A esclerose múltipla é uma doença inflamatória crônica desencadeada por células T autorreativas contra antígenos proteicos da mielina. A encefalomielite experimental autoimune é o modelo murino mais utilizado para o estudo da EM. As tubas uterinas e o útero de camundongos fêmeas são órgãos ricos em células mesenquimais que são pouco utilizadas em estudos. Dessa forma, no presente projeto, caracterizamos a obtenção dessa população e avaliamos sua capacidade imunossupressora utilizando o modelo de EAE. Observamos que o tratamento é capaz de modular o perfil de linfócitos T CD4+ durante sua ativação nos linfonodos, induzindo o direcionamento para a subpopulação Tr1 e atenuando as Th1 e Th17. Assim, houve uma diminuição do número de células infiltrantes no SNC associado a uma menor ativação de células da microglia. Em conjunto, demostraramos que as meMSC utilizadas como tratamento são capazes de atrasar o desenvolvimento da EAE e, portanto, evidenciando o caráter imunomodulador das MSCs derivadas do endométrio, chamando a atenção para seu potencial terapêutico. / Multiple sclerosis is a chronic inflammatory disease triggered by autoreactive T cells against myelin protein. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis is the most commonly used murine model for the study of MS. The uterine tubes and uterus of female mice are organs rich in mesenchymal cells which are rarely used. Thus, in the present work, we characterized the extraction of this population and evaluated its immunosuppressive capacity using the EAE model. We observed that the meMSC treatment is capable of modulating the CD4 T lymphocyte profile during its activation in the lymph nodes, inducing the expansion of the Tr1 subpopulation and attenuating Th1 and Th17. Consequently, there was a decrease in the number of infiltrating cells in the CNS associated with a reduction of microglial activation. Taken together, our results demonstrated that the meMSCs used as treatment are capable of delaying the development of EAE, therefore, evidencing its immunomodulatory features drawing attention to its therapeutic potential.

A esclerose múltipla é uma doença inflamatória crônica desencadeada por células T autorreativas contra antígenos proteicos da mielina. A encefalomielite experimental autoimune é o modelo murino mais utilizado para o estudo da EM. As tubas uterinas e o útero de camundongos fêmeas são órgãos ricos em células mesenquimais que são pouco utilizadas em estudos. Dessa forma, no presente projeto, caracterizamos a obtenção dessa população e avaliamos sua capacidade imunossupressora utilizando o modelo de EAE. Observamos que o tratamento é capaz de modular o perfil de linfócitos T CD4+ durante sua ativação nos linfonodos, induzindo o direcionamento para a subpopulação Tr1 e atenuando as Th1 e Th17. Assim, houve uma diminuição do número de células infiltrantes no SNC associado a uma menor ativação de células da microglia. Em conjunto, demostraramos que as meMSC utilizadas como tratamento são capazes de atrasar o desenvolvimento da EAE e, portanto, evidenciando o caráter imunomodulador das MSCs derivadas do endométrio, chamando a atenção para seu potencial terapêutico. / Multiple sclerosis is a chronic inflammatory disease triggered by autoreactive T cells against myelin protein. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis is the most commonly used murine model for the study of MS. The uterine tubes and uterus of female mice are organs rich in mesenchymal cells which are rarely used. Thus, in the present work, we characterized the extraction of this population and evaluated its immunosuppressive capacity using the EAE model. We observed that the meMSC treatment is capable of modulating the CD4 T lymphocyte profile during its activation in the lymph nodes, inducing the expansion of the Tr1 subpopulation and attenuating Th1 and Th17. Consequently, there was a decrease in the number of infiltrating cells in the CNS associated with a reduction of microglial activation. Taken together, our results demonstrated that the meMSCs used as treatment are capable of delaying the development of EAE, therefore, evidencing its immunomodulatory features drawing attention to its therapeutic potential.

As células T exercem papel crucial nas respostas imunes adaptativas e em doenças autoimunes, como a esclerose múltipla. O glutamato, neurotransmissor mais abundante no SNC, age por meio de duas famílias de receptores: metabotrópico e ionotrópico. As células T são alvo do glutamato durante a ativação e apresentação de antígenos, pois está presente nas sinapses imunológicas, porém, pouco se sabe a respeito de seu papel na função das células T. Nós estudamos o papel do NMDAR nas respostas mediadas por células T. In vitro, o uso do antagonista MK801 reduziu a linfoproliferação e a síntese de IFN-γ e IL-17A, bem com o NMDA reduziu a proliferação e produção de IFN-γ e IL-17A. In vivo, o MK801 reduziu a gravidade da EAE, resultado da menor infiltração de linfócitos Th1 e Th17 no SNC. Além disso, o MK801 reduziu a expressão de Rorc, Il17a, Stat4, Ccr4, Ccr6 e Ifna2 no SNC. Em suma, esses dados confirmam que o NMDAR exerce papel nas funções mediadas por células T, indicando que as células T são alvos do excesso do glutamato via NMDAR em doenças neuroinflamatórias. / T cells play a crucial role in adaptive immune responses and autoimmune diseases, such as multiple sclerosis. Glutamate is the most abundant neurotransmitter in the CNS, and it acts through two receptor families: metabotropic and ionotropic. T cells are target of glutamate during activation and antigen presentation, because glutamate is also present in the immunological synapses, however, little is known about its role on T cell functions. We investigated the role of NMDAR in immune-mediated T cell responses. In vitro, the use of the antagonist MK801 reduced T cell proliferation and cytokine production (IFN-γ e IL-17A), as well as NMDA reduced lymphocyte proliferation and IFN-γ e IL-17A production, in a dose dependent manner. In vivo, MK801 diminished severity of EAE, result of the minor Th1 and Th17 infiltration in the CNS. In addition, MK801 reduced Rorc, Il17a, Stat4, Ccr4, Ccr6 and Ifna2 expression in the CNS. In short, our data confirm that the NMDAR play a role in T cell-mediated functions, indicating that T cells are target of glutamate excess via NMDAR in neuroinflammatory diseases.

As células T exercem papel crucial nas respostas imunes adaptativas e em doenças autoimunes, como a esclerose múltipla. O glutamato, neurotransmissor mais abundante no SNC, age por meio de duas famílias de receptores: metabotrópico e ionotrópico. As células T são alvo do glutamato durante a ativação e apresentação de antígenos, pois está presente nas sinapses imunológicas, porém, pouco se sabe a respeito de seu papel na função das células T. Nós estudamos o papel do NMDAR nas respostas mediadas por células T. In vitro, o uso do antagonista MK801 reduziu a linfoproliferação e a síntese de IFN-γ e IL-17A, bem com o NMDA reduziu a proliferação e produção de IFN-γ e IL-17A. In vivo, o MK801 reduziu a gravidade da EAE, resultado da menor infiltração de linfócitos Th1 e Th17 no SNC. Além disso, o MK801 reduziu a expressão de Rorc, Il17a, Stat4, Ccr4, Ccr6 e Ifna2 no SNC. Em suma, esses dados confirmam que o NMDAR exerce papel nas funções mediadas por células T, indicando que as células T são alvos do excesso do glutamato via NMDAR em doenças neuroinflamatórias. / T cells play a crucial role in adaptive immune responses and autoimmune diseases, such as multiple sclerosis. Glutamate is the most abundant neurotransmitter in the CNS, and it acts through two receptor families: metabotropic and ionotropic. T cells are target of glutamate during activation and antigen presentation, because glutamate is also present in the immunological synapses, however, little is known about its role on T cell functions. We investigated the role of NMDAR in immune-mediated T cell responses. In vitro, the use of the antagonist MK801 reduced T cell proliferation and cytokine production (IFN-γ e IL-17A), as well as NMDA reduced lymphocyte proliferation and IFN-γ e IL-17A production, in a dose dependent manner. In vivo, MK801 diminished severity of EAE, result of the minor Th1 and Th17 infiltration in the CNS. In addition, MK801 reduced Rorc, Il17a, Stat4, Ccr4, Ccr6 and Ifna2 expression in the CNS. In short, our data confirm that the NMDAR play a role in T cell-mediated functions, indicating that T cells are target of glutamate excess via NMDAR in neuroinflammatory diseases.

Introdução: Esclerose múltipla (EM) é uma doença desmielinizante e inflamatória do sistema nervoso central. Seu diagnóstico é clínico, auxiliado pela imagem de ressonância magnética, mas essa imagem não diferencia processos de inflamação e desmielinização. A tomografia por emissão de pósitrons (PET), usando radiofármacos específicos, pode ser uma ferramenta para diferenciar esses processos. O radiofármaco [11C]PK11195 se liga na proteína translocadora 18 kDa (TSPO) presente nas mitocôndrias das células gliais. O radiofármaco [11C]PIB é utilizado para detecção de placa Beta-amiloide, mas tem sido utilizado também na análise do conteúdo de mielina. Esta nova aplicação foi fundamentada na captação deste radiofármaco em substância branca. A utilização em conjunto destes dois radiofármacos pode diferenciar processos de neuroinflamação, desmielinização e remielização através da imagem PET. Objetivo: O objetivo deste trabalho é validar o uso dos radiofármacos [11C]PK11195 e [11C]PIB para estudo pré-clínico para a quantificação de neuroinflamação e quantidade de mielina, respectivamente, na progressão da doença de modelos animais de esclerose múltipla, modelo de roedores, e em seguida realizar análise de lesões em substância cinzenta e substância branca em modelo de primatas não humanos. Material e Métodos Projeto aprovado pelo comitê de ética (UNIFESP 2628300415 e FMUSP 25/15 e 0556/15). O modelo de lisolecitina em ratos (Wistar, machos) foi induzido pela injeção estereotáxica de lisolecitina 1% em dois locais do estriado direito (2 + 2 microL) e no corpo caloso (3 microL). As imagens de PET com [11C]PK11195 e [11C]PIB foram adquiridas nos tempos basal, 3 dias, 1 semana e 4 semanas após a administração estereotáxica. O modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) em saguis foi induzido por injeção de glicoproteína da mielina do oligodendrócito (MOG) emulsionada em Adjuvante Incompleto de Freund (IFA) ou em Adjuvante Completo de Freund (CFA). As imagens de PET foram adquiridas antes da imunização (basal) e ± 100 dias após a imunização (final). O tecido cerebral foi utilizado para análise imuno-histológica. Resultados: No modelo de lisolecitina em rato foi observado um aumento na captação de [11C]PK11145 no corpo caloso, 25 % (P = 0,002) e no estriado, 24 % (P < 0,05) uma semana após a imunização comparando com a imagem basal. Com o [11C]PIB não foram observadas diferenças significativas. No modelo de EAE em saguis, induzido com MOG/IFA, foi possível observar uma redução significativa da captação de [11C]PIB nas regiões do esplênio do corpo caloso direito de 38,17 % (P = 0,0365), globo pálido direito, 22,75 %, (P = 0,0355), núcleo caudado direito, 29,36 % (P = 0,0284) e córtex cingulado, 18,99 % (P = 0,0453), enquanto para o grupo MOG/CFA foi observada uma redução significativa para a região do córtex motor esquerdo, 9,51 % (P = 0,0083). Com o [11C]PK11195 foi observada uma redução significativa na captação do radiofármacos na imagem intermediária do grupo MOG/IFA comparada com a captação basal nas regiões do córtex somatossensorial direito, 22,8 % (P = 0,0041), córtex de associação direito, 18,98 % (P = 0,0228), córtex subpial direito, 23,37 % (P = 0,0006) e região do núcleo caudado inferior esquerdo, 18,97 % (P = 0,0233). Nos ensaios post mortem realizados com os ratos foi possível observar na imuno-histoquímica uma correlação, entre micróglia ativada (Iba-1) e [11C]PK11195, tanto no corpo caloso como no estriado. Para os saguis foi observado correlação entre [11C]PK11195 e Iba-1 e esta não foi observada para o [11C]PK11195 e GFAP. Na histologia, foi observada uma correlação entre os dados da imagem de [11C]PIB e a técnica de luxol fast blue. Conclusão: A imagem PET com [11C]PK11195 e [11C]PIB foi eficiente para as quantificações de neuroinflamação e mielina, respectivamente, na progressão da doença dos modelos animais (roedor e primata não humano) da EM / Introduction: Multiple sclerosis (MS) is a demyelinating and inflammatory disease of the central nervous system. Its diagnosis is clinical, helped by magnetic resonance imaging, but this image modality does not differentiate between inflammation and demyelination. Positron Emission Tomography (PET), using specific radiopharmaceuticals, can be a tool to differentiate these processes. The radiopharmaceutical [11C]PK11195 binds to the translocator protein 18 kDa (TSPO) present in the mitochondria of glial cells. [11C]PIB is a radiopharmaceutical used for detection of Beta-amyloid plaques, but has also been used in the analysis of myelin content. This new application was based on the white matter uptake of this radiopharmaceutical. The use of these two radiopharmaceuticals together can differentiate processes of neuroinflammation, demyelination and remyelination by the PET imaging. Objective: The objective of this work is to validate the use of tracers [11C]PK11195 and [11C]PIB for preclinical study for the qualification of neuroinflammation and amount of myelin, respectively, in the disease progression of animal models of multiple sclerosis, rodent model, and then perform analysis of grey matter and white matter lesions in non-human primate model. Material and Methods: Project approved by the ethics committee (UNIFESP 2628300415 and FMUSP 25/15 and 0556/15). The rat lysolecithin model (Wistar, male) was induced by stereotactic injection of lysolecithin 1% at two sites of the right striatum (2 + 2 microL) and in the corpus callosum (3 microL). PET images with [11C]PK11195 and [11C]PIB were acquired at baseline, 3 days, 1 week and 4 weeks after stereotactic injection. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model in marmosets was induced by injection of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) emulsified in Incomplete Freund\'s Adjuvant (IFA) or Complete Freund\'s Adjuvant (CFA). PET images were acquired prior to immunization (baseline) and ± 100 days after immunization (end of experiment). Brain tissue was used for immunohistochemical analysis. Results: In the rat lysolecithin model, an increase in [11C]PK11145 uptake of 25% (P = 0.002) was observed in the corpus callosum and 24% (P < 0.05) in the striatum, one week after immunization compared to the baseline image. The IFA/MOG and CFA/MOG groups showed clinical signs in 100% of the animals. The comparison between baseline and symptoms time points showed in the CFA/MOG group a significant 11C-PIB uptake reduction only in the left motor cortex, 9.5 % (P = 0.0083). For the IFA/MOG group, a significant decrease in 11C-PIB uptake was observed in the splenium of corpus callosum, 38.4 % (P = 0.0365), globus pallidus, 22.9 % (P = 0.0355) and tail of caudate nucleus, 28.9 % (P = 0.0284), being these 3 regions in the right brain hemisphere, and also in the cingulate cortex (midline above corpus callosum), 19.5 % (P = 0.0453). 11C-PK11195 uptake was significantly decreased in IFA/MOG group in the intermediary time point in the right somatosensorial cortex, 22.08 % (P = 0.0041), right association cortex, 18.98 % (P = 0.0228), right subpial cortex, 23.37 % (P = 0.0006) and left tail of caudate nucleus, 18.97 % (P = 0.0233). In the post mortem analysis performed with rat tissue, a weak correlation between activated microglia (Iba-1) and [11C]PK11195 uptake was observed both in the corpus callosum and in the striatum. For the marmosets we observed correlation between [11C]PK11195 and Iba-1 but we didn\'t observed between [11C]PK11195 and GFAP. In histology, we observed correlation between [11C]PIB and luxol fast blue. Conclusion: The PET images with [11C]PK11195 and [11C]PIB were efficient for quantifying neuroinflammation and myelin content, respectively, in the disease progression of animal models (rodent and nonhuman primate) of MS