Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le mélanome est le plus agressif et le plus sévère des cancers cutanés du fait de son fort potentiel métastatique. Pourtant à ce jour, aucun biomarqueur pour la détection précoce du mélanome n'est unanimement reconnu. Notre groupe a récemment démontré que le métabolisme du céramide est fortement altéré dès les premiers stades de la maladie, conduisant à l'augmentation de la production d'un dérivé du céramide, la sphingosine 1-phosphate (S1P). La S1P est sécrétée par les cellules du mélanome et a été identifiée comme une molécule majeure du remodelage du microenvironnement tumoral, qui favorise la progression du cancer. De façon physiologique, la S1P circulante se trouve majoritairement sous forme liée aux protéines de haute densité (HDLs), aux protéines de basse et très basse densité (LDLs et VLDLs) ainsi qu'à l'albumine. Les cellules de mélanome pourraient produire de la S1P non liée qui pourrait rendre compte des effets produits par ce lysosphopholipide sur les cellules du microenvironnement tumoral suite à sa fixation sur les récepteurs S1PR présents à la surface des cellules stromales. Ainsi, cette forme libre de S1P pourrait représenter un nouveau biomarqueur pour la détection précoce du mélanome. Cependant, il n'existe à l'heure actuelle aucun moyen permettant de la quantifier. Le but de ce travail interdisciplinaire a été de développer un nouveau capteur basé sur un polymère à empreintes moléculaires (MIP) dans le but de quantifier la S1P libre dans le sang de patients atteints de mélanome. Cette étude a été réalisée entre l'équipe " Ingénierie pour les sciences du vivant (ELiA) " du Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes (LAAS), et l'équipe " Sphingolipides, métabolisme, mort cellulaire et progression tumorale " du Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (CRCT), en étroite collaboration avec l'équipe " Biomimétisme et structures bioinspirées " de l'Université Technologique de Compiègne (UTC). Dans un premier temps, nous avons synthétisé un nouveau MIP dirigé contre la S1P par une méthode de thermopolymérisation en masse. Nous avons caractérisé puis optimisé ce MIP en effectuant des mesures de spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide et des mesures de spectroscopie de fluorescence. Le MIP a été comparé à un NIP (Non Imprinted Polymer) et exposé à des analogues de la S1P afin d'évaluer sa sélectivité. Dans un second temps, en vue de l'utilisation d'un MIP en tant que couche sensible d'un futur capteur et pour anticiper son immobilisation et sa structuration sur le transducteur, nous avons mis au point un nouveau MIP photopolymérisable en 2D. Ce MIP a d'abord été structuré en motifs par photolithographie sur des surfaces de silicium puis validé par des mesures de microscopie de fluorescence. Le MIP a également été structuré sous la forme de couches minces sur les surfaces actives de capteurs de Microbalance à Cristal de Quartz (QCM) dans le but de le valider par cette méthode sans marquage. Enfin, nous avons exploré l'utilisation d'une fibre optique recouverte d'une couche de MIP photopolymérisé dans le but de détecter, par spectroscopie infrarouge, la liaison de la S1P avec le MIP à la surface de la fibre. / Melanoma is the most aggressive and severe form of cutaneous cancer due to its high metastatic potential. However, to date, no marker for the early detection of melanoma has been unanimously accepted. Our group has demonstrated that ceramide metabolism is strongly altered in melanoma, leading to the overproduction of sphingosine 1-phosphate (S1P), one of its derivatives. S1P is secreted by melanoma cells and has been identified as a critical molecule of tumor microenvironment remodeling that supports cancer progression. Physiologically, circulating S1P is predominantly linked to high density lipoproteins (HDLs), low and very low density lipoproteins (LDLs and VLDLs), as well as albumin. Melanoma cells produce unbound S1P that could be responsible for the effects induced by this lysophospholipid on the tumor microenvironment, as a result of its binding to S1PR receptors present on the surface of stromal cells. Thus, secreted tumor S1P could represent a new biomarker for the early detection of melanoma. However, there are currently no means to quantify it. The goal of this interdisciplinary work was to develop a new sensor based on a Molecularly Imprinted Polymer (MIP) in order to quantify unbound S1P present in the blood of melanoma patients. This study has been conducted between the "Engineering for Life science Applications (EliA)" group at the Laboratory for Analysis and Architecture of Systems (LAAS) and the "Sphingolipids, metabolism, cell death and tumor progression" group at the Cancer Research Center of Toulouse (CRCT), in strong collaboration with the team "Biomimetism and Bioinspired Structures" of the University of Technology of Compiègne (UTC). First, we synthesized a new MIP against S1P employing a bulk thermopolymerization approach. The resulting MIP was characterized and optimized by performing both mass spectrometry and fluorescence spectroscopy measurements. It was compared to a Non Imprinted Polymer (NIP) and exposed to S1P analogues to assess its selectivity. Second, in order to use the MIP as the sensitive layer of a future sensor and prepare its immobilization and structuration onto a transducer, we synthesized a new surface photopolymerizable MIP. This MIP was first structured by photolithography onto silicon substrates and validated by fluorescence microscopy measurements. The MIP was also structured as a thin layer onto Quartz Crystal Microbalance (QCM) chips in order to validate its binding capacities using this label-free method. Finally, the use of a MIP-coated optical fiber as an infrared sensor was explored, with the aim of detecting S1P in blood using Attenuated Total Reflectance (ATR) spectroscopy.

La protéine MC1 est une petite protéine structurale très abondante chez Methanosarcina thermophila (archaeabactérie). Nous avons utilisé la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) pour rechercher ses séquences préférentielles de fixation. Après 10 cycles de sélection, une séquence consensus avec une affinité 50 fois plus forte que celle pour une séquence aléatoire a été déterminée. Cette séquence a été étudiée par simulation de dynamique moléculaire. Le mode de fixation de MC1 sur l?ADN a ensuite été déterminé par des empreintes moléculaires (DMS, OH·). Les résultats montrent une fixation par une face et dans le petit sillon de l?ADN. Une reconnaissance par lecture indirecte des séquences est probable. L?oxydation de certains acides aminés (Trp, Met) par les rayons gamma entraîne une modification des propriétés de la protéine : perte de la reconnaissance de structures et séquences particulières et diminution de sa capacité à courber l?ADN.

La connaissance du microbiote du lait est importante pour contrôler la qualité microbiologique du lait. Le but de cette étude était d'évaluer la diversité et la dynamique de la communauté microbienne de laits traités et non traités entreposés à basse température par les méthodes d'empreintes moléculaires telles que la banque de clones d'ADNr 16S, la PCR quantitative (qPCR), le polymorphisme des longueurs des fragments de restriction terminaux (T-RFLP) et l'électrophorèse sur gel de gradient dénaturant (DGGE). Des laits crus (UT) ont été traités par addition de gaz carbonique (CO₂), thermisation (TH) ou microfiltration (MF) et ont été entreposés à 4 °C et à 8 °C pendant 7 jours. Les banques de clones ont permis de déterminer la composition de la population bactérienne des laits. Les deux unités taxonomiques opérationnelles (UTOs) les plus abondantes dans la banque de clones appartenaient aux classes Gammaproteobacteria et Bacilli. Les genres bactériens dominants dans les laits traités (UT, CO₂ et TH) ont été affiliés à Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Aerococcus, Facklamia, Corynebacterium, Acinetobacter et Trichococcus. Les bactéries dominantes dans les laits microfiltrés étaient associées à Stenotrophomonas maltophilia et Delftia acidovorans tandis que Staphylococcus aureus dominait dans les laits thermisés. La qPCR a été utilisée pour quantifier les bactéries dominantes dans les laits traités. Pseudomonas fluorescens dominait la population bactérienne dans les laits UT et CO₂ entreposés pendant 7 jours tandis que Streptococcus uberis dominait dans les laits CO₂ entreposés à 8 °C Les profils de PCR-DGGE ont démontré l'effet des traitements (TH, CO₂ et MF) sur les bactéries dominantes des laits traités. Les profils de T-RFLP ont démontré que l'abondance et la diversité de la communauté bactérienne a été affectée par les traitements. Le T-RFLP a démontré la dynamique des bactéries spécifiques dans les laits traités. Ces bactéries pourraient être ainsi utilisées comme marqueur dans les laits traités. Le T-RFLP a une résolution plus élevée que la PCR-DGGE lors de l'analyse des laits traités. Cette étude montre que des bactéries spécifiques peuvent se développer pendant l'entreposage à basse température des laits traités. Les objectifs fixés dans cette étude ont été atteints avec succès en employant des méthodes moléculaires. Ce projet a ainsi mis en évidence le potentiel des méthodes moléculaires dans l'analyse de la population microbienne du lait.

La protéine MC1 est une petite protéine structurale très abondante chez Methanosarcina thermophila (archaeabactérie). Nous avons utilisé la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) pour rechercher ses séquences préférentielles de fixation. Après 10 cycles de sélection, une séquence consensus avec une affinité 50 fois plus forte que celle pour une séquence aléatoire a été déterminée. Cette séquence a été étudiée par simulation de dynamique moléculaire. Le mode de fixation de MC1 sur l'ADN a ensuite été déterminé par des empreintes moléculaires (DMS, OH·). Les résultats montrent une fixation par une face et dans le petit sillon de l'ADN. Une reconnaissance par lecture indirecte des séquences est probable. L'oxydation de certains acides aminés (Trp, Met) par les rayons gamma entraîne une modification des propriétés de la protéine : perte de la reconnaissance de structures et séquences particulières et diminution de sa capacité à courber l'ADN.

Ce mémoire reporte les études menées sur des polymères à empreintes moléculaires (MIP) en extraction solide-liquide (SPE). L'influence de différents facteurs (nature des interactions polymère-analyte, composition de la matrice de l'échantillon, polarité des solvants d'extraction) sur la sélectivité et la capacité des MIPs est étudiée. <br />La première application révèle l'influence des liaisons hydrogène lors de l'extraction d'un échantillon organique sur un MIP préparé à partir d'acide méthacrylique (MAA). Des expériences de réactivité croisée réalisées sur des molécules analogues à la molécule empreinte (triterpène) montrent l'impact de la nature et de la position des groupes fonctionnels sur la spécificité de reconnaissance des analytes par le MIP. La capacité d'une cartouche SPE est évaluée à partir d'une solution standard puis d'un extrait végétal avec des solvants de lavage adaptés à la matrice. <br />Les interactions polymère-analyte sont ensuite étudiées dans une matrice aqueuse saline. Deux MIPs respectivement préparés à partir de MAA et de MAA-styrène, avec le clomiphène comme molécule empreinte, sont caractérisés par les isothermes de Freundlich puis appliqués à la préconcentration du tamoxifène, molécule hydrophobe et basique contenue dans des urines hydrolysées et dopées. Les liaisons hydrogène, ioniques et hydrophobes intervenant dans la rétention des analytes sont étudiées par des équilibres d'adsorption et par SPE. La percolation de l'urine sur un support hydrophobe en préalable de la SPE-MIP, ou directement sur un MIP à caractère hydrophobe renforcé (MAA-styrène) entraîne une augmentation des rendements d'extraction avec un nombre d'étapes de lavage réduit.

‘Jardin de Granville’ ‘est une variété de rose moderne dédiée à des applications cosmétiques en lien avec ses propriétés intéressantes permettant de lutter contre les mécanismes inflammatoires et oxydants au niveau cutané. L’objectif principal de cette thèse a consisté à établir la cartographie moléculaire de ‘Jardin de Granville’. Pour cela, un procédé standardisé de récolte et d’extraction a été développé afin d’accéder au contenu moléculaire le plus exhaustif possible des différents organes de la plante. Des méthodes complémentaires d’analyse, allant de l’HPTLC, à l’HPLC-DAD-DEDL et jusqu’à l’UHPLC-HRMS, ont été mises en oeuvre pour réaliser les empreintes chromatographiques des extraits et en identifier les principaux constituants. Ces méthodes ont été choisies de plus en plus spécifiques et précises, de façon à apporter une graduation dans le niveau d’informations apportées. Plus de 120 molécules ont pu être caractérisées dans les différents extraits. Le deuxième objectif résidait dans la mise en évidence des marqueurs phytochimiques spécifiques à la variété en comparant ses empreintes moléculaires à celles des deux variétés parents. Deux méthodes de comparaison des profils ont été développées. La première met en jeu des analyses statistiques telles que l’ACP, la CAH et l’ANOVA qui permettent de comparer l’ensemble des extraits. La seconde effectue la soustraction des chromatogrammes d’extrait deux à deux et donne accès à un niveau d’informations plus ciblé. Ces deux approches ont conduit à l’identification de composés différenciant chaque type d’organes ce qui pourra servir d’outils dans la valorisation de certaines parties de la plante. Des marqueurs potentiels plus spécifiques à ‘Jardin de Granville’ ont pu être mis en évidence ce qui démontre la capacité des méthodes développées à différencier le contenu phytochimique de variétés de rose très proches. / The modern rose variety ‘Jardin de Granville’, possesses proven activities against skin cell inflammatory and oxidant mechanisms and is devoted to cosmetic applications. The main goal of this study was to establish the molecular fingerprint of the different organs of ‘Jardin de Granville’. In this way, a standardized process for plant harvesting and sample extraction was developed giving access to the most exhaustive molecular fingerprint possible of the different organs. Several complementary analytical methods were implemented through HPTLC, HPLC-DAD-ELSD and UHPLC-HRMS, enabling to achieve the chromatographic fingerprint of the different organs and to identify the main constituents. These methods were selected to have increasing specificity and accuracy to bring progressive information on the molecule structure. Thus, more than 120 compounds were characterized in the different extracts. The second objective consisted in identifying specific phytochemical markers of the variety by comparing its fingerprint to those obtained from its two rose plant parents. In this way, two approaches were developed. The first one involves statistical analysis like PCA, HAC and ANOVA and allows comparing the whole sample chromatograms. The second approach performs extract chromatogram subtractions two by two and gives more detailed information. Both comparative methods led to the identification of the differential compounds existing between the different organ types which could be used to valuate some plant parts in particular. Some ‘Jardin de Granville’ specific markers were highlighted showing the method capacity to distinguish very close rose varieties, by comparing their molecular content.

L'industrie cosmétique a un recours croissant aux espèces végétales comme sources de principesactifs naturels. Leur extraction nécessite des supports sélectifs tels que les polymères à empreintesmoléculaires (MIP). Les travaux de cette thèse reposent sur le développement de MIP pourl’extraction sélective de la glucosamine, de la fructosazine et de la 2,5-déoxyfructosazine.Dans une première partie, trois approches ont été développées pour extraire la glucosamine par desMIP : l’approche covalente, semi-covalente et non covalente. Pour chacune, les différents paramètresintervenant dans la synthèse des MIP ont été optimisés. Les meilleurs résultats ont été obtenus avecun MIP synthétisé selon une approche non covalente ionique reposant sur la complexation de laglucosamine par un acide sulfonique. Les performances du MIP se sont avérées supérieures à cellesde supports commerciaux et des extractions à partir de végétaux ont été réalisées. Le potentielindustrialisable du MIP a été validé lors de premiers tests à plus grande échelle.Dans une deuxième partie, l’extraction simultanée de la fructosazine et de la 2,5-déoxyfructosazine aété réalisée suite au développement d’un MIP synthétisé selon une approche covalente reposant surla formation d’esters boroniques. Une méthode de synthèse originale est exposée puisque lestemplates ont été formés in situ lors de la polymérisation. Le MIP obtenu s’est avéré sélectif dechaque composé et a permis de purifier et de séparer la fructosazine et la 2,5-déoxyfructosazine dematrices végétales et alimentaires.Tous ces travaux ont été réalisés dans une démarche éco-responsable s’appuyant sur l’emploi desolvants aqueux lors de la polymérisation et de l’extraction. / The cosmetic industry uses plants as sources of natural active ingredients. The extraction of theseactive ingredients requires selective extraction method such as molecularly imprinted polymers (MIP)technique. This thesis describes the development of MIP for the selective extraction of glucosamine,fructosazine and 2,5-déoxyfructosazine.In the first part, three approaches were developed to extract glucosamine by MIP technique: thecovalent approach, semi-covalent and noncovalent. For each approach, the various parametersinvolved in the synthesis of the MIP were optimized. The best results were obtained with a MIPsynthesized with a non-covalent ionic approach based on the complexation of glucosamine by asulfonic acid. The MIP exhibits higher performance than commercial media and extractions fromplants were performed. The potential for industrialization of the MIP was validated during initial testson a larger scale.In the second part, the simultaneous extraction of fructosazine and 2,5-déoxyfructosazine wasperformed following the development of a MIP synthesized using a covalent approach based on theformation of boronic esters. An original synthesis method is exposed since the templates were formedin situ during the polymerization. The MIP obtained showed good selectivity for each compound andallowed to separate and purify fructosazine and 2,5-déoxyfructosazine from plant and food matrices.All these works were performed according to an eco-friendly approach based on the use of aqueoussolvents as solvents for polymerization and extraction.

Ce mémoire présente une exploration des polymères à empreintes moléculaires (MIP) comme outils d’une libération contrôlée de bioactifs olfactifs ou pour le criblage/préselection de composés à activité antivirales ou anti-tumorales sur le site actif d’une enzyme. La première partie est une étude de la complexation de la vanilline sur des billes polymériques sphériques en vue d’une libération contrôlée (pH, salinité, …). Ces études portent sur les caractéristiques de l'absorption et la libération de la molécule d'intérêt dans le milieu aqueux sur les microsphères fonctionnalisées fourni par Merck ESTAPOR® Microsphères. Nous avons ensuite synthétisé divers MIP de vanilline au format monolithique. Plusieurs stratégies d’impression ont été étudiées: non covalente, covalente et semi-covalente. La composition du MIP préparé dans chaque approche a été optimisée pour obtenir les meilleures propriétés et performances. L'affinité, la sélectivité et la capacité du MIP ont été déterminées. Les MIPs ont été évalués par extraction en phase solide (SPE) d'analogues structuraux de la vanilline dans des échantillons naturels (extrait de vanille, vin). La deuxième partie de ce mémoire concerne l’évaluation de MIPs de l’adénosine 5’-monophosphate (AMP) Le polymère a été préparé par une approche non-covalente et son efficacité de recapture a été caractérisée par analyse frontale (FA). L’analyse frontale est une technique qui permet de discriminer des interactions spécifiques des non spécifiques et de comprendre les mécanismes de liaison dans des cavités spécifiques. / This thesis report presents the exploration of molecularly imprinted polymers (MIP) for the application in controlled release and targeting antivirus and anticancer drugs. The first part of this study describes the imprinting of vanillin as a monolith. Several strategies were studied: non-covalent, covalent and semi-covalent. The composition of the MIP prepared in each approach was optimized to obtain the best properties and performance. The affinity, selectivity and capacity of MIP were determined. MIPs were evaluated in solid-phase extraction (SPE) of structural analogues in natural samples (vanilla extract, wine). We also present the study of the exploration of spherical beads as potential tools for the controlled release of vanillin. These studies concern the characteristics of uptake and release of the molecule of interest in the aqueous medium on functionalised microspheres supplied by Merck ESTAPOR Microspheres®. The second part of this thesis is devoted to studies on the evaluation of MIP of adenosine 5'-monophosphate (AMP). The polymer was prepared in non-covalent approach and efficiency of binding was characterised using frontal analysis (FA). FA is a useful technique that allows discriminate specific and nonspecific interactions and to understand the binding mechanisms in specific cavities.