren, persönlich dafür entscheiden, würden sich jedoch weniger Paare. Außerdem unterschieden die von uns befragten Patienten nach dem ethisch-moralischen Status gefragt nicht so rigoros wie das EschG zwischen Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen. In der Mehrheit stell-ten diese frühen Formen menschlichen Lebens entweder Zellen mit hohem Schutz-anspruch dar oder beide hätten laut der Befragten sogar den Status eines Menschen mit vollem Schutzanspruch. Ob die Kinderwunschpaare dabei allerdings den Eizellen im Vorkernstadium oder Embryonen den höheren Schutzanspruch zugestehen, lässt sich anhand der Ergebnisse nicht zweifelsfrei belegen. Kryokonservierte Embryonen haben laut der Paare einen leicht höheren Schutzanspruch, in dem die Befragten diese eher als vollwertige Menschen gesehen haben. Insgesamt bleibt also festzuhalten, dass die Einstellungen der von uns befragten Kinderwunschpaare bezüglich früher Formen menschlichen Lebens nicht immer deckungsgleich sind mit denen des EschG. Die Paare sprechen sich mehrheitlich für eine Legalisierung verbotener Verfahren im Rahmen einer Kinderwunschbehandlung in Deutschland aus und unterscheiden in Bezug auf den moralischen Status nicht signifikant zwischen Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen. Da diese Studie allerdings den Charakter einer Pilotstudie darstellt, konnten keine Einflussfaktoren ermittelt werden, die Daten stammen aus einem vorselektierten Kollektiv und müssen daher vorsichtig interpretiert werden. Nichtsdestotrotz können die Ergebnisse einen wertvollen Beitrag in der Diskussion um die Novellierung des EschG bzw. um die Notwendigkeit eines sog. „Fortpflanzungsmedizingesetzes“ leisten und damit zu einer Verbesserung der Ergebnisse, Effektivität und Sicherheit der Patienten im Rahmen der assistierten Reproduktion in Deutschland bieten.

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Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is an ultra-sensitive optical technique to investigate the dynamic properties of ensembles of single fluorescent molecules in solution. It is in particular suited for measurements in biological samples. High sensitivity is obtained by employing confocal microscopy setups with diffraction limited small detection volumes, and by using single-photon sensitive detectors, for example avalanche photo diodes (APD). However, fluorescence signal is hence typically collected from a single focus position in the sample only, and several measurements at different positions have to be performed successively. To overcome the time-consuming successive FCS measurements, we introduce electron multiplying CCD (EMCCD) camera-based spatially resolved detection for FCS. With this new detection method, multiplexed FCS measurements become feasible. Towards this goal, we perform FCS measurements with two focal volumes. As an application, we demonstrate spatial cross-correlation measurements between the two detection volumes, which allow to measure calibration-free diffusion coefficients and direction-sensitive processes like molecular flow in microfluidic channels. FCS is furthermore applied to living zebrafish embryos, to investigate the concentration gradient of the morphogen fibroblast growth factor 8 (Fgf8). It is shown by one-focus APD-based and two-focus EMCCD-based FCS, that Fgf8 propagates largely by random diffusion through the extracellular space in developing tissue. The stable concentration gradient is shown to arise from the equilibrium between a local morphogen production and the sink function of the receiving cells by receptor-mediated removal from the extracellular space. The study shows the applicability of FCS to whole model organisms. Especially in such dynamically changing systems in vivo, the perspective of fast parallel FCS measurements is of great importance. In this work, we exemplify parallel, spatially resolved FCS by utilizing an EMCCD camera. The approach, however, can be easily adapted to any other class of two-dimensional array detector. Novel generations of array detectors might become available in the near future, so that multiplexed spatial FCS could then emerge as a standard extension to classical one-focus FCS. / Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) ist eine hochempfindliche optische Methode, um die dynamischen Eigenschaften eines Ensembles von einzelnen, fluoreszierenden Molekülen in Lösung zu erforschen. Sie ist insbesondere geeignet für Messungen in biologischen Proben. Die hohe Empfindlichkeit wird erreicht durch Verwendung konfokaler Mikroskop-Aufbauten mit beugungsbegrenztem Detektionsvolumen, und durch Messung der Fluoreszenz mit Einzelphotonen-empfindlichen Detektoren, zum Beispiel Avalanche-Photodioden (APD). Dadurch wird das Fluoreszenzsignal allerdings nur von einer einzelnen Fokusposition in der Probe eingesammelt, und mehrfache Messungen an verschiedenen Positionen in der Probe müssen nacheinander durchgeführt werden. Um die zeitaufwendigen, aufeinanderfolgenden FCS-Einzelmessungen zu überwinden, entwickeln wir in dieser Arbeit Elektronenvervielfachungs-CCD (EMCCD) Kamera-basierte räumlich aufgelöste Detektion für FCS. Mit dieser neuartigen Detektionsmethode werden Multiplex-FCS Messungen möglich. Darauf abzielend führen wir FCS Messungen mit zwei Detektionsvolumina durch. Als Anwendung nutzen wir die räumliche Kreuzkorrelation zwischen dem Signal beider Fokalvolumina. Sie ermöglicht die kalibrationsfreie Bestimmung von Diffusionskoeffizienten und die Messung von gerichteter Bewegung, wie zum Beispiel laminarem Fluss in mikrostrukturierten Kanälen. FCS wird darüber hinaus angewendet auf Messungen in lebenden Zebrafischembryonen, um den Konzentrationsgradienten des Morphogens Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 (Fgf8) zu untersuchen. Mit Hilfe von APD-basierter ein-Fokus FCS und EMCCD-basierter zwei-Fokus FCS zeigen wir, dass Fgf8 hauptsächlich frei diffffundiert im extrazellulären Raum des sich entwickelnden Embryos. Der stabile Konzentrationsgradient entsteht durch ein Gleichgewicht von lokaler Morphogenproduktion und globalem Morphogenabbau durch Rezeptor vermittelte Entfernung aus dem extrazellulären Raum. Die Studie zeigt die Anwendbarkeit von FCS in ganzen Modell-Organismen. Gerade in diesen sich dynamisch ändernden Systemen in vivo ist die Perspektive schneller, paralleler FCS-Messungen von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird räumlich aufgelöste FCS am Beispiel einer EMCCD Kamera durchgeführt. Die Herangehensweise ist jedoch einfach übertragbar auf jede andere Art von zwei-dimensionalem Flächendetektor. Neuartige Flächendetektoren könnten in naher Zukunft verfügbar sein. Dann könnte räumlich aufgelöste Multiplex-FCS eine standardisierte Erweiterung zur klassischen ein-Fokus FCS werden.

Polypyrimidine-tract binding protein 1 (PTBP1) is an important cellular regulator of messenger RNAs influencing the alternative splicing profile of a cell as well as its mRNA stability, location and translation. In addition, it is diverted by some viruses to facilitate their replication. Here, we used a novel PTBP1 knockout mouse to analyse the tissue expression pattern of PTBP1 as well as the effect of its complete removal during development. We found evidence of strong PTBP1 expression in embryonic stem cells and throughout embryonic development, especially in the developing brain and spinal cord, the olfactory and auditory systems, the heart, the liver, the kidney, the brown fat and cartilage primordia. This widespread distribution points towards a role of PTBP1 during embryonic development. Homozygous offspring, identified by PCR and immunofluorescence, were able to implant but were arrested or retarded in growth. At day 7.5 of embryonic development (E7.5) the null mutants were about 5x smaller than the control littermates and the gap in body size widened with time. At mid-gestation, all homozygous embryos were resorbed/degraded. No homozygous mice were genotyped at E12 and the age of weaning. Embryos lacking PTBP1 did not display differentiation into the 3 germ layers and cavitation of the epiblast, which are hallmarks of gastrulation. In addition, homozygous mutants displayed malformed ectoplacental cones and yolk sacs, both early supportive structure of the embryo proper. We conclude that PTBP1 is not required for the earliest isovolumetric divisions and differentiation steps of the zygote up to the formation of the blastocyst. However, further post-implantation development requires PTBP1 and stalls in homozygous null animals with a phenotype of dramatically reduced size and aberration in embryonic and extra-embryonic structures.

Maintenance of apico-basal polarity is essential for epithelial integrity and requires particular reinforcement during tissue morphogenesis, when cells are reorganised, undergo shape changes and remodel their junctions. It is well established that epithelial integrity during morphogenetic processes depends on the dynamic exchange of adherens junction components, but our knowledge on the dynamics of other proteins and their dynamics during these processes is still limited. The early Drosophila embryo is an ideal system to study membrane dynamics during morphogenesis. Here, morphogenetic activities differ along the anterior-posterior axis, with the extending germband showing a high degree of epithelial remodelling. We developed a Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) assay with a higher temporal resolution, which allowed the distinction between a fast and a slow component of recovery of membrane proteins during the germband extension stage. We show for the first time that the recovery kinetics of a general membrane marker, SpiderGFP, differs in the anterior and posterior parts of the embryo, which correlates well with the different morphogenetic activities of the respective embryonic regions. Interestingly, absence of crumbs, a polarity regulator essential for epithelial integrity in the Drosophila embryo, decreases the fast component of SpiderGFP and of the apical marker Stranded at Second-Venus specifically in the anterior region. We suggest that the defects in kinetics observed in crumbs mutant embryos are the first signs of tissue instability in this region, explaining the earlier breakdown of the head epidermis in comparison to that of the trunk, and that diffusion in the plasma membrane is affected by the absence of Crumbs.

Maintenance of apico-basal polarity is essential for epithelial integrity and requires particular reinforcement during tissue morphogenesis, when cells are reorganised, undergo shape changes and remodel their junctions. It is well established that epithelial integrity during morphogenetic processes depends on the dynamic exchange of adherens junction components, but our knowledge on the dynamics of other proteins and their dynamics during these processes is still limited. The early Drosophila embryo is an ideal system to study membrane dynamics during morphogenesis. Here, morphogenetic activities differ along the anterior-posterior axis, with the extending germband showing a high degree of epithelial remodelling. We developed a Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) assay with a higher temporal resolution, which allowed the distinction between a fast and a slow component of recovery of membrane proteins during the germband extension stage. We show for the first time that the recovery kinetics of a general membrane marker, SpiderGFP, differs in the anterior and posterior parts of the embryo, which correlates well with the different morphogenetic activities of the respective embryonic regions. Interestingly, absence of crumbs, a polarity regulator essential for epithelial integrity in the Drosophila embryo, decreases the fast component of SpiderGFP and of the apical marker Stranded at Second-Venus specifically in the anterior region. We suggest that the defects in kinetics observed in crumbs mutant embryos are the first signs of tissue instability in this region, explaining the earlier breakdown of the head epidermis in comparison to that of the trunk, and that diffusion in the plasma membrane is affected by the absence of Crumbs.

Techniques for conditional gene or protein expression are important tools in developmental biology and in the analysis of physiology and disease. On the protein level, the tunable and reversible expression of proteins can be achieved by the fusion of the protein of interest to a destabilizing domain (DD). In the absence of its specific ligand (Shield-1), the protein is degraded by the proteasome. The DD-Shield system has proven to be an excellent tool to regulate the expression of proteins of interests in mammalian systems but has not been applied in teleosts like the medaka. We present the application of the DD-Shield technique in transgenic medaka and show the ubiquitous conditional expression throughout life. Shield-1 administration to the water leads to concentration-dependent induction of a YFP reporter gene in various organs and in spermatogonia at the cellular level.

Techniques for conditional gene or protein expression are important tools in developmental biology and in the analysis of physiology and disease. On the protein level, the tunable and reversible expression of proteins can be achieved by the fusion of the protein of interest to a destabilizing domain (DD). In the absence of its specific ligand (Shield-1), the protein is degraded by the proteasome. The DD-Shield system has proven to be an excellent tool to regulate the expression of proteins of interests in mammalian systems but has not been applied in teleosts like the medaka. We present the application of the DD-Shield technique in transgenic medaka and show the ubiquitous conditional expression throughout life. Shield-1 administration to the water leads to concentration-dependent induction of a YFP reporter gene in various organs and in spermatogonia at the cellular level.